LE INFEZIONI FUNGINE INVASIVE: Recenti progressi nella diagnostica microbiologica

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1 LE INFEZIONI FUNGINE INVASIVE: Recenti progressi nella diagnostica microbiologica Fabio Arena Dip. Biotecnologie Mediche Università di Siena

2 Time (days) Sorveglianza Turn Around Time (Maggio 2015) Candidemie 5 Laboratori italiani medio-grandi membri GLIPaC TAT 350 emocolture monomicrobiche, esclusi CoNS 3 78 H H 30 H 0 Check-Pos Pos-Gram Pos-IDM Pos/IDM Pos-ID Pos-ASTM Pos-ATBM Pos-AST POS-ATB Arena et al. accepted

3 Bassetti M. Intensive Care Med 2014 Bouza E. Int J Antimicrob Agent 2009 The real challenge of candidemia High mortality rates 50-70% Difficulties in the diagnosis

4 Test supplementari esame colturale β-d-glucan (mannan, anti-mannan) Test molecolari PCR, PCR-ESI/MS T2 magnetic resonance

5 PCR-ESI/MS -No step colturale -TAT 6H S Strenghts W Weaknesses -Costo elevato -Apparecchiatura ingombrante -Studi clinici deludenti Sensibilità O Opportunities T Threats -ampio pannello di germi riconosciuti -Inibitori -basse cariche

6 Diagnosis: non cultural methods PCR-ESI/MS More than 750 bacterial and fungal species Time to results < 6 h (1/2 H hands-on time) Limit of detection 16 CFU/mL Ecker DJ et al. Nat Rev Microbiol 2008

7 PCR-ESI/MS evaluation from positive blood culture 19.1% FN N. campione Standard Iridica Genere Specie Genere Specie Concordanza 1016 Candida albicans Escherichia coli No 2037 Staphylococcus aureus Negative. Negative PCR 2049 Staphylococcus aureus Escherichia coli No 2052 Streptococcus oralis Finegoldia magna No 3011 Acinetobacter baumannii Escherichia coli No 4026 Enterobacter cloacae Klebsiella pneumoniae No 5040 Escherichia coli Negative. Negative PCR 5050 Enterococcus faecalis Negative. Negative PCR 5063 Clostridium paraputrificium Negative. Negative PCR 6070 Enterococcus faecium Negative. Negative PCR 7010 Streptococcus pyogenes Negative. Negative PCR 8001 Listeria monocytogenes Negative. Negative PCR 8038 Pseudomonas aeruginosa Candida albicans No Vincent et al. Crit Care Med 2015

8 PCR-ESI/MS evaluation from positive blood culture 19 FN 43% Sensibilità

9 T2 Magnetic resonance -No step colturale -TAT <5H S Strenghts W Weaknesses -Costo elevato - dedicato per candidemia O Opportunities T Threats -limitata esperienza clinica -presenza inibitori

10 Neely LA et al. Sci Trasl Med 2013 T2 Magnetic resonance/nanoparticle 5 Candida species Time to results < 5 h

11 T2 Magnetic resonance/nanoparticle centers -Comparison with conventional Blood culture with clinical and spiked samples Spiked samples sensitivity (n.250): 92.3% C. albicans/c. tropicalis 94.2% C. parapsilosis 88.1% C. krusei/ C. glabrata Limit of detection: 1 CFU/mL C. tropicalis/c. krusei 2 CFU/mL C. albicans/c. glabrata 3 CFU/mL C. parapsilosis Mylonakis et al. CID 2015

12 T2 Magnetic resonance/nanoparticle 12% invalid results...inibitors 31 discordant cases (1.7% of the total) 2 positive for BC only 29 positive for T2 only

13 Molecular diagnosis from positive blood culture Yeast identification from positive blood culture bottle MALDI-TOF PNA-FISH Nested PCR microarray Spanu T. J Clin Microbiol 2012 Stone NR. J Clin Microbiol 2013 Poritz MA. PlosOne 2011

14 Relevance of fungal identification Specie Fenotipo C. krusei resistente a fluconazolo C. rugosa, C. norvegensis, C. lipolytica, C. valida, C. inconspicua, C. zeylanoides C. guilliermondii, C, metapsilosis, C. parapsilosis, C. fermentati ridotta sensibilità agli azoli ridotta sensibilità alle echinocandine C. lusitaniae ridotta sensibilità all amfotericina B A. lentulus, A. pseudofisheri e A. fumigatiaffinis A. lentulus e A. fumigatiaffinis, A. terreus resistenti agli azoli resistenti all amfotericina B A. calidioustus resistenza intrinseca agli azoli ed a caspofungina A. niger può manifestare resistenza acquisita agli azoli

15 Esame colturale -Test di sensibilià -Costo ridotto S Strenghts W Weaknesses -TAT >48 H -bassa sensibilità - isolato per successivi studi O Opportunities T Threats -problemi intepretativi

16 Candida species from blood culture 2015 Candida krusei (Issatchenkia orientalis) n.1 Candida tropicalis n.1 Candida parapsilosis n.9 Candida glabrata n.7 Candida albicans n.32

17 AST Candida from blood culture 2015 Fluconazole n. isolates MIC Range % Susceptible C. albicans 31 <= C. parapsilosis C. glabrata 3 >128 0 C. tropicalis Micafungin n. isolates MIC Range % Susceptible C. albicans 32 <= C. parapsilosis C. glabrata C. krusei C. tropicalis

18 Eun-Jung Cho et al. J. Antimicrob. Chemother MDR Candida glabrata Emergence of multiple resistance profiles involving azoles, echinocandins and amphotericin B in Candida glabrata isolates from a neutropenia patient with prolonged fungaemia.

19 MDR Candida glabrata - Pz. donna - 76 aa - ricoverata in istituto di riabilitazione - portatrice CVC - C. glabrata da sangue periferico Antifungals Amfotericina B Anidulafungina Caspofungina Micafungina Fluconazolo MIC mg/l(s/i/r) S 1 R 0.75 R 0.5 R >256 R - Saggio di sensibilità con Gradient diffusion - Interpretazione EUCAST Agosto 2016

20 AST problemi interpretativi Siopi et al. J. Clin. Microbiol. 2015

21 Formazione biofilm Paired blood cultures A TTP cut-off of 30 h was 100% sensitive and 51.4% specific for catheter-related candidaemia N. Høiby et al. CMI 2014

22 Conclusioni Candidemia pone probelmi diagnostici e terapeutici esame colturale, (1,3)-β-D-glucan, e test di identificazione rapida da emocoltura test consolidati (MALDI-TOF, PNA- FISH e MOLECOLARI rapidi) Nuovi diagnostici direttamente da sangue, T2 risonanza magnetica promettente ma poca esperienza clinica Resistenze in Candida glabrata Test di sensibilità adeguati Standardizzazione tecnica per rilevazione biofilm