Suscettibilità genetica alle malattie

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1 Fattori genetici alla base della suscettibilità alla scrapie Il progetto pilota per la selezione genetica degli ovini in provincia di Siena: una praticabile prospettiva strategica di prevenzione delle EST 24 febbraio 2011 Siena Dr. Gabriele Vaccari Istituto Superiore di Sanità Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Suscettibilità genetica alle malattie Influenza del genotipo dell ospite allo sviluppo di malattia. Nelle TSE questa predisposizione è correlata in larghissima misura con un singolo gene. Gli ovini e la scrapie rappresentano un caso emblematico per la gestione di una malattia applicando la selezione genetica.

2 Gli studi che hanno portato alla definizione di resistenza I primi studi di trasmissione hanno evidenziato come nelle pecore esistessero sempre dei resistenti mentre nelle capre erano tutte suscettibili. 14/29 4/26 12/12 4/10 16/16 4/10 10/10 Pattison et al., 1959 Gli studi che hanno portato alla definizione di resistenza La scrapie è stata trasmessa a varie specie animali. Tuttavia solo nelle pecore, gli ospiti naturali di questa malattia, sono stati descritti animali che appaiono essere resistenti. questa resistenza ha una base che può essere di natura genetica o immunologica Dickinson et al., 1968

3 Gli studi che hanno portato alla definizione di resistenza La trasmissione sperimentale della scrapie nelle pecore ha evidenziò fin dall inizio un numero di sopravvissuti. I suscettibili furono divisi in due gruppi di tempi di incubazione Short (SIP) e longer (LIP). Dickinson et al., 1968 Gli studi che hanno portato alla definizione di resistenza Studi di genetica classica hanno evidenziato che la percentuale di animali sensibili era Dickinson et al., 1968

4 Gli studi che hanno portato alla definizione di resistenza Queste osservazioni, insieme al fatto che circa il 38% dei figli SIP x resistenti, risulta SIP,..sono compatibili con l ipotesi che la scrapie sia controllata da un gene associato a dominanza per suscettibilità.. che abbia una frequenza di circa il 20 % nella popolazione fondatrice. Dickinson et al., 1968 POLIMORFISMI DELL GENE DELLA PROTEINA PRIONICA OVINA Il gene che controlla la suscettibilità è stato identificato con il gene che codifica la proteina prionica. Una proteina che si accumula sottoforma di fibrille negli animali malati. Nelle pecore furono identificati 5 principali alleli A136V R154H Q171R/H ARQ ARR VRQ AHQ ARH

5 Gli studi che hanno portato alla definizione di resistenza Studio del rischio per genotipo nel Regno Unito dal su 1500 casi di scrapie e controlli Baylis et al., 2004 SUFFOLK genotipo ARQ/ARQ ARQ/ARR ARR/ARR CHEVIOT genotipo VRQ/VRQ VRQ/ARQ VRQ/ARR ARQ/ARQ ARQ/ARR ARR/ARR Incidenza della scrapie alta molto bassa resistenti Incidenza della scrapie molto alta molto alta bassa bassa molto bassa resistenti

6 Gli studi che hanno portato alla definizione di resistenza L influenza del genotipo alla resistenza alla scrapie si è resa evidente, da tempo, nei primi esperimenti in cui l accoppiamento di animali che non sviluppavano la malattia portava a progenie che non sviluppava malattia. La scoperta del gene della proteina prionica e gli studi patogenetici sulla scrapie hanno svelato il candidato per spiegare l influenza genetica a queste malattie. Il Gene che codifica la proteina prionica. Gli studi caso controllo, epidemiologici, di trasmissione sperimentale con differenti ceppi di scrapie hanno indicato l allele ARR come fattore associato a resistenza alla scrapie. GENOTIPO DELLA PrP IN PECORE DI RAZZA SARDA SANE ED AFFETTE DA SCRAPIE Affette da scrapie Sane Affette da scrapie # (n=33) (n=79) (n=23) % ARQ/ARQ ARQ/ARR AHQ/ARQ AHQ/ARR # provenienti da greggi non correlati ARR/ARR G. Vaccari et al., Arch Virol 2001

7 GENOTIPO DELLA PrP IN PECORE DI RAZZA COMISANA SANE ED AFFETTE DA SCRAPIE Affette da scrapie (n=22) Sane (n=111) 60 % ARQ/ARQ ARQ/ARR ARR/ARR VRQ/ARR AHQ/ARR AHQ/ARQ Agrimi et al., Vet Res. Comm Distribuzione dei Genotipi della Proteina prionica in un focolaio di scrapie Elsen et al., 1999

8 POLIMORFISMI DELL GENE DELLA PROTEINA PRIONICA OVINA A136V R154H Q171R/H ARQK 176 AT 137 RQ M112T G127V A136T R151C P168L Q171K H180Y H143R Q189L L141F I142K N176K M137T R211Q ARQ ARR VRQ AHQ P241S ARH ARR/ARR ARQ/ARR ARQ/AK 142 RQ ARQ/ARQK 176 ARQ/AT 137 RQ TIME POST INFECTION ARQ/AHQ ARQ/ARQ Pre-clinical PrP Sc INFEZIONE PER VIA ORALE CON SCRAPIE Razza Sarda 0/5 0/14 0/1 0/1 0/3 ARQ/ARH 0/3 5/5 5/ MONTHS 6 MONTHS 9 MONTHS 12 MONTHS 16 MONTHS 20 MONTHS days post infection ARQ/ARQ wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt 176 wt/wt wt/wt 142 wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt 137 wt/wt N/K I/K M/T GALT TISSUES NON GALT TISSUES CNS G. Vaccari et al., J.Virol 2007

9 INFEZIONE PER VIA INTRA CEREBRALE CON SCRAPIE ARQK 176 /ARR ARQK 176 /AHQ ARQK 176 /AT 137 RQ ARR/ARR ARH/ARR AHQ/ARR ARQ/ARR AHQ/ARH ARQ/ARH AHQ/AHQ ARQ/AHQ ARQ/ARQ 0 / 2 0 / 1 0 / 1 0 / 5 0 / 1 0 / 1 1 / 13 3 / 3 1 / 1 1 / 1 5 / 5 5 / days post infection G. Vaccari et al., J.Virol 2007 INFEZIONE PER VIA INTRA CEREBRALE CON BSE E BASE BSE ARR/ARR ARQ/ARR ARQK 176 /AHQ AT 137 RQ/AHQ ARQ/AT 137 RQ ARQ/ARQ 2/7 0/5 0/1 0/1 0/3 2/2 BASE ARR/ARR ARQ/ARR AF 141 RQ/ARQK 176 ARQ/ARQK 176 ARQ/AT 137 RQ ARQ/ARQ /8 4/7 0/1 0/1 0/2 8/ d.p.i. G. Vaccari et al., J.Virol 2007

10 GLI STUDI DI TRASMISSIONE SPERIMENTALE La via intracerebrale ha un efficienza maggiore di quella orale. Gli animali con l allele ARR non sviluppano la malattia dopo > 2000 gg dopo infezione Orale con scrapie ma anche dopo infezione I.C. Esiste un diveso targeting genetico a seconda del ceppo di agente. Gli alleli AT 137 RQ e ARQK 176 conferiscono resistenza all infezione orale ma anche I.C. con scrapie, BSE e BASE. STUDI CASI CONTROLLO Verificare se l osservazione ottenuta dalla sperimentazione si può osservare anche in condizioni di campo. Più focolai in Toscana dove la scrapie circola ormai da tempo ed in cui la prevalenza della malattia risultava elevata. L analisi si è concentrata sugli animali recanti il genotipo ARQ/ARQ.

11 STUDI CASI CONTROLLO Disegno dello studio Allevamenti Animali A B C D E Totale NellÕallevamento Genotipizzati Testati per TSE Vaccari et al, Vet. Res.2009 STUDI CASI CONTROLLO Disegno dello studio A B C D E ARR/ARR ARR/ARQ ARR/ARH ARR/AHQ ARQ/ARQ AHQ/AHQ ARH/ARQ AHQ/ARH AHQ/ARQ ARR/VRQ ARQ/VRQ Genotipo PrP Vaccari et al, Vet. Res.2009

12 100% STUDI CASI CONTROLLO Focolai Genotipo dei A B C D E TOT. Positivi ARQ/ARQ ARQ/AHQ ARQ/ARR 1 1 TOTALE ARQwt/ARQwt POSITIVI per SCRAPIE 1 2 Risultati 100% ARQ/ARQ con altri polimorfismi NEGATIVI 75% 3 75% % % 25% 0% A B C D E Focolai 7 25% 0% A B C D E Focolai Vaccari et al, Vet. Res.2009 Casi ARQ/ARQ Controlli ARQ/ARQ Allevamento Allevamento Genotipo A B C D E A B C D E ARQ wt/ ARQ wt ARQ wt/ T 112ARQ 1 ARQ wt /V 127ARQ ARQ wt /AT 137RQ ARQ wt /AF 141RQ ARQ wt /AK 142RQ 1 ARQ wt /AR 143RQ 6 1 ARQ wt /ARQK T 112ARQ/AT 137RQ AT 137RQ/AT 137RQ AT 137RQ/AF 141RQ AT 137RQ/AR 143RQ AT 137RQ/ARQK 176 AF 141RQ/V 127ARQ AF 141RQ/AF 141RQ STUDI CASI CONTROLLO AF 141RQ/ARQK ARQK 176/ARQK TOTAL Risultati Odds ratio rispetto agli ARQwt/ARQwt AT 137 RQ/XXX AF 141 RQ/XXX ARQK 176 /XXX A 0,00 [0,00; 0,94] * 0,00 [0,00; 2,38] 0,00 [0,00; 3,18] B 0,00 [0,00; 0,33] * 0,11 [0,01; 0,82] * 0,00 [0,00; 0,29] * C 0,00 [0,00; 0,04] * 0,06 [0,01; 0,47] * 0,00 [0,00; 0,03] * D 0,00 [0,00; 0,56] * 0,00 [0,00; 0,46] * 0,00 [0,00; 0,22] * E 0,00 [0,00; 0,68] * 0,26 [0,02; 1,63] 0,00 [0,00; 0,68] * Vaccari et al, Vet. Res.2009

13 STUDI CASI CONTROLLO Conclusioni L effetto di protezione può essere osservato anche in condizioni di campo laddove la pressione infettante è elevata. Forse non è un caso l aver osservato queste differenze proprio dove la scrapie è presente da più tempo. La mancanza degli omozigoti ci impedisce tuttavia di avere informazioni del comportamento di questo genotipo nei confronti della scrapie. Rischio di scrapie per genotipo in Italia 755 Casi di scrapie dal ARQwt/ARQwt utilizzatp come referenza. *p<0,05; **p<0,001. Ciaravino et al.,in preparation

14 Dominanza e Overdominanza Il tempo di incubazione è controllato dal genotipo al locus PRNP e dal ceppo dell agente. E noto che gli alleli murini si possano comportare come associati a dominanza o a overdominanza a seconda dei ceppi di prioni. Dickinson and Fraser 1979 PMCA Il PMCA è una tecnica che permette di trasformare la PrP C in PrP Sc utilizzando un inoculo infetto. Replica PrP Sc ma anche infettività. Il PMCA replica fedelmente le caratteristiche di un ceppo di TSE Esperimenti relativamente veloci. Meccanismo di trasformazione sconosciuto. Può il PMCA replicare in vitro la suscettibilità genetica degli ovini alla scrapie?

15 Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA) PrP Sc + Sonicazione Sonicazione Incubazione Incubazione PrP C Soto et al. (2002) Trends Neurosci. 25: Disegno degli esperimenti di PMCA Inoculo: : un isolato di scrapie italiana già utilizzato negli studi di trasmissione sperimentale in pecore Substrati: : omogenati cerebrali da pecore di razza Sarda con i seguenti genotipi: ARQ/ARQ ARQ/AHQ AHQ/ARH ARQ/ARR ARR/ARR ARQ/AT 137 RQ ARQ/ARQK 176 ARQK 176 /ARQK 176

16 Risultati del PMCA Fattore di Amplificazione 9.9±2.8 Fattore di Amplificazione 8.0±2.9 Fattore di Amplificazione 3.6±2.0 Fattore di Amplificazione 1.3±0.4 Risultati del PMCA Fattore di Amplificazione 1.3±0.3 Fattore di Amplificazione 1.9± Fattore di Amplificazione 1.3±0.2 Fattore di Amplificazione 2.0±1.6

17 Confronto fattore di conversione in vitro e tempi di incubazione in vivo Amplification factor Survival time ARQ/ARQ ARQ/ARQ ARQ/AHQ ARQ/AHQ AHQ/ARH AHQ/ARH ARQ/ARR ARQ/ARR ARR/ARR ARR/ARR Fattore di ampliciazione dopo PMCA (C. Bucalossi et al, in preparation) Tempi di incubazione, trasmisisone scrapie IC (G. Vaccari et al., J. Virol 2007) RQ 176 /ARQ 176 ARQ/ARQKARQ/ARQ 176 ARQ/ATARQ/A 137 RQ ARQKARQ 176 /ARQK 176 STUDI in vitro PMCA Conclusioni L efficienza di conversione tramite PMCA sembra essere genotipo specifica. I risultati di efficienza di conversione correlano con i dati osservati nelle infezioni sperimentali in vivo. Gli animali omozigoti ARQK 176 /ARQK 176 mostrano efficienza di conversione paragonabile agli ARR/ARR.

18 POLIMORFISMI DELL GENE DELLA PROTEINA PRIONICA CAPRINA N146S/D Q222K I142M R154H R211Q R151H P168Q W18R V21A L23P G37V G49S G127S T110P L133Q M137I I142TF H143R G232W Q220H T194P R211G S240P I142M ASSOCIATO A PROTEZIONE DA SCRAPIE Goldmann et al., 1996 La metionina al codone (I142) è stata associata ad un tempo di incubazione maggiore in un esperimento trasmissione sperimentale con differenti isolati di TSE. Vari eterozigoti un solo omozigote, tutti suscettibili

19 N146S/D ASSOCIATO A PROTEZIONE DA SCRAPIE Papasavva-Stylianou et al., 2007 Papasavva-Stylianou et al., 2010 La Serina o l acido l aspartico al codone (S146, D146) sono stati associati a protezione alla scrapie in studi caso controllo, a Cipro in due lavori successivi, esistono degli eterozigoti affetti da scrapie. Nei controlli negativi molti eterozigoti, pochi omozigoti R154H ASSOCIATO A PROTEZIONE DA SCRAPIE L Istidina al codone (H154) è stata associata in studi caso controllo a protezione alla scrapie. Barillet et al., 2009 Billinis et al., 2002 In altri studi tuttavia la protezione non è stata osservata e vari casi di scrapie con 154 H/R sono stati riscontrati.

20 R154H, R211Q ASSOCIATO A PROTEZIONE DA SCRAPIE La glutammina al codone 211 (Q211) è stata associata in uno studio caso controllo a protezione alla scrapie. Allele poco presente in altre razze Studi di trasmissione sperimentale in corso Barillet et al., 2009 Q222K ASSOCIATO A PROTEZIONE DA SCRAPIE La lisina al codone (K222) è stata associata in tre indipendenti studi casi controllo a protezione alla scrapie. Vari eterozigoti nessun eterozigote Studi di trasmissione sperimentale in corso Acutis et al., 2006 Vaccari et al., 2006 In quest ultimo lavoro un caso di scrapie è stato osservato in un animale eterozigote Q/K 222 Barillet et al., 2009

21 Quali alleli utilizzare? Alleli che mostrino protezione degli animali sia eterozigoti che in omozigoti Associati a resistenza nei confronti di differenti ceppi di scrapie Gli animali eterozigoti od omozigoti non agiscano da portatori sani della malattia. Aspetti importanti per la valutazione di alleli candidati alla resistenza alle TSE Verificare e misurare il livello di resistenza associato con un determinato allele. Accertarne l influenza nella patogenesi e nella distribuzione dell agente delle TSE nell organismo. Verificare il ruolo epidemiologico degli animali recanti l allele nel mantenimento dell infezione in un gregge in condizioni naturali.

22 SELEZIONE GENETICA NUOVI SCENARI E INTERROGATIVI Pecore L associazione del allele ARR alla resistenza risulta ormai consolidata La nomenclatura ai 3 codoni nasconde un ampia variabilita del gene della PrP ed alcuni alleli potrebbero avere una rilevante influenza sulla suscettibilità (AT 137 RQ, ARQK 176 ) Ulteriori studi sono necessari per capire meglio il ruolo dei candidati alleli resistenti anche nei confronti di altri ceppi in altre razze e regioni La possibilità di avere ulteriori alleli resistenti potrebbe essere utile nell eventualità di emersione di nuovi ceppi di agente e mantenimento di maggiore biodiversità SELEZIONE GENETICA NUOVI SCENARI E INTERROGATIVI Capre Nelle capre siamo agli inizi delle indagini per l identificazione di alleli associati alla resistenza. Alcuni alleli sono molto rari ma la loro influenza sulla suscettibilità può essere rilevante (K222, D146, S146) Ulteriori studi sono necessari per capire meglio il ruolo dei candidati alleli resistenti anche nei confronti di altri ceppi in altre razze e regioni L esistenza di alleli resistenti anche nelle capre potrebbe risolvere il problema della scrapie in questa specie e far si che i caprini non diventino una possibile specie serbatoio per la scrapie.

23 ISS (I) U. Agrimi R. Nonno, G. Vaccari M. Di Bari, GM Cosseddu, G.Scavia, L. Morelli, B. Chiappini, C.D Agostino, L. Pirisinu, C. Bucalossi, G. Ciaravino, G. Antonucci, Fazzi, E. Esposito, M. Conte, S. Marcon, C. Parisi, N.Palazzini, S. Simson, P. Frassanito Collaborations: ISS (I) M. Pocchiari, F. Cardone VLA (UK) O. Windl, M. Jeffrey, L. Gonzalez LMU (D) H.A. Kretzschmar, U. Bertsch UZH (CH) H-P. Lipp, G. Dell Omo IAH (UK)M. Bruce AFSSA (F) T. Baron INRA (F) H. Laude INIA (E) J.M. Torres FLI (D) M. Groschup TSRI (USA) J. Castilla UTMB (USA) C. Soto CEA (I) M. Caramelli IZSLT (I) L. De Grossi