Nuove speranze per cuori infranti: le cellule staminali e la terapia cellulare dell infarto cardiaco

Transcript

1 Nuove speranze per cuori infranti: le cellule staminali e la terapia cellulare dell infarto cardiaco Dr. Serena Zacchigna Laboratorio di Medicina Molecolare International Center for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB), Trieste zacchign@icgeb.org Cosa può succedere ad un cuore che venga improvvisamente privato della metà delle sue cellule come, ad esempio, nel corso di un infarto acuto dovuto all improvvisa occlusione di un arteria coronaria? Sorprendentemente, non esiste un unica risposta a questa domanda, in quanto la capacità rigenerativa del miocardio appare estremamente eterogenea nelle diverse specie animali. Infatti, mentre alcuni pesci e anfibi sono in grado di tollerare ampie resezioni di tessuto cardiaco, rigenerando l intero organo in pochi giorni, l uomo, così come la maggior parte dei mammiferi, non possiede una simile capacità. Per questo motivo, gli esiti di un infarto cardiaco sono quai sempre irreversibili, conseguenti alla perdita definitiva di massa e funzionalità del miocardio. Nonostante i recenti progressi in termini di prevenzione e diagnosi precoce della cardiopatia ischemica, gli eventi infartuali continuano a rappresentare un problema socio-sanitario maggiore nei paesi occidentali, verosimilmente destinato ad aggravarsi nei prossimi decenni, parallelamente all allungamento della vita media; infatti, le attuali terapie mediche e chirurgiche, pur riuscendo a controllare l estensione del danno ischemico e l insorgenza di complicanze a breve termine, non sono in grado di impedire l inesorabile evoluzione verso la fase dello scompenso cardiaco. Per tutte queste ragioni, esiste un grande interesse collettivo nel definire una valida strategia per promuovere la rigenerazione cardiaca. Purtroppo, le cellule del muscolo cardiaco - i cardiomiociti nell uomo sembrano essere incapaci di duplicarsi immediatamente fin da dopo la nascita, entrando in uno stato irreversibile di quiescenza. Solo recentemente questo assioma è stato messo in discussione dall osservazione che un particolare ceppo di topi detiente una certa capacità di rigenerare il tessuto cardiaco in seguito ad un danno, e che almeno sei geni contribuiscono alla comparsa di questo fenotipo complesso 1. Sulla base di questi presupposti, diversi autori hanno riscontrato la presenza di mitosi a carico dei cardiomiociti di diverse specie, compreso l uomo, anche se rimangono comunque notevoli perplessità sull entità e sulla rilevanza funzionale di questo fenomeno. Come stimolore quindi la rigenerazione cardiaca? Un approccio particolarmente promettente sotto diversi punti di vista prevede l utilizzo delle cellule staminali. Nonostante l importanza che i mezzi di comunicazione di massa 1

2 riservano all argomento, manca spesso una chiara percezione di cosa sia una cellula staminale, probabilmente perchè, con il progredire delle conoscenze, diventa sempre più arduo trovare una definizione rigorosa e soddisfacente, in cui riassumere sinteticamente le diverse proprietà associate a queste cellule. Tuttavia, in un tentativo di massima semplificazione, possiamo ragionevolmente affermare che una cellula staminale è una cellula del tutto indifferenziata, capace di proliferare per tempi indefiniti, in grado di dare origine a cellule esattamente identiche a sè stessa (self renewal) e contemporaneamente ad una progenie di tipi cellulari variamente differenziati. Tradizionalmente il concetto di staminalità è stato da sempre associato all embrione, che per definizione è formato da cellule ancora indifferenziate, destinate a proliferare enormemente e a generare una molteplicità di tipi cellulari distinti. In realtà, oggi questa visione della staminalità limitata alle cellule dell embrione appare alquanto restrittiva, in quanto ci stiamo convincendo che molti tessuti degli organismi adulti contengono una o più popolazioni di cellule per molti aspetti simili alle cellule staminali dell embrione, e che pertanto vengono chiamate cellule staminali dell adulto. In questa rassegna verranno prese in considerazione la basi concettuali della biologia delle cellule staminali dell embrione e dell adulto, con particolare riferimento alle nuove prospettive aperte dalla clonazione animale ed alla possibilità di implementare nuovi approcci terapeutici per indurre la rigenerazione cardiaca. Le cellule staminali embrionali L embrione è una struttura del tutto particolare, in quanto formato da un numero esiguo di cellule, che però hanno in sè un vastissimo potenziale di differenziamento, essendo in grado di generare un intero organismo, composto da più di 200 tipi cellulari. In base a questa proprietà le cellule staminali embrionali vengono definite totipotenti. In realtà, già nelle prime fasi del suo sviluppo, l embrione è una struttura tutt altro che omogenea: infatti, già pochi giorni dopo la fecondazione si riconoscono chiaramente tre foglietti (definiti rispettivamente ectoderma, mesoderma ed endoderma), che rappresentano un primo epifenomeno del differenziamento cellulare che caratterizzerà le fasi successive dell embriogenesi. In pratica, da ciascuno dei tre foglietti potrà originare un numero ampio ma limitato di tipi cellulari differenti: ad esempio una cellula che si localizza a livello di ectoderma potrà generare una progenie di cellule epiteliali, neurali o pigmentate, ma non sarà mai in grado di dare origine a cellule del sangue o del muscolo, che invece sono di derivazione mesodermica (Figura 1). Questo concetto, definito generalmente lineage restriction, per il quale nel corso dello sviluppo le cellule vedono progressivamente restringere il proprio potenziale differenziativo, ha da sempre rappresentato un dogma centrale nella biologia dello sviluppo, anche se, come vedremo più avanti, esso è stato recentemente messo in discussione da una serie di sorprendenti evidenze sperimentali. La storia delle cellule staminali embrionali nasce dallo studio dei teratocarcinomi, bizzarri tumori delle gonadi estremamente eterogenei, in cui è possibile riconoscere una popolazione di cellule indifferenziate, che costituisce la vera componente tumorale, e da una serie di strutture in differenti stadi di differenziamento appartenenti a tutti e tre i foglietti embrionali (classici esempi sono tubuli di epitelio intestinale, rosette di neuroepitelio, tessuto osseo, cartilagine, muscolo scheletrico e strutture tubulari frammiste a capillari similglomerulari identici a quelli riscontrabili in un rene in via di sviluppo) 2. 2

3 È proprio dall osservazione che le cellule di teratocarcinoma sono in grado di dare origine ad una serie così vasta di tipi cellulari differenziati e di diversa origine embrionale, che negli anni 70 è nata l idea di un loro possibile utilizzo a scopo terapeutico; ovviamente le maggiori perplessità in questo senso scaturivano dalla natura tumorale di queste cellule, spesso caratterizzate da un notevole grado di aneuploidia. Solo recentemente, le prospettive si sono notevolmente allargate, in seguito all osservazione che i teratocarcinomi possono essere generati sperimentalmente inoculando un embrione murino in via di formazione nel tessuto sottocutaneo di un topo adulto; con questa procedura è infatti possibile indurre la crescita di tumori molto simili ai teratocarcinomi che spontaneamente si formano a livello gonadico. Le cellule di questi tumori possono essere successivamente dissociate ed inoculate in un altro embrione in via di sviluppo dando origine ad una chimera, cioè ad un animale fisiologicamente sano, i cui tessuti derivano in parte dalle cellule di teratocarcinoma ed in parte dalle cellule dell embrione ospite che ha subito l inoculazione 3 (Figura 2). Sulla base di questi sorprendenti risultati, è sorta immediatamente l idea di evitare la fase di tumorigenesi, prelevando le cellule direttamente dall embrione; nel 1981 è stata così derivata la prima linea di cellule staminali embrionali (cellule ES) murine, che si sono dimostrate capaci di proliferare indefinitamente, mantenendo un cariotipo normale e conservando la pluripotenza 4. In particolare, le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna della struttura che l embrione forma al 5 giorno di sviluppo, la blastocisti; in questa fase l embrione è infatti formato da uno strato cellulare esterno, chiamato trofoectoderma, che delimita una cavità fluida detta blastocele, e da un agglomerato di cellule, da cui originerà l embrione vero e proprio (Figura 2). 3

4 A causa delle problematiche associate alla sperimentazione sugli embrioni umani, la prima linea di cellule ES di origine umana è stata ottenuta solo nel 1998, partendo da un processo di fecondazione in vitro 5. Durante questo processo, l embriogenesi si sviluppa con una sequenza di eventi cronologicamente ben definita: al giorno 3 corrisponde infatti lo stadio di morula, composta da 8 cellule che iniziano ad attivare un proprio programma di espressione genica, mentre al giorno 5 corrisponde lo stadio di blastocisti, descritta in precedenza, che rappresenta la struttura fisiologicamente deputata all impianto nella parete uterina e dalla quale sono state ricavate le cellule ES umane. Analogamente alla controparte murina, anche le cellule ES umane hanno rivelato una sorprendente capacità proliferativa in coltura, mantenendosi euploidi cioè con un numero corretto di cromosomi, e pluripotenti. L unico requisito a tutt oggi imprescindibile per poter allestire delle colture di cellule ES in laboratorio è la disponibilità di un monostrato di cellule nutrici (feeder) particolare, classicamente composto da fibroblasti quiescenti, sopra il quale seminare le cellule ES. È interessante notare come, nonostante molteplici tentativi, sia stato finora possibile allestire colture a lungo termine di cellule ES solo da tre specie animali: il topo, la scimmia e l uomo. Sempre nel 1998, il gruppo di Gearhart è riuscito ad isolare un altra linea cellulare, derivata dai precursori delle cellule germinali (GPC) che si trovano nelle gonadi fetali, per molti aspetti simile alla linea di cellule ES 6 (Figura 2). Anche queste cellule infatti, chiamate cellule germinali embrionali (CGE), sono pluripotenti, cioè capaci di dare origine ad una serie di tipi cellulari appartenenti a tutti e tre i foglietti embrionali, presentano un cariotipo normale, ed esprimono un set di marcatori comuni alle cellule ES e indicativi di staminalità. Tuttavia presentano almeno due caratteristiche sostanziali che le contraddistinguono dalle cellule ES: in primo luogo possiedono un potenziale proliferativo ampio ma limitato (80 duplicazioni per le EGC, più di 450 per le ESC), e secondariamente non sono tumorigeniche in vivo. 4

5 Da quanto detto sinora, emerge chiaramente che la caratteristica fondamentale delle cellule staminali è la pluripotenza, che tuttavia ha sempre rappresentato una proprietà estremamente complessa da studiare in laboratorio. A tutt oggi esistono principalmente tre approcci per dimostrare la pluripotenza di una cellula: i) l inoculazione in un embrione in via di formazione con l intento di generare una chimera; ii) l iniezione in sede ectopica, di solito nel sottocutaneo o a livello della capsula renale, al fine di documentare la formazione di un teratoma; iii) l allestimento di una coltura a lungo termine e la successiva esposizione a diversi fattori di differenziamento. È ovvio che quest ultimo approccio, estremamente allettante per la semplicità e la riproducibilità dei risultati, rappresenta una condizione artificiale, che genera molte perplessità sulla liceità con cui i risultati ottenuti in coltura possano essere traslati in vivo; e tuttavia si tratta anche dell unica strategia attualmente perseguibile per lo studio delle cellule ES umane, in quanto sarebbe impensabile la generazione sperimentale di chimere o teratomi nell uomo. Inoltre, la coltura è anche un prezioso sistema per l identificazione dei meccanismi molecolari che sottendono al mantenimento della pluripotenza, così come al differenziamento. Ovviamente siamo ancora lontani dalla definizione esatta dei requisiti per indirizzare il differenziamento delle cellule ES, anche se recentemente sono stati compiuti notevoli progressi in tal senso. In linea generale, è sufficiente la rimozione del feeder e di alcuni fattri di crescita per indurre la crescita in sospensione delle cellule ES, e la loro aggregazione a formare particolari strutture, dette corpi embrionali (EB, embryoid bodies), estremamente simili ai teratomi, in quanto formati da cellule in diversi stadi di differenziamento e appartenenti a tutte tre le linee di sviluppo embrionale (ectoderma, mesoderma ed endoderma) 7. In questo senso, la scommessa dei prossimi anni sarà l individuazione delle molecole fattori di crescita, citochine, proteine di membrana, mediatori intracellulari capaci di indirizzare il differenziamento di una cellula staminale embrionale verso una determinata linea, potendo così ottenere grandi quantità di cellule variamente differenziate da utilizzare per la terapia cellulare di una serie di malattie croniche su base degenerativa, ed in particolare per indurre la rigenerazione del tessuto cardiaco. Qual è l attuale stato dell arte? Come prevedibile, tutti i tre tipi di linee cellulari di origine embrionale sono stati utilizzati per generare colture di cardiomiociti in vitro Nel contesto degli EB, i cardiomiociti sono infatti facilmente identificabili perchè iniziano a contrarsi spontaneamente dopo qualche giorno di coltura, formando particolari giunzioni intercellulari definite gap junctions ed assumono proprietà elettrofisiologiche e farmacologiche tipiche del tessuto miocardico 12. Inoltre, questo sistema sperimentale ha consentito di individuare una serie di fattori, tra cui HGF (Hepatocyte Growth Factor), EGF (Epidermal Growth Factor), bfgf (basic Fibroblast Growth Factor) e l acido retinoico, necessari al differenziamento in senso cardiomiocitario, che potrebbero rivelarsi di estrema utilità nell ottica di una futura terapia cellulare dell insufficienza cardiaca. Ovviamente, dovranno essere affrontati diversi problemi prima di pensare concretamente ad una transizione clinica, ed in particolare sarà necessario definire una strategia per purificare popolazioni cellulari specifiche, dimostrare che i cardiomiociti differenziati in coltura sono in grado di funzionare in vivo, escludere la possibilità che l uso di cellule di derivazione embrionale possa indurre la formazione di tumori, ed infine prevenire l eventuale rigetto delle cellule trapiantate. Nuove sorgenti di cellule staminali: la clonazione terapeutica 5

6 In realtà, nonostante le attraenti potenzialità sul piano terapeutico, la ricerca sulle cellule staminali embrionali è proseguita in sordina fino alla pubblicazione di due lavori sperimentali che hanno generato grande interesse e scalpore da parte dell opinione pubblica: da un lato la clonazione della pecora Dolly da parte del gruppo di Wilmut nel , dall altro la derivazione della prima linea di cellule staminali embrionali umane da parte del gruppo di Thomson nel Gli esperimenti di clonazione hanno infatti rappresentato la prima dimostrazione che il nucleo di una cellula somatica adulta, ormai giunta al termine del proprio programma di differenziamento, contiene ancora tutta l informazione genetica necessaria allo sviluppo di un intero organismo, e che è possibile azzerare tale programma, facendolo ripartire dall inizio. D altra parte, il lavoro di Thomson ha prospettato la disponibilità pressochè illimitata di cellule ES umane da coltivare e studiare per tempi indefiniti. L unione dei due concetti ha ha costituito il presupposto per la clonazione terapeutica, che si propone di impiegare la tecnica di trasferimento nucleare, utilizzata nella clonazione, per ottenere delle cellule staminali embrionali da utilizzare con finalità terapeutica. Questo possibile scenario appare particolarmente allettante per diverse patologie di tipo degenerativo, quali il diabete, la malattia di Alzheimer, il morbo di Parkinson, e soprattutto lo scompenso cardiaco. In tutte queste situazioni, la realizzazione di un approccio di rigenerazione tessutale apporterebbe enormi vantaggi. Prendiamo ad esempio il caso di un paziente reduce da un esteso infarto cardiaco: il nucleo di una sua cellula cutanea potrebbe essere utilizzato per generare un nuovo embrione mediante la tecnica del trasferimento nucleare; da tale embrione sarebbe poi possibile ricavare una coltura di cellule ES, tutte geneticamente identiche alle cellule del paziente donatore. A questo punto, le cellule in coltura potrebbero essere indotte a differenziarsi in cardiomiociti, da trapiantare al paziente cardiopatico per rigenerare il tessuto cardiaco. Il principale vantaggio associato all utilizzo di cellule ES sembra proprio derivare dalla possibilità di allestire delle colture a lungo termine, ottenendo cellule ancora indifferenziate e pluripotenti, che pertanto potrebbero rappresentare la popolazione ideale per il ripopolamento di una cicatrice infartuale già stabilizzata. La realizzabilità di un simile approccio è stata recentemente dimostrata da un interessante studio, in cui cellule staminali embrionali ricavate con la tecnica del trasferimento nucleare si sono dimostrate in grado formare nuovo tessuto cardiaco e capillari abitati da globluli rossi, anche quando iniettate a distanza di due settimane dall evento ischemico (e quindi in una fase di danno ormai irreversibile) 14. In particolare, pochi fibroblasti cutanei sono stati utilizzati per la clonazione di un embrione murino, dal cui fegato è stata selezionata una popolazione positiva per l antigene di staminalità c-kit; l importante rigenerazione cardiaca osservata in seguito all inoculazione di queste cellule rappresenta una chiara dimostrazione della potenziale utilità delle cellule staminali embrionali per la medicina cardiovascolare. In quest ottica, l impiego della procedura del trasferimento nucleare per la generazione di cellule staminali appare particolarmente attraente dal punto di vista terapeutico, in quanto consentirebbe di disporre di cellule geneticamente identiche a quelle del ricevente, e quindi incapaci di scatenare una risposta di rigetto. Ovviamente, importanti perplessità riguardano la generazione di un embrione, ossia di un potenziale essere umano, esclusivamente quale sorgente di cellule staminali. La procedura è infatti attualmente bandita dalla maggior parte delle legislazioni europee, limitando pesantemente ogni possibile progresso concreto in tal senso. In realtà alcuni paesi hanno recentemente approvato la ricerca sugli embrioni umani, aprendo nuove strade in ambito conoscitivo e applicativo. A questo proposito, ci preme sottolineare come queste problematiche etiche 6

7 non appaiano sostanzialmente dissimili da quelle sollevate in passato dalle tecniche di fecondazione in vitro, in cui inevitabilmente viene generato un eccesso di embrioni che non saranno mai impiantati in un utero; in quest ottica, qualora le cellule ES si dovessero rivelare la soluzione ideale per un problema medico specifico, diventerebbe moralmente inaccettabile non utilizzare a tal scopo gli embrioni in eccesso generati dalle procedure di fecondazione in vitro, che rimarrebbero altrimenti inutilizzati. Per questo motivo, è assolutamente indispensabile che gli studi sulle cellule ES possano proseguire nei prossimi anni, soprattutto in ragione di un importante proprietà che a tutt oggi appare peculiare delle cellule dell embrione, e cioè la paradossale semplicità con cui è possibile allestire delle colture di cellule che rimangono totipotenti; infatti, mentre ad esempio una cellula staminale ematopoietica perde la propria pluripotenza non appena viene a contatto con il terreno di coltura, le cellule ES possono essere espanse per un gran numero di passaggi senza modificare il potenziale differenziativo. Al di là delle implicazioni etiche e giuridiche, rimangono numerosi problemi biologici e tecnici fondamentali da risolvere prima di pensare concretamente ad una ripercussione clinica della clonazione terapeutica. Ad esempio sarà necessario fornire una definizione rigorosa della cellula staminale in termini molecolari ed individuare i segnali che ne inducono la proliferazione piuttosto che il differenziamento. Inoltre è importante sottolineare come la tecnica del trasferimento nucleare utilizzata negli esperimenti di clonazione sia al momento estremamente inefficiente: la stragrande maggioranza degli animali generati con tale procedura, infatti, non è vitale, oppure risulta affetta da gravi malformazioni. L efficienza del trasferimento nucleare è peraltro estremamente variabile a seconda della specie, a anche in dipendenza delle condizioni sperimentali utilizzate, probabilmente perchè a tutt oggi non abbiamo idea di cosa voglia dire riprogrammare l informazione genetica in termini molecolari. Pertanto, solo una solida ricerca di base, volta a definire i meccanismi con cui è possibile sdifferenziare una cellula, potrà consentire di standardizzare la tecnica e aprire la strada a nuove prospettive concrete in ambito terapeutico. Come accenntao nel paragrafo introduttivo, molte delle difficoltà di ordine etico e pratico connesse alla manipolazione di embrioni umani, appaiono attualmente sorpassabili dalla recente osservazione che anche nei tessuti degli organismi adulti una popolazione consistente di cellule staminali, che pertanto potrebbero costituire un interessante sorgente cellulare alternativa alle cellule ES da utilizzare per la terapia cellulare. L elenco dei tessuti adulti in cui è stato possibile identificare una popolazione staminale si è notevolmente allungato negli ultimi anni, sollevando una domanda, frequentemente proposta sulle copertine di riviste scientifiche e divulgative: è meglio sostenere la ricerca sulle cellule staminali embrionali o piuttosto investire sulle cellule staminali dell adulto? In realtà, proporre una scelta tra i due tipi di cellule staminali appare sostanzialmente assurdo: ci sono infatti innumerevoli ragioni per ritenere che le cellule staminali dell embrione e quelle dell adulto detengano delle proprietà profondamente differenti e che pertanto siano suscettibili di sviluppi applicativi complementari, senza che l utilizzo delle prime controindichi quello delle seconde e viceversa. Per tutte queste ragioni, si sente oggi l assoluta necessità di studi comparativi, volti a valutare i relativi vantaggi e svantaggi di diverse popolazioni cellulari in diversi contesti sperimentali, quale modello di differenti condizioni di patologia umana. 7

8 Le cellule staminali dell adulto Come accennato in precedenza, in molti tessuti degli organismi adulti esistono delle popolazioni di cellule che soddisfano in maniera più o meno esaustiva la definizione di cellula staminale. È ormai indubbiamente assodata la nozione che alcuni tessuti, come ad esempio la cute e il fegato, possiedono un intrinseca capacità rigenerativa, mentre altri, quali il miocardio ed il sistema nervoso, possono riparare eventuali perdite di sostanze unicamente attraverso la formazione di una cicatrice fibrosa. È probabile che una differenza fondamentale a questo proposito possa risiedere nella presenza di cellule staminali residenti a livello dei diversi tessuti; in tal senso sarà estremamente importante capire se la presenza di una popolazione staminale sia peculiare di alcuni organi e tessuti, oppure se a fronte di una presenza ubiquitaria la loro attivazione sia possibile solo in determinati contesti. In entrambi i casi, solo una conoscenza più approfondita dei meccanismi biologici che governano la biologia delle cellule staminali sarà il requisito fondamentale per il disegno di nuove opzioni terapeutiche, volte ad esempio ad indurre la migrazione di tali cellule in sede di danno oppure ad attivare gli elementi staminali residenti, normalmente mantenuti in uno stato di quiescenza funzionale. Sorprendentemente, oltre ad essere presenti nella maggior parte dei tessuti differenziati, le cellule staminali dell adulto hanno recentemente rivelato una sorprendente plasticità (Figura 3). Una lunga serie di studi sperimentali ha infatti dimostrato che elementi staminali prelevati da un tessuto adulto sono in grado di dare origine a tipi cellulari propri di un altro tessuto, sia in vitro che in vivo. Ad esempio, le cellule staminali del midollo osseo possono essere indotte a formare cellule muscolari striate e cardiache, epatociti, osteobalsti e persino neuroni 15-19, così come diverse popolazioni cellulari sono in grado di popolare il midollo osseo e contribuire all ematopoiesi: tra queste ricordiamo ad esempio i mioblasti scheletrici (precursori delle fibrocellule muscolari fisiologicamente presenti alla periferia delle fibre e perciò chiamati anche cellule satelliti), e le cellule staminali neurali 20, 21. Questi concetti hanno peraltro messo in discussione il 8

9 concetto della lineage restriction, in quanto è stato più volte riportato che cellule di derivazione mesodermica possono dare origine a tipi cellulari propri della linea ectodermica (ad esempio la cellula staminale ematopoietica può dare origine a cellule con fenotipo neuronale). L inattesa plasticità delle cellule staminali dell adulto, oltre ad aprire interessanti scenari terapeutici, ha fatto ipotizzare che queste potessero essere equivalenti alle cellule staminali embrionali, almeno per le finalità che si propone la terapia cellulare. In realtà, come già in parte discusso, è verosimile che le potenzialità delle cellule staminali dell embrione siano di gran lunga superiori a quelle dell adulto, che peraltro potrebbero rivelarsi difficili da identificare ed isolare, presenti in numero limitato ed in sedi poco accessibili, oltre che ripetutamente esposte all azione dei mutageni ambientali. Il reperimento di cellule staminali in un numero sempre maggiori di tessuti, parallelamente all evidenza di un loro possibile ruolo nella rigenerazione di altri tessuti, anche a notevole distanza, ha fatto ipotizzare l esistenza di una cellula staminale universale capace di circolare all interno dell organismo e raggiungere così i tessuti che necessitano di riparazione; il concetto di cellula staminale universale non va necessariamente associato ad un entità fisica, in quanto potrebbe riferirisi ad uno stato funzionale, potenzialmente intrapreso da diverse popolazioni cellulari più o meno differenziate in risposta a determinati stimoli 22. In questa prospettiva una grande scommessa per i prossimi anni sarà l identificazione dei fattori in grado di indurre la colonizzazione dei diversi organi da parte delle ipotetiche cellule staminali circolanti. Il termine plasticità, ampiamente utilizzato per descrivere le proprietà versatili delle cellule staminali, indica in generale la capacità di una cellula originaria di un determinato tessuto di dare origine a cellule proprie di un altro tessuto, e viene spesso considerato sinonimo di transdifferenziamento. In realtà non esistono dei criteri rigorosi con cui definire questi processi, nè tantomeno delle metodiche standardizzate per studiare sperimentalmente il fenomeno della plasticità. Attualmente, l approccio più utilizzato è senza dubbio il trapianto in sede ectopica di cellule, il cui destino può essere successivamente analizzato almeno da tre punti di vista. Il metodo più semplice consiste nella dimostrarazione che le cellule trapiantate hanno modificato il proprio profilo di espressione genica, producendo dei marcatori tipici dell organo in cui sono state introdotte. Il secondo approccio è basato sull analisi morfologica, con particolare attenzione all eventuale integrazione delle cellule staminali con quelle residenti nella struttura locale del tessuto. L ultimo approccio, fondamentale per pensare concretamente ad un applicazione terapeutica, consiste nella realizzazione di saggi funzionali in grado di rilevare l acquisizione di nuove competenze tipiche del tessuto bersaglio (ad esempio la generazione di potenziali d azione a livello del sistema nervoso, l accoppiamento elettro-meccanico a livello cardiaco, o la secrezione di enzimi e fattori della coagulazione a livello epatico). In tutti questi casi, un requisito sperimentale assolutamente imprescindibile è la possibilità di riconoscere le cellule trapiantate, così da poterne monitorare la sopravvivenza ed il destino. Attualmente, esistono diverse strategie per marcare le cellule; tra queste, il sistema più efficiente ed affidabile consiste nell introdurre nelle cellule un gene marcatore, come ad esempio il gene per la GFP (Green Fluorescent Protein) che emette una luce verde fluorescente quando illuminata da una radiazione ultravioletta, oppure il gene LacZ, codificante per l enzima beta-galattosidasi, capace di metabolizzare un particolare substrato saccaridico formando dei precipitati blu dentro la cellula. La marcatura può essere effettuata in vivo, inoculando i geni direttamente nelle cellule staminali di un 9

10 organismo vivente mediante l impiego di vettori virali, oppure ex vivo, prelevando le cellule, marcandole in coltura e quindi introducendole nuovamente nell organismo. Tuttavia la tecnica che ha dato finora i risultati più brillanti e che riproduce meglio quanto potrebbe avvenire fisiologicamente, sfrutta la disponibilità di animali transgenici, come il topo transgenico per la GFP, in cui tutte le cellule esprimono costitutivamente il marcatore GFP e sono quindi riconoscibili perchè fluorescenti quando illuminate dalla luce ultravioletta. Qual è la miglior sorgente di cellule staminali da utilizzare per questo genere di studi? A tutt oggi la maggior parte degli approcci sperimentali ha sfruttato le cellule staminali del midollo osseo, principalmente per due ordini di motivi: da un lato il trapianto di midollo è ormai una pratica clinica routinaria, dall altro è ormai assodata la presenza di elementi staminali nel tessuto midollare, necessari per sostenere l ematopoiesi durante tutta la vita dell organismo. Purtroppo, gli unici strumenti attualmente disponibili per l identificazione delle cellule staminali sono i marcatori di superficie, che possono essere riconosciuti da anticorpi specifici. In questo modo, spesso utilizzando diverse combinazioni di marcatori, è possibile classificare, riconoscere ed isolare le differenti popolazioni cellulari. Tuttavia questo sistema presenta importanti limitazioni, dovute principalmente alla scarsa specificità dei marcatori, ossia al fatto che molti di essi sono condivisi da numerosi tipi cellulari; ad esempio, il CD34, classicamente ritenuto il principale marcatore della cellula staminale ematopoietica, è stato recentemente identificato anche sulla superficie dei mioblasti scheletrici, che come accennato sopra, rappresentano la popolazione staminale del muscolo. Se da un lato questa sovrapposizione è confortante, in quanto suggerisce l esistenza di meccanismi molecolari di funzionalità e regolazione comuni alle diverse categorie di cellule staminali, dall altro rappresenta un grosso limite per lo studio dei fenomeni di plasticità, che si basano per lo più sull analisi dei profili di espressione di marcatori specifici per i diversi tessuti. Inoltre, le cellule staminali ematopoietiche potrebbero non rappresentare le uniche cellule staminali presenti a livello midollare, in quanto recenti evidenze sperimentali indicano che anche tra le cellule stromali, classicamente considerate elementi nutritivi e di sostegno per le cellule ematopoietiche, esistono degli elementi cellulari capaci di proliferare a lungo termine e dotate di ampia plasticità. Queste cellule, comunemente indicate come cellule staminali mesenchimali o stromali, potrebbero detenere importanti proprietà, essendo in grado di dare origine ad una molteplicità di tipi cellulari, tra cui fibrocellule muscolari scheletriche, epatociti, neuroni ed oligodendrociti, adipociti, condrociti ed osteoblasti 23. In quanto stromali, queste cellule sono facilmente distinguibili da quelle ematopoietiche in base alla negatività per il CD34; tuttavia, un ultimo elemento di complessità è derivato dall osservazione che esiste un altra sub-popolazione di cellule staminali ematopoietiche, negativa per il CD34 e dotata di alti livelli di plasticità, riconoscibile per un particolare pattern di estrusione del colorante Hoechst 4333 in citofluorimetria; tale popolazione, definita side population, è stata recentemente identificata anche a livello del muscolo scheletrico 24. Da quanto detto, è evidente che le cellule staminali dell adulto, fisiologicamente predisposte a supportare l omeostasi tessutale negli organi ed apparati che vanno incontro a turn-over fisiologico, potrebbero risultare di estrema utilità per un ampia serie di approcci di rigenerazione tessutale, soprattutto alla luce di due importanti proprietà che le contraddistinguono: da un lato la possibilità di effettuare un trapianto con cellule autologhe, e quindi senza alcun rischio di rigetto, dall altro la totale assenza di potenziale cancerogenetico, che al contrario è stato precedentemente descritto come prova di pluripotenzialità delle cellule ES. 10

11 La terapia cellulare per le malattie cardiovascolari Il principio biologico che sottende a qualsiasi approccio terapeutico basato sull utilizzo di cellule staminali consiste nel differenziamento tessuto-specifico. Secondo questa ipotesi, ogni tessuto in condizioni di danno sarebbe in grado di secernere una importante quantità di fattori di crescita e citochine capaci di indirizzare il differenziamento di precursori staminali a formare i tipi cellulari più appropriati; in quest ottica, diversi tipi di cellule staminali sono stati inoculati a livello cardiaco, con la speranza di indurre il loro transdifferenziamento in cardiomiociti e/o in strutture vascolari (Figura 4). Le numerose evidenze di plasticità delle cellule staminali dell adulto, parallelamente ai progressi realizzati dalla ricerca sulle cellule ES, sembrano confortare questa allettante ipotesi, anche se, come discusso più avanti, risultati molto recenti inducono a conservare una certa cautela nell interpretazione degli esperimenti di transdifferenziamento. Nonostante il cuore sia tradizionalmente considerato un organo completamente privo di capacità rigenerativa, diverse evidenze sperimentali sembrano indicare che la mobilizzazione di cellule mononucleate CD34+ dal midollo osseo possa essere un importante meccanismo fisiologico di riparazione del tessuto cardiaco e vascolare dopo un insulto di tipo ischemico 25. In quest ottica è nata l idea di utilizzare le cellule midollari per stimolare la rigenerazione cardiaca. La via più diretta per l implementazione di una terapia cellulare nel cuore infartuato è senza dubbio l iniezione intramiocardica. Le prospettive terapeutiche associate allo studio delle cellule staminali midollari si sono notevolmente allargate e concretizzate qualche anno fa, in seguito alla pubblicazione di una serie di studi sperimentali che hanno dimostrato la possibilità di utilizzare queste cellule per la rigenerazione del miocardio in seguito ad un infarto cardiaco in diversi modelli animali. Le prime sperimentazioni sono state realizzate in un modello murino di infarto cardiaco, indotto mediante legatura di un arteria coronaria, prelevando le cellule dal midollo osseo da un topo transgenico per la GFP e iniettandole nella periferia della zona infartuata 16; in questo modo è stato 11

12 possibile documentare il ripopolamento della regione infartuata da parte di nuovo tessuto miocardico e di nuovi vasi sanguigni, entrambi positivi per la GFP e quindi di evidente origine midollare. Successivamente, ai parametri morfologici, è stato possibile affiancare una valutazione funzionale, sia in termini di contrattilità che di perfusione, confermando il potenziale beneficio derivabile da un approccio di terapia cellulare per la cardiopatia ischemica Tuttavia non possiamo essere certi che il beneficio apportato dalle cellule staminali sia la conseguenza di una loro diretta trasformazione in nuove cellule muscolari funzionanti o in nuovi vasi sanguigni, in quanto esse potrebbero avere semplicemente rappresentato una sorgente di fattori di crescita utili per limitare la morte dei cardiomiociti, oppure aver facilitato la cicatrizzazione dell area infartuale, prevenendo quel rimodellamento del ventricolo che spesso predispone alle maggiori complicazioni del post-infarto, come le aritmie o la dilatazione aneurismatica. Considerata l invasività dell approccio intramiocardico, altri gruppi hanno sperimentato vie di somministrazione alternative, come ad esempio l iniezione intravascolare sistemica 29, partendo dal presupposto che dal tessuto ischemico vengano rilasciati dei fattori chemiotattici in grado di reclutare localmente le cellule staminali midollari circolanti. Questa capacità peculiare delle cellule staminali di migrare spontaneamente nelle sedi di danno tissutale ha anche aperto la strada alla possibilità di stimolare la loro mobilizzazione mediante la somministrazione di fattori di crescita specifici per i progenitori midollari 30. Ma qual è la rilevanza di tutte queste osservazioni per la patologia umana? E qual è stato sinora il loro reale impatto nella realtà clinica? Il principale approccio utilizzato per studiare un possibile ruolo delle cellule staminali circolanti nell omeostasi del tessuto cardiaco umano si è avvalso di cuori prelevati da donatori di sesso femminile trapiantati in soggetti di sesso maschile; in questo contesto, il riscontro di vasi e cardiomiociti positivi per il cromosoma Y presuppone l esistenza di una cellule staminale circolante del ricevente, capace di colonizzare il cuore trapiantato e differenziarsi in molteplici direzioni in seguito all azione di segnali locali 31. Tuttavia dobbiamo sottolineare come, a fronte di un ipotesi così affascinante, i risultati finora ottenuti sono piuttosto discordanti, e lasciano giustificate perplessità sul reale significato di queste osservazioni e sulle prospettive terapeutiche che ne potrebbero conseguire Di fatto, nonostante la scarsa sperimentazione animale e i limitati presupposti teorici, la transizione della terapia cellulare dell infarto cardiaco sul piano clinico è stata particolarmente rapida, con l avvio di una serie di sperimentazioni, che prevedono l iniezione di cellule autologhe di midollo osseo in territori di miocardio ischemico, con l obiettivo di migliorare la vascolarizzazione ed indurre rigenerazione muscolare. In realtà, i primi studi randomizzati di trapianto di cellule midollari autologhe si sono rivolti ad un numero esiguo di pazienti con gravi forme di arteriopatia ostruttiva agli arti inferiori, che hanno ricevuto circa un miliardo di cellule mononucleate, di provenienza ematica o midollare, a livello dell arto ischemico; pur trattandosi di risultati preliminari, i soggetti trattati hanno presentato una significativa neovascolarizzazione, accompagnata da un aumento della perfusione rilevato con tecnica Doppler e da un notevole miglioramento della sintomatologia 35. Un approccio analogo è stato impiegato per per l induzione di angiogenesi terapeutica nella cardiopatia ischemica, somministrando lo stesso numero di cellule mediante iniezione nel circolo coronarico o direttamente nel parenchima cardiaco, in corrispondenza di aree ischemiche, non suscettibili dei tradizionali interventi di 12

13 rivascolarizzazione. I primi risultati sembrano indicare un netto incremento della perfusione nelle zone ischemiche, documentabile mediante scintigrafia e risonanza magnetica, che tuttavia non si accompagna alla formazione di nuovi vasi collaterali visibili in angiografia Tuttavia è necessario sottolineare che tutti questi studi presentano un importante limite, dovuto al fatto che il trapianto cellulare viene per lo più eseguito contestualmente all esecuzione di altri interventi impianto di by-pass o angioplastica transluminale percutanea in sedi adiacenti, per cui i miglioramenti osservati potrebbero ragionevolmente essere la conseguenza della rivascolarizzazione delle zone limitrofe. Inoltre, sembra particolarmente pretenziosa l idea di poter ottenere un concreto beneficio clinico attraverso l iniezione di midollo osseo non frazionato, in cui la presenza di elementi staminali è verosimilmente minima; di conseguenza, solo un intensa fase di ricerca di base e sperimentazione animale, finalizzate alla caratterizzazione delle diverse sub-popolazioni midollari e delle loro proprietà, potrà definire con precisione quale cellula presente nel midollo sia effettivamente capace di dare origine a nuovi vasi sanguigni e a nuovo tessuto muscolare, così da avviare un protocollo di arricchimento per il trapianto di una popolazione selezionata e quindi più efficace. Un approccio alternativo per la terapia cellulare della cardiopatia ischemica si avvale dell espansione in coltura di mioblasti scheletrici; diversi studi sperimentali sembrano infatti indicare che i mioblasti, una volta inoculati a livello cardiaco, sono in grado di contrarsi in modo sincrono con i cardiomiociti residenti 40. Sulla base dei promettenti risultati ottenuti dalla sperimentazione animale, il gruppo di Menaschè ha avviato una sperimentazione clinica, che ha reclutato un limitato gruppo di pazienti affetti da una grave disfunzione ventricolare sinistra, con una regione cardiaca acinetica e metabolicamente inattiva identificabile in PET; sugli stessi pazienti è stata eseguita una biopsia muscolare, per l allestimento di una coltura di mioblasti scheletrici, che dopo 3 settimane di espansione, sono stati inoculati nella zona cicatriziale della parete cardiaca 41. I risultati a 10 mesi indicano un netto miglioramento della sintomatologia e della funzionalità ventricolare, un ispessimento della zona acinetica e la comparsa di attività metabolica a tale livello. I risultati sembrano dunque molto simili a quelli ottenuti con le cellule di midollo osseo, anche se un notevole vantaggio connesso all uso dei mioblasti è la possibilità di espansione in coltura delle cellule ex vivo, del tutto impensabile per le cellule staminali midollari, che al contrario vanno inevitabilmente incontro ad un processo di differenziamento non appena vengono poste in coltura.tuttavia anche in questo caso il trapianto cellulare è stato realizzato contemporaneamente all apposizione di by-pass in una zona remota, per cui sono lecite tutte le perplessità descritte a proposito del trapianto di cellule midollari. Inoltre, come già accennato all inizio del paragrafo, le recenti evidenze di transdifferenzamento da parte delle cellule staminali midollari sono state recentemente messe in discussione da diversi lavori sperimentali che indipendentemente suggeriscono la possibilità di ottenere analoghi esempi di conversione fenotipica mediante un semplice processo di fusione cellulare 42, e per di più escludono il potenziale di transdifferenziamento delle cellule midollari in vivo. Al contrario, queste recenti ed autorevoli pubblicazioni, non solo negano la capacità delle cellule staminali midollari di dare origine a nuovi cardiomiocti, ma dimostrano che esse mantengono un fenotipo ematopoietico 43, 44. Come spiegare la discordanza di questi risultati con quelli dei lavori precedenti? Probabilmente la principale differenza risiede nelle tecniche utilizzate per dimostrare il transdifferenziamento: 13

14 infatti in questi ultimi lavori, invece di rilevare l espressione di particolari marcatori tissutali mediante anticorpi specifici, sono state impiegate delle tecniche di marcatura genica, decisamente più specifiche ed affidabili. Soprattutto alla luce di questi risultati confondenti, un crescente interesse è stato recentemente rivolto all identificazione di una putativa popolazione staminale nel cuore degli organismi adulti. Un paradigma accettato ma mai provato considera il cuore un organo post-mitotico, caratterizzato da un numero pre-detrminato di miociti, definito subito dopo la nascita e preservato per tutta la vita di un organismo 45. Secondo questa teoria, l età dei cardiomiociti corrisponde a quella del cuore e dell intero organismo, il che garantisce una certa omogeneità di invecchiamento cellulare e quindi di funzionalità. Pertanto, una fisiologica riduzione di funzionalità cardiaca è da sempre stata considerata un processo biologico conseguente all invecchiamento, il cui effetto va sommato a quello di eventuali patologe concomitanti (quali la cariopatia ischemica, l ipertensione o il diabete) nel determinare il fenotipo clinico. Tuttavia, l ormai assodata esistenza delle cellule satelliti a livello del muscolo scheletrico, ed il loro ruolo fondamentale nei processi di rigenerazione muscolare 46, ha fatto nascere l ipotesi che in realtà anche il miocardio possa detenere una capacità rigenerativa attraverso l attivazione di una popolazione di cellule staminali residenti. Dopo decenni di infruttuose ricerche, nel 2001 è stata descritta per la prima volta la presenza di mitosi nel cuore, apparentemente a carico di cellule positive per l isoforma cardiaca della miosina, localizzate nella zona di miocardio ibernato nel post-infarto, a suggerimento di un possibile tentativo di rigenerazione in seguito al danno inschemico 47. Ancora più di recente è stato possibile identificare ed isolare dal cuore adulto una popolazione di cellule, altamente indifferenziate e positive per tre noti marcatori di staminalità (c-kit, MRD1 e Sca-1), e capaci di dare origine simultaneamente a cardiomiociti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce, vale a dire a tutti i tipi cellulari che caratterizzano il miocardio 48. Ovviamente, l idea che nel cuore esistano delle cellule staminali così versatili, oltre ad essere molto affascinante dal punto di vista biologico, potrebbe aprire enormi scenari terapeutici, anche se rimangono alcuni importanti punti da risolvere. Infatti, se nel cuore esiste veramente una popolazione di cellule staminali in grado di supportare la rigenerazione cardiaca, perchè non vengono fisiologicamente mobilizzate ed attivate in risposta ad un evento patologico? In questo senso, la scommessa dei prossimi anni sarà proprio quella di determinare quali segnali molecolari potrebbero essere in grado di stimolare una putativa popolazione staminale cardiaca, reclutarla in sede di danno ed infine indurre un appropriato processo di differenziamento. Legenda alle figure Figura 1. Differenziamento dei tessuti umani. La figura rappresenta schematicamente il processo di embriogenesi, per il quale già nelle prime fasi dello sviluppo embrionale sono riconoscibili tre foglietti (definiti rispettivamente ectoderma, mesoderma ed endoderma), dai quali origineranno tutte le cellule che fisiologicamente compongono un organismo adulto. Al contrario, la segregazione delle cellule germinali nella maggior parte dei mammiferi avviene in una struttura adiacente, ma non appartenente ad alcuno dei tre foglietti. Figura 2. Linee di cellule staminali di derivazione embrionale. Le cellule ES sono ricavate dalla massa cellulare interna (MCI) della blastocisti; le linee di cellule EC derivano invece dalla componente indifferenziata di particolari tumori delle gonadi teratocarcinomi che insorgono spontaneamente, oppure sono indotti 14

15 sperimentalmente mediante il trasferimento di cellule embrionali in sede extrauterina; infine le cellule EG originano da cellule germinali primordiali e vengono generalmente isolate dalla cresta gonadica che si forma nell embrione entro il dodicesimo giorno dopo la fecondazione. Figura 3. Plasticità delle cellule staminali dell adulto. Nello schema sono rappresentati in maniera sintetica recenti studi sperimentali che hanno dimostrato la straordinaria plasticità delle cellule staminali dell adulto. La nozione che in differenti distretti corporei è possibile riscontrare una popolazione di cellule staminali capaci di dare origine a molteplici tipi cellulari ha suggerito la possibilità di utilizzare tali cellule per la ricostituzione tessutale in numerose patologie di tipo degenerativo. In colore rosso sono indicati gli approcci sperimentali di terapia cellulare per le malattie cardiovascolari, cui viene fatto riferimento nel testo. Figura 4. Approcci di terapia cellulare per la rigenerazione cardiaca. Nella figura sono elencate le principali popolazioni di cellule staminali attualmente considerate dalla sperimentazione animale e clinica per indurre la rigenerazione del cuore nel post-infarto. Come riportato nel testo, la maggior parte degli approcci finora realizzati ha utilizzato cellule di derivazione midollare (cellule staminali ematopoietiche, cellule stromali, progenitori delle cellule endoteliali circolanti, oppure midollo osseo non frazionato). Tuttavia, interessanti risultati in termini morfologici e funzionali sono stati recentemente ottenuti anche in seguito al trapianto di mioblasti scheletrici (precursori delle fibre muscolari scheletriche) e di cellule ES (cellule staminali di origine embrionale). Le frecce si riferiscono alla possibilità di iniettare le cellule direttamente nel tessuto cardiaco, oppure, in maniera meno invasiva, in sede intravascolare. Riferimenti bibliografici 1. Leferovich JM, Bedelbaeva K, Samulewicz S et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98: Martin GR, Evans MJ. The morphology and growth of a pluripotent teratocarcinoma cell line and its derivatives in tissue culture. Cell 1974; 2: Lovell-Badge R. The future for stem cell research. Nature 2001; 414: Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 1981; 292: Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282: Shamblott MJ, Axelman J, Wang S et al. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95: Burdon T, Chambers I, Stracey C et al. Signaling mechanisms regulating self-renewal and differentiation of pluripotent embryonic stem cells. Cells Tissues Organs 1999; 165: Skerjanc IS. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med 1999; 9:

16 9. Wobus AM, Wallukat G, Hescheler J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation 1991; 48: Rohwedel J, Sehlmeyer U, Shan J et al. Primordial germ cell-derived mouse embryonic germ (EG) cells in vitro resemble undifferentiated stem cells with respect to differentiation capacity and cell cycle distribution. Cell Biol Int 1996; 20: Kehat I, Kenyagin-Karsenti D, Snir M et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest 2001; 108: Boheler KR, Czyz J, Tweedie D et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res 2002; 91: Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 1997; 385: Lanza R, Moore MA, Wakayama T et al. Regeneration of the infarcted heart with stem cells derived by nuclear transplantation. Circ Res 2004; 94: Gussoni E, Soneoka Y, Strickland CD et al. Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation. Nature 1999; 401: Orlic D, Kajstura J, Chimenti S et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 2001; 410: Kuznetsov SA, Mankani MH, Gronthos S et al. Circulating skeletal stem cells. J Cell Biol 2001; 153: Bjornson CR, Rietze RL, Reynolds BA et al. Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. Science 1999; 283: Brazelton TR, Rossi FM, Keshet GI et al. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. Science 2000; 290: Jackson KA, Mi T, Goodell MA. Hematopoietic potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: Mezey E, Chandross KJ, Harta G et al. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. Science 2000; 290: Blau HM, Brazelton TR, Weimann JM. The evolving concept of a stem cell: entity or function? Cell 2001; 105: Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science 1997; 276: Goodell MA. Multipotential stem cells and 'side population' cells. Cytotherapy 2002; 4: Shintani S, Murohara T, Ikeda H et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction. Circulation 2001; 103: Fuchs S, Baffour R, Zhou YF et al. Transendocardial delivery of autologous bone marrow enhances collateral perfusion and regional function in pigs with chronic experimental myocardial ischemia. J Am Coll Cardiol 2001; 37:

17 27. Orlic D, Kajstura J, Chimenti S et al. Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice. Ann N Y Acad Sci 2001; 938: ; discussion Tomita S, Mickle DA, Weisel RD et al. Improved heart function with myogenesis and angiogenesis after autologous porcine bone marrow stromal cell transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg 2002; 123: Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. Nat Med 2001; 7: Orlic D, Kajstura J, Chimenti S et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98: Quaini F, Urbanek K, Beltrami AP et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med 2002; 346: Glaser R, Lu MM, Narula N et al. Smooth muscle cells, but not myocytes, of host origin in transplanted human hearts. Circulation 2002; 106: Laflamme MA, Myerson D, Saffitz JE et al. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res 2002; 90: Muller P, Pfeiffer P, Koglin J et al. Cardiomyocytes of noncardiac origin in myocardial biopsies of human transplanted hearts. Circulation 2002; 106: Tateishi-Yuyama E, Matsubara H, Murohara T et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet 2002; 360: Tse HF, Kwong YL, Chan JK et al. Angiogenesis in ischaemic myocardium by intramyocardial autologous bone marrow mononuclear cell implantation. Lancet 2003; 361: Stamm C, Westphal B, Kleine HD et al. Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration. Lancet 2003; 361: Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation 2003; 107: Strauer BE, Brehm M, Zeus T et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation 2002; 106: Menasche P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc Res 2003; 58: Menasche P, Hagege AA, Scorsin M et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet 2001; 357: Wurmser AE, Gage FH. Stem cells: cell fusion causes confusion. Nature 2002; 416: Murry CE, Soonpaa MH, Reinecke H et al. Haematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts. Nature 2004; 428: Balsam LB, Wagers AJ, Christensen JL et al. Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischaemic myocardium. Nature 2004; 428:

18 45. Chien KR, Olson EN. Converging pathways and principles in heart development and disease: Cell 2002; 110: Mauro A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol 1961; 9: Beltrami AP, Urbanek K, Kajstura J et al. Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction. N Engl J Med 2001; 344: Beltrami AP, Barlucchi L, Torella D et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell 2003; 114: