Ingegnerizzazione di batteri lattici al fine della sovraespressione di un peptide con attività antibatterica (batteriocina AS-48)

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1 UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI PARMA FACOLTA' DI AGRARIA CORSO DI LAUREA IN SCIENZE E TECNOLOGIE ALIMENTARI Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare Ingegnerizzazione di batteri lattici al fine della sovraespressione di un peptide con attività antibatterica (batteriocina AS-48) Relatori: Prof. RODOLFO BERNI Dott.ssa CLAUDIA FOLLI Co-relatore: Dott.ssa ILEANA RAMAZZINA Laureanda: MICHELA CIANFANO Anno Accademico 2002/2003

2 INGEGNERIZZAZIONE DI BATTERI LATTICI AL FINE DELLA SOVRAESPRESSIONE DI UN PEPTIDE CON ATTIVITÀ ANTIBATTERICA (BATTERIOCINA AS-48) Laureanda: Michela Cianfano Relatori: Prof. Rodolfo Berni, Dott.ssa Claudia Folli Co-relatore: Dott.ssa Ileana Ramazzina Introduzione Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare. Università di Parma. I batteri lattici ricoprono un ruolo importante nell industria alimentare grazie alla loro capacità fermentativa e alle possibili favorevoli proprietà organolettiche apportate agli alimenti fermentati e ad una possibile attività probiotica. All azione combinata di piccole molecole organiche con attività antimicrobica di tipo non specifico da essi prodotte durante i processi fermentativi 1 (ad es: acidi lattico, acetico e propionico) è in parte attribuita la maggiore conservabilità di alimenti sottoposti a maturazione. Attività antimicrobica specifica è invece svolta da molecole di natura polipeptidica, come le batteriocine, che sono prodotti primari o modificati della sintesi ribosomiale batterica. Questi inibitori agiscono generalmente inducendo alterazioni delle membrane plasmatiche delle cellule batteriche bersaglio 2. L interesse per le batteriocine è legato all attività nei confronti di batteri alterativi e/o patogeni, e anche alla loro capacità di conferire al ceppo produttore un vantaggio competitivo all interno del prodotto alimentare. La sola batteriocina finora in uso al fine della protezione degli alimenti è la nisina, che è prodotta naturalmente da alcuni ceppi di Lactococcus Lactis. Tuttavia il suo impiego è limitato in quanto possiede bassa attività a ph neutro e alcalino. L isolamento di nuove batteriocine è quindi perseguito in numerosi laboratori. Al fine della sovraespressione della batteriocina AS-48 da parte di L. lactis e di E. faecium 7C5 (ceppo naturalmente produttore), ci siamo rivolti al sistema di espressione Nisin Controlled Expression (NICE). Questo sistema si basa sull utilizzo di plasmidi contenenti il promotore del gene della nisina nisa, che è inducibile da nisina extracellulare per mezzo di un sistema regolativo a due componenti (nisr e nisk) 3. L impiego della batteriocina AS-48 può essere importante nell industria lattiero-casearia per la sua attività contro Listeria monocytogenes e Clostridium spp. Scopo della tesi Nella prospettiva di un possibile futuro impiego biotecnologico della batteriocina AS-48, che possiede elevata termostabilità e resistenza alle proteasi batteriche, diventa interessante la possibilità di sviluppare sistemi per modificare geneticamente batteri lattici. E infatti ipotizzabile il loro impiego come starter nelle fermentazioni industriali e/o per la produzione di molecole proteiche con attività antibiotica potenzialmente utili nei confronti di batteri alterativi

3 e/o patogeni contaminanti gli alimenti 4. Questo lavoro di tesi ha avuto come obiettivo la messa a punto di metodologie ricombinanti al fine di ottenenere batteri lattici ingegnerizzati in grado di sfruttare il sistema genico inducibile da nisina NICE (Figura 1) per la sovraespressione della batteriocina AS-48. NISINA Induzione NISK NISR P nisk nisr AS-48 PnisA as-48 Figura 1. Rappresentazione schematica del sistema di espressione NICE inducibile da nisina utilizzato per i batteri: nisk, un recettore con attivita istidina-chinasica, e nisr, un attivatore trascrizionale, sono implicati nella trasduzione del segnale; PnisA e il promotore che viene attivato da nisr al fine dell espressione dell inserto codificante per AS-48. Materiali e Metodi Ingegnerizzazione dei ceppi L. lactis NZ9800 e L. lactis MG1363 ed utilizzo del sistema NICE. Sono state valutate per entrambi i ceppi, mediante prove di crescita, la resistenza alla nisina e all AS-48. Il ceppo L. lactis MG1363 è stato trasformato con il plasmidio pnz8037-as-48l, portante il gene strutturale codificante per la batteriocina e quello codificante per il promotore PnisA, e il plasmidio pnz9530 che trasporta i geni regolatori nisr e nisk del sistema di espressione NICE. Il ceppo NZ9800 invece è stato trasformato con il plasmidio pnz8037-as- 48L in quanto contenente il plasmidio pnz9530. Le avvenute trasformazioni sono state verificate mediante PCR sfruttando primer appositamente sintetizzati e il DNA plasmidico estratto dai ceppi come templato. Sono state condotte prove di induzione con c oncentrazioni di nisina, non inibenti la crescita dei batteri, pari a 1-2 ìg/ml per il ceppo L. lactis MG1363 e concentrazioni di ìg/ml per il ceppo L. lactis NZ9800. Aliquote delle colture indotte prelevate a diversi tempi di induzione ( ore) sono state valutate per la crescita batterica (assorbanza apparente a 600nm). Quindi i precipitati delle 6 aliquote sono stati separati dai terreni mediante centrifugazione e lisati meccanicamente con l impiego di biglie di vetro. I surnatanti ed i terreni concentrati e non concentrati sono stati poi analizzati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti (SDS-PAGE). Con i campioni del lisato cellulare solubile ed insolubile e con i terreni di crescita, opportunamente filtrati e

4 portati a ph 7, si sono eseguiti saggi di inibizione di Listeria innocua (batterio indicatore) su piastra. Ingegnerizzazione del ceppo E. faecium 7C5 ed utilizzo del sistema NICE. Il ceppo 7C5 di E. faecium è naturalmente produttore della batteriocina, in quanto contiene nel plasmidio costitutivo ppd1 tutto l apparato necessario per l espressione e il corretto processamento dell AS-48. E stata valutata la resistenza alla nisina del ceppo e si è proseguito con la trasformazione dell enterococco con il plasmidio ricombinante pnz8037-as-48l e il plasmidio pnz9530. L avvenuta trasformazione è stata verificata mediante PCR touch-down sfruttando primer appositamente sintetizzati e il DNA plasmidico estratto dal ceppo come templato. Sono state condotte prove di induzione con concentrazioni di nisina pari a ìg/ml sull enterococco ingegnerizzato contenente e non contenente il plasmidio ppd1. Aliquote delle colture indotte prelevate a diversi tempi di induzione ( ore) sono state valutate per la crescita batterica. I campioni del lisato cellulare e i terreni concentrati e non concentrati delle 5 aliquote sono stati preparati come descritto in precedenza per i ceppi di lattococchi e analizzati mediante SDS-PAGE. Con i terreni di crescita si sono eseguiti saggi di inibizione di Listeria innocua su piastra. Risultati e discussione Ingegnerizzazione dei ceppi L. lactis MG1363, L. lactis NZ9800 e valutazione dell espressione eterologa della batteriocina AS-48. Mediante PCR è stata verificata la presenza nei ceppi di lattococco trasformati del plasmidio pnz9530 e del plasmidio ricombinante pnz8037-as48l. Si sono utilizzati primer specifici, progettati sulla base delle sequenze nucleotidiche codificanti per i geni nisr, nisk e per il gene strutturale dell AS-48. Mediante analisi elettroforetica degli ampliconi su gel di agarosio si è dimostrata l avvenuta trasformazione dei due ceppi ingegnerizzati con i due plasmidi. Il sistema di espressione prescelto è inducibile da nisina a basse concentrazioni 5. Per riuscire a sfruttare questo sistema di espressione è necessario comunque disporre di un ceppo resistente all AS-48 e alla nisina. Utilizzando il saggio dell attività antibatterica della nisina nei confronti di L. lactis, si è trovato per il ceppo MG1363 che a concentrazioni inferiori a 8 ìg/ml di nisina la crescita non è inibita significativamente. Il ceppo di L. lactis NZ9800 invece si è mostrato resistente alla nisina a concentrazioni superiori a 200 ìg/ml; questo ceppo, infatti, possiede il cluster genico della nisina a livello cromosomico e, pur presentando una delezione di 4 paia di basi nel gene strutturale nisa (che comporta la perdita della capacità di produrre nisina), conserva la propria immunità naturale. I sistemi di espressione eterologa oggi in uso permettono di ottenere proteine ricombinanti con rese di circa 1 mg/l; si è quindi deciso di valutare la resistenza di L. lactis in presenza di batteriocina AS-48 pura fino a

5 tale concentrazione. L. lactis si è dimostrato resistente a concentrazioni di AS-48 superiori ad 1 mg/l. Per verificare la sovraespressione della batteriocina mediante il sistema NICE applicato, sono state condotte prove di espressione come descritto in Materiali e Metodi. Dall analisi SDS-PAGE dei campioni del lisato cellulare non si è riscontrata la presenza di alcuna banda riconducibile alla forma lineare della batteriocina (105 residui amminoacidici, PM di 11076). L analisi mediante SDS-PAGE effettuata per i terreni di crescita concentrati, non ha rivelato alcuna banda corrispondente alla batteriocina matura dopo secrezione (70 residui amminoacidici, PM di 7167). Infine, non è stata trovata attività antibatterica verso Listeria innocua sia per i terreni che per i campioni del lisato cellulare solubile ed insolubile. Da questi dati si può dedurre che il peptide AS-48 o non viene espresso dall'apparato trascrizionale dei ceppi di L. lactis presi in esame o si origina come forma labile che viene degradata dagli enzimi intracellulari batterici o viene espresso in quantità non rilevabili con questi metodi d indagine e comunque in forma non attiva. Ingegnerizzazione del ceppo E. faecium 7C5 e valutazione dell espressione della batteriocina AS-48. Mediante PCR è stata verificata la presenza nel ceppo di E. faecium 7C5 dei plasmidi ppd1 (che è naturalmente presente e contiene il cluster genico della batteriocina AS-48), pnz9530 e pnz8037-as48l. Per la verifica della presenza di ppd1 sono state impiegate due coppie di primer in grado di amplificare i geni as-48d e orf6 localizzati su tale plasmidio. Mediante analisi elettroforetica degli ampliconi su gel di agarosio è stato dimostrato l ottenimento di due differenti ceppi di E. faecium 7C5 ingegnerizzato: E. faecium 7C5 contenente i plasmidi pnz9530, pnz8037-as-48l e ppd1; E. faecium 7C5 contenente i plasmidi pnz9530, pnz8037-as-48l e privo del plasmidio naturale ppd1 (che probabilmente non è stato trattenuto dalle cellule batteriche nella fase di elettroporazione). Poiché il ceppo 7C5 di E. faecium è immune in modo naturale all AS-48, in quanto ne è il ceppo naturale produttore, esso rappresenta un possibile ottimo candidato per la super-produzione della batteriocina AS-48 tramite il sistema NICE. Al fine di poter utilizzare le cellule di E. faecium, ne è stata verificata la resistenza alla nisina fino a concentrazioni di 120 ìg/ml. Sono state condotte prove di espressione come descritto in Materiali e Metodi su ceppi di E. faecium 7C5 ingegnerizzato contenente e non contenente il plasmidio costitutivo ppd1. L E. faecium ingegnerizzato contenente ppd1 dopo induzione con nisina ìg/ml ha mostrato una curva di crescita meno ripida rispetto a quella del ceppo non indotto. La crescita di E. faecium ingegnerizzato non contenente il plasmidio ppd1 si è dimostrata particolarmente lenta, con tempi di duplicazione pressochè doppi rispetto al ceppo contenente il plasmidio; inoltre la nisina ha manifestato attività battericida nei confronti di questo ceppo a concentrazioni uguali a quelle

6 necessarie per l induzione. E quindi possibile ipotizzare che il plasmidio ppd1 sia essenziale per la crescita batterica, forse perché contenente, oltre al cluster dell AS-48, anche altri geni necessari per una normale crescita batterica. Dall analisi SDS-PAGE dei lisati cellulari, derivanti dalla crescita del ceppo contenente ppd1 e di quello privo del plasmidio, non è stato possibile identificare alcuna banda riconducibile alla forma lineare della batteriocina. Anche l analisi SDS-PAGE dei terreni del ceppo contenente il plasmidio ppd1 non ha rivelato in modo chiaro la presenza di bande attribuibili alla batteriocina in forma matura (circolare) secreta nel mezzo di coltura. Occorre tuttavia considerare che la banda elettroforetica di AS-48 pura risulta evidente solo se la batteriocina circolare è presente ad alta concentrazione; inoltre, la sua mobilità elettroforetica appare simile a quella di una proteina lineare con peso molecolare di circa 3000 (Figura 2). M 1 M 2 M Figura 2. Analisi elettroforetica in gel denaturante (SDS-PAGE) dei terreni di crescita di E. faecium ingegnerizzato dopo induzione con nisina ad una concentrazione di 50 ìg/ml. M1: â-2 microglobulina (PM 11000). M2: CRBP I (PM 15000). M3: batteriocina pura AS-48. Lane 1: non indotto. Lane : campioni indotti a diversi tempi ( ore). L analisi dell attività antibatterica dei terreni ottenuti da E. faecium ingegnerizzato senza il plasmidio ppd1 non ha rivelato inibizione di Listeria innocua. Invece saggi di inibizione su piastra per i terreni di E. faecium ingegnerizzato contenente il plasmidio ppd1 hanno rivelato la comparsa di aloni, dopo induzione con diverse concentrazioni di nisina ( ìg/ml). Gli aloni di inibizione sono risultati più grandi alle concentrazioni più alte di nisina impiegata come inducente e comunque maggiori rispetto a quelli ottenibili con E. faecium wild type (Figura 3). Come conferma di una maggiore produzione di batteriocina grazie al sistema NICE è stato effettuato un ulteriore saggio di inibizione, in cui singole colonie di E. faecium wild type e di E. faecium ingegnerizzato sono state trasferite su piastre dove era coltivato il ceppo indicatore Listeria innocua (Figura 4). Anche in questo caso gli aloni di inibizione per il ceppo ingegnerizzato sono risultati maggiori di quelli prodotti dal ceppo wild type.

7 . A B C D Figura 3. Saggio di inibizione di Listeria innocua sui terreni ottenuti dalla crescita di E. faecium wild type (A)e di E. faecium ingegnerizzato con nisina 20 ìg/ml (B), con nisina 50 ìg/ml (C), con nisina 100 ìg/ml (D).. A B Figura 4. Saggio di inibizione di Listeria innocua da parte di singole colonie di E faecium wild type (A) e di E. faecium ingegnerizzato in presenza di nisina come inducente (B). Conclusioni In questo lavoro di tesi si è dimostrato come sia indispensabile, al fine della espressione della batteriocina AS-48, la presenza del cluster genico della batteriocina in un batterio lattico utilizzato per l espressione. Infatti, L. lactis trasformato non si e dimostrato in grado di esprimere la batteriocina AS-48 ne in forma lineare inattiva ne in forma circolare attiva. Al contrario, la presenza del corredo di proteine ed enzimi associati alla maturazione, immunità e secrezione della batteriocina nel caso di E. faecium 7C5 ingegnerizzato ha reso possibile l ottenimento della batteriocina in quantità maggiore rispetto a quella prodotta naturalmente. Tuttavia, è stata osservata una bassa resa e una certa instabilità nella produzione di AS-48 da parte di E. faecium 7C5 ingegnerizzato. Si sta ora procedendo alla valutazione quantitativa della produzione della batteriocina ricombinante e alla individuazione delle condizioni più adatte al fine di una sua produzione più elevata e più stabile.

8 1 Caplice, E., Fitzgerald, G.F Food fermentation: role of microorganism in food production and preservation. Int. J. Food Microbiol. 50(1-2), Abee, T., Krockel, L., Hill, C., Bacteriocins: modes of action and potentials in food preservation and control of food poisoning. Int. J. Food Microbiol. 28, Kuipers, O.P., de Ruyter, P.G.G.A., Kleerebezem, M., De Vos, W.M., Controlled overproduction of proteins by lactic acid bacteria. Tibtech April Henrich, B., Klein, J.R., Weber, B., Delorme, C., Renault, P., Wegmann, U Foog-grade delyvery system for controlled gene expression in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 68(11), De Ruyter, P.G.G.A., Kuipers, O.P., De Vos, W.M Controlled gene expression systems for Lactococcus lactis with the food-grade inducer nisin. Appl. Environ. Microbiol. 62(10), Eichenbaum, Z., Federle, M.J. Marra, D., De Vos, W.M., Kuipers, O.P., Kleerebezem, M., Scott, J.R Use of the Lactococcal nisa promoter to regulate gene expression in Gram-positive bacteria: comparison of induction level and promoter strength. Appl. Environ. Microbiol. 64(8),