VII CONVEGNO DEGLI ISTITUTI ZOOPROFILATTICI SPERIMENTALI SULLE ENCEFALOPATIE SPONGIFORMI ANIMALI. Sanremo, 6/7 novembre 2003 INTRODUZIONE

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1 VII CONVEGNO DEGLI ISTITUTI ZOOPROFILATTICI SPERIMENTALI SULLE ENCEFALOPATIE SPONGIFORMI ANIMALI INTRODUZIONE In questo inserto vengono riportati i contenuti espressi dalle diverse realtà, diagnostiche ed epidemiologiche, emerse nel corso del settimo convegno annuale degli IIZZSS sulle Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili, un incontro di formazione e verifica che il Centro di Referenza nazionale (CEA) organizza ogni anno in tema di sorveglianza delle encefalopatie spongiformi trasmissibili. svoltosi a Sanremo il 6 e il 7 novembre Una panoramica su cosa c è di nuovo nella diagnostica, nell epidemiologia, nella clinica e nella normativa delle Encefalopatie Spongiformi degli animali, un momento di confronto per i numerosi operatori coinvolti nel controllo di queste malattie, più che mai al centro dell attenzione della comunità europea. L obiettivo di questo convegno è stato di formazione e aggiornamento, ma anche di indispensabile confronto per la risoluzione degli inevitabili problemi e discrepanze di un sistema di controllo alquanto complesso ed in continua evoluzione. Sergio Andruetto Direttore Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d Aosta Maria Caramelli Centro di Referenza Nazionale per le Encefalopatie Animali - CEA I Convegno 2003

2 L EVOLUZIONE RECENTE DELLA BSE IN ITALIA F.Barizzone, M.Caramelli, M.E.Careddu, C.Gagna, F.Ingravalle, C.Maurella, G.Ru CEA Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D Aosta Scopo del presente lavoro è fornire un quadro descrittivo sulla situazione epidemiologica della BSE in Italia. I dati grezzi in possesso del CEA, riguardanti la sorveglianza epidemiologica della BSE sul territorio nazionale, sono stati analizzati tramite i software Excel 2000, Epi Info 6.04 e Stata SE 8.2. Sono stati calcolati l incidenza cumulativa (definita come casi per milione di capi di oltre 24 mesi di età), l andamento temporale dei casi e le prevalenze (definite come casi ogni test effettuati) annuali grezze, annuali standardizzate per età, mensili grezze, annuali specifiche per categoria e per età. Il periodo di tempo considerato va dall 1/1/2001 al 31/10/2003 per quanto riguarda il numero di focolai, l incidenza cumulativa e le prevalenze grezze mentre, per quanto riguarda le prevalenze specifiche e standardizzate, va dall 1/1/2001 al 30/9/2003. L analisi della distribuzione spaziale dei casi di BSE rivela come essi siano localizzati prevalentemente nel nord Italia, dove è concentrata la maggior parte della popolazione bovina da latte nazionale. Nel nordest si riscontra un eccesso di casi rispetto all atteso. Dei 114 casi italiani (di cui 110 autoctoni) solo 1 è stato identificato per mezzo della sorveglianza passiva. Il numero di test rapidi eseguiti nel 2001, nel 2002 e dall 1/1 al 31/10/2003 per il Sistema Nazionale di Sorveglianza Epidemiologica della BSE è stato di , e e i casi diagnosticati sono stati rispettivamente 48, 34 e 28 dando origine a prevalenze annuali grezze pari a 1.03, 0.46, e Le prevalenze annuali standardizzate per età, considerando classi di un anno, a partire dai 42 mesi, dimostrano come la differenza fra il 2001 (con una prevalenza pari a circa 1.4 ) e gli anni 2002 e 2003 (con prevalenze all incirca dimezzate rispetto alla precedente) sia statisticamente significativa, mentre questi ultimi due anni non differiscono in maniera statisticamente significativa fra di loro; anche le prevalenze annuali specifiche per categoria mostrano una diminuzione nel 2002 e 2003 rispetto al I macellati d urgenza risultano essere la categoria a più alta prevalenza seguiti dai morti e quindi dai regolarmente macellati. Le prevalenze mensili grezze in questi tre anni suggeriscono un andamento stagionale con un apparente aumento nei mesi più freddi. Per quanto riguarda le prevalenze specifiche per età ed anno di diagnosi è interessante notare come nel corso degli anni la classe d età a prevalenza più elevata sia passata da quella fra i 60 e i 71 mesi nel 2001 a mesi nel 2002 a mesi nel La coorte di animali che ha quindi mostrato le prevalenze più elevate, nel corso di tutti e tre gli anni, è stata quella dei nati nel In conclusione i dati in nostro possesso evidenziano delle eterogeneità nella distribuzione geografica che suggeriscono l opportunità di effettuare uno studio ad hoc. Per quanto riguarda l andamento temporale, nonostante una diminuzione rispetto al 2001, attualmente l epidemia non appare in fase calante. La prevalenza maggiore si riscontra in animali nati nel 1996, anno in cui sembra essere stato toccato il picco massimo di esposizione all agente infettante, mentre nelle successive coorti di nascita diminuisce gradualmente indicando un miglioramento della situazione epidemiologica. II Convegmo 2003

3 VARIAZIONE DI ALCUNI PARAMETRI CHIMICI NELL URINA DI OVINI CON SCRAPIE Carta P., Melis P., Vargiu M. P., Delogu A., Demurtas G., Ligios C. Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna G. Pegreffi. La scrapie presenta un lungo decorso clinico durante il quale è comunemente ritenuto che non vi siano variazioni significative di metaboliti endogeni, ormoni o enzimi nel sangue, nelle urine o in altri liquidi organici utilizzabili come marker della malattia. Tuttavia in un recente studio (Picard-Hagen et al., 2002) sono state riscontrate sia nel sangue che nelle urine di ovini con scrapie delle alterazioni dei normali valori del cortisolo e della creatinina. Scopo del presente lavoro verificare l eventuale validità dell esame chimico dell urina come ausilio diagnostico strumentale non specifico nella diagnosi clinica della scrapie. Prelievi di urina sono stati eseguiti, mediante cateterismo uretrale, su pecore con sintomi riferibili alla scrapie, a giorni alterni per un periodo di 30 giorni da 4 soggetti (gruppo A), per 22 giorni da 3 soggetti (gruppo B) ed infine per 12 giorni da 2 soggetti (gruppo C). Come controllo sono stati utilizzati campioni di urina di 10 pecore con genotipo ARR/ARR provenienti dallo stesso gregge e campioni di urina prelevati da 5 ovini affetti da Coenurus cerebralis. Su tutti i campioni di urina veniva misurato il ph e determinata la concentrazione del calcio, della creatinina, delle proteine, dell acido urico, del rame, del glucosio, del magnesio del fosforo e dell urea. Rispetto ai valori ottenuti nei controlli si sono evidenziate, negli ovini affetti da scrapie appartenenti ai gruppi A e B, differenze statisticamente significative relativamente al ph, al calcio ed alla creatinina (P<0,05). Più in particolare era osservata una diminuzione del ph (media 6,1 nei malati, 7,35 nei controlli asintomatici e 7,6 nei capi affetti da Coenurus cerebralis), un aumento della concentrazione del calcio (media 119,9 mg/dl nei malati, 52,9 mg/dl nei controlli asintomatici e 34,8 mg/dl nei capi affetti da Coenurus cerebralis), un aumento della creatinina rispetto ai controlli asintomatici ma non ai capi affetti da Coenurus cerebralis (media 156,4 mg/dl nei malati, 108,4 mg/dl nei controlli asintomatici e 149 mg/dl nei capi affetti da Coenurus cerebralis). Nel gruppo C i valori medi di questi parametri avevano rispetto ai controlli differenze simili che tuttavia non risultavano statisticamente significative. Tutti gli altri parametri esaminati non presentavano variazioni degne di rilievo. La determinazione del ph, del calcio e della creatinina potrebbe rappresentare un aiuto nella diagnosi clinica della scrapie, tuttavia sono necessari ulteriori studi che ne chiariscano il valore discriminante in presenza di altre patologie o stati fisiologici a seguito di particolari regimi alimentari. Resta inoltre da stabilire se tali variazioni siano imputabili all esistenza di un danno renale, oppure siano una conseguenza del grave stato di deperimento organico frequentemente osservato negli ovini che manifestano clinicamente la scrapie. III Convegno 2003

4 VALUTAZIONE DELL APPROCCIO CLINICO IN SORVEGLIANZA Maurella C.*, D Angelo A.**, Bona C.*, Careddu.M.E.*, Bottero P.***, Zanini A.***, Caramelli M.*, Ru G.* *CEA Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D Aosta **Università degli studi di Torino Sezione di Clinica Medica Veterinaria, ***L.P. La difficoltà dell individuazione e della segnalazione di animali che presentino una sintomatologia neurologica compatibile con una Encefalopatia Spongiforme Trasmissibile, ha fatto sì che l Italia fosse ritenuta poco attenta al problema e di conseguenza non in grado di affrontarne la minaccia. Se per ciò che concerne la BSE, i dubbi riguardo la sintomatologia neurologica possono essere ricondotti alla novità della patologia, per quanto riguarda la Scrapie ciò non vale in quanto è sicuramente una delle malattie conosciuta da più tempo e proporzionalmente meno diagnosticata. Abbiamo pensato che la carenza di segnalazioni di sospetti clinici fosse anzitutto dovuta alla mancanza di un approccio clinico strutturato e ci siamo così posti come obiettivo generale quello di individuare se nelle popolazioni bovina e ovi-caprina oggetto dello studio fossero identificabili dei segni neurologici riconducibili alle EST. L iter percorso ha visto come tappe intermedie, la creazione di un protocollo di visita fruibile sul campo, la sua standardizzazione e la valutazione dell accuratezza e concordanza dei segni clinici. Lo studio ha implicato l effettuazione di una visita neurologica a 130 pecore e l applicazione di cinque stimoli di facile e rapida esecuzione a una popolazione bovina di 1718 capi. Per entrambe le specie, è stata formulata una scheda di registrazione dei dati anamnestici e delle risposte agli stimoli, che è stata stesa in via definitiva dopo una fase pilota in cui se ne è verificata l applicabilità. I dati raccolti sono stati inseriti in database creati ad hoc e analizzati per descrivere le frequenze delle variabili, evidenziare eventuali associazioni causali e loro significatività, e pesarne l accuratezza; su due gruppi di animali (uno di pecore e uno di bovini) è stata valutatata la riproducibilità inter-osservatore (nel caso delle pecore) e quella intra-osservatore (nel caso dei bovini) della risposta agli stimoli evocati. Nel caso della popolazione ovina, considerate le peculiarità della malattia e la possibilità di usufruire spesso di dati anamnestci puntuali, abbiamo valutato il valore predittivo positivo e quello negativo di alcuni dei sintomi più caratteristici della Scrapie. Per quanto concerne gli ovini, abbiamo riscontrato la presenza di segni ricorrenti in maniera statisticamente significativa tra quelli affetti da Scrapie che coincidono con quelli descritti in letteratura e abbiamo visto che il 41% degli animali che ci erano stati indicati o che noi avevamo individuato come animali sintomatici, era effettivamente una percentuale su cui si sarebbe potuto correttamente elevare sospetto di Scrapie in quanto successivamente confermata. Abbiamo inoltre evidenziato segni clinici la cui assenza ci dà la quasi certezza di assenza di malattia (valore predittivo negativo del 92%) e ancora che vi sono alcuni sintomi che vengono letti con buona concordanza e altri la cui lettura invece deve essere standardizzata meglio. Nella popolazione bovina oggetto di studio, abbiamo evidenziato categorie di animali con una prevalenza di risposta agli stimoli nettamente più elevata rispetto ad altre e stimoli con un ottima concordanza a dispetto di altri con scarsa riproducibilità. Nonostante ci siano alcuni aspetti dei due protocolli proposti ancora da rivedere e migliorare, lo studio condotto ha dato risultati confortanti riguardo alla presenza di sintomi clinici e neurologici riferibili alle EST e alla possibilità di evidenziarli in maniera univoca se guidati da un protocollo standardizzato di facile applicabilità. IV Convegmo 2003

5 UN AGGIORNAMENTO SUI FOCOLAI DI SCRAPIE IN ITALIA Bona M.C., Caramelli M., Barizzone F., Ru G. CEA Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D Aosta La Scrapie è diventata oggi un obiettivo prioritario dell UE per l ipotesi, sperimentalmente plausibile, della circolazione dell agente della BSE nella popolazione ovi-caprina. La necessità di un efficace sorveglianza ha portato le autorità sanitarie ad attuare un programma di monitoraggio, in base al quale a partire dal 1 gennaio 2002 alla sorveglianza passiva (SP) in tutta la Comunità Europea è stata affiancata la sorveglianza attiva (SA). Con il presente lavoro si intende fornire un aggiornamento sulla situazione epidemiologica della malattia in Italia. Il periodo considerato è compreso tra il 1995 e il La diffusione della scrapie è stata descritta dal punto di vista geografico e di andamento temporale; sono stati calcolati l incidenza cumulativa per regione (numero di focolai ogni allevamenti) e le prevalenze (numero di casi positivi ogni test effettuati). In Italia la malattia è stata segnalata per la prima volta nel 1976; risale al 1995 il primo caso segnalato, da quando nel 1991 la scrapie è stata inserita tra le malattie soggette a denuncia obbligatoria. Il numero di regioni coinvolte dall epidemia è cresciuto di anno in anno: l incidenza cumulativa di allevamenti sede di focolaio indica nella Toscana e nell Emilia le regioni più interessate. La specie colpita è essenzialmente quella ovina, anche se il coinvolgimento della specie caprina ( prima segnalazione nel 1997) è importante. Durante i primi 10 mesi del 2003 sono stati identificati 26 focolai principalmente grazie alla SA. I dati di SA, riferiti al 2003 indicano che sino al 30 settembre sono stati sottoposti a test rapido piccoli ruminanti, di cui 21 sono risultati positivi ( 15 appartenenti alla categoria regolarmente macellati e 6 alla categoria trovati morti); inoltre sono stati testati animali abbattuti in sede di focolaio e tra essi il 3,9% è risultato positivo. Rispetto al numero di campioni richiesto all Italia dall UE è stato raggiunto il 78,5% dei test nella categoria degli animali morti e il 55,9% dei test nella categoria degli animali regolarmente macellati. La probabilità di trovare un caso di malattia è stata tre volte più elevata fra gli animali morti rispetti a quelli regolarmente macellati. I tassi di prevalenza si sono dimostrati più elevati nel 2002 rispetto al 2003, sia come dato grezzo che standardizzato per le tre le variabili: età degli animali, categoria di rischio ( regolarmente macellati e morti) e regione di appartenenza. Sono stati calcolati i tassi di prevalenza aziendale in differenti classi di allevamenti a seconda del numero di soggetti testati per ogni azienda; più elevati tassi di prevalenza aziendale sono stati osservati nella classe di allevamenti in cui è stato effettuato un campionamento multiplo (almeno 20 capi.). Pur essendo una malattia rara, con basse prevalenze, la scrapie appare ampiamente diffusa in tutto il territorio italiano. La SP ha dimostrato almeno in parte di funzionare, anche se negli ultimi due anni la maggior parte dei focolai sono stati individuati grazie alla SA. I più elevati tassi di prevalenza aziendale osservati nella classe di allevamenti in cui è stato effettuato un campionamento multiplo suggeriscono che il livello nazionale di prevalenza aziendale, calcolato sull insieme di tutti i test eseguiti, possa essere sottostimato e quindi in realtà la malattia possa interessare il 2% circa degli allevamenti ovi-caprini italiani. Il rischio che la BSE circoli, non riconosciuta, nella specie ovi-caprina porta oggi a gestire anche la scrapie come una zoonosi, implementando piani di sorveglianza atti alla sua eradicazione; l andamento della situazione epidemiologica dovrà essere quindi monitorato nel tempo, approfondendo lo studio delle caratteristiche che la malattia assume nel nostro Paese. Una sorveglianza più mirata allo studio dei fattori di rischio potrà consentire di identificare la migliore strategia di controllo della malattia, affiancando quelle fondate sulla selezione genetica, recentemente inserite nella normativa comunitaria europea. V Convegno 2003

6 LA VIGILANZA DEI LABORATORI TEST RAPIDI NAZIONALI Bozzetta E,Mazza M., Acutis P.L., Pinto L., Avanzato T., Nappi R., Martucci F., F. Ingravalle, Gianola C., G. Pistone, M. Caramelli CEA e Servizio Qualità Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D Aosta Il Regolamento comunitario 999/2001 indica tra i compiti dei Centri di referenza nazionali per le Encefalopatie spongiformi trasmissibili (EST) il controllo dell attività dei laboratori regionali dedicati alla sorveglianza delle EST. Questa attività di vigilanza ha un duplice obiettivo: da una parte il controllo dell attività diagnostica svolta, dall altra la dimostrazione dell efficacia del sistema di sorveglianza nazionale alla UE. Tale attività deve essere svolta sia mediante l organizzazione di prove comparative per la verifica della concordanza dei risultati ottenuti su tutto il territorio nazionale, sia mediante visite ispettive dei laboratori. Nel corso del 2003, il CEA ha organizzato con questo obiettivo un ring test nazionale destinato ai 21 dei 24 laboratori test rapidi presenti sul territorio nazionale operanti col test Prionics check western, distribuendo un set di 64 campioni con sospetto di BSE, di cui alcuni positivi a diluizioni progressive (1:2, 1:10, 1:30, 1:100).I Laboratori operanti con il test Enfer- Abbot non ha potuto essere ancora soggetto a prove comparative, a causa della mancanza di un protocollo atto a garantire la stabilità dei tessuti omogenati per la prova. Per quanto concerne invece le verifiche ispettive, il programma di verifica è stato necessariamente ispirato alla norma UNI EN ISO 19011,che stabilisce i criteri di esecuzione dgli audit o verifiche, garantendo un comportamento etico ed una presentazione imparziale dei risultati della verifica.. Tale procedura detta i comportamenti e le metodologie da adottare nel corso dell organizzazione del programma di verifica (costituzione del gruppo, presa di contatto con l organizzazione), dello svolgimento della verifica (riunione di apertura, registrazione delle informazioni, elaborazione delle risultanze dell audit, riunione di chiusura) e nei provvedimenti da adottare in base ai riscontri. La verifica si avvale di una scheda, elaborata dal CEA, che permette la registrazione di tutte le fasi e gli elementi della prova in esame: formazione del personale abilitato alle prove, condizioni dei locali, gestione dei campioni, preparazione dei campioni, attrezzature e reagenti utilizzati, interpretazione dei risultati e norme di sicurezza. Dalle risultanze delle visite ispettive svolte e del ring test, è emerso un buon livello generale nella tecnica di esecuzione del test (K medio dei risultati del ring test pari ad 0.89 con intervallo di confidenza dello 0.95), ma anche alcune criticità importanti: in primo luogo la preparazione del campione non garantisce sempre il prelievo dei nuclei di più precoce accumulo della proteina, situati a livello dell obex; inoltre la definizione di campione non idoneo non sempre è correttamente attribuita e l inserimento del risultato nel database dedicato alla raccolta dei dati risulta spesso errato. Infine, la gestione di attrezzature e reagenti non sempre è controllata come previsto dal sistema qualità: le attrezzature significative, ossia in grado di inficiare l esito della prova spesso non prevedono infatti un controllo delle prestazioni; mentre i reagenti di nuova acquisizione non vengono sottoposti a collaudo.le non conformità emerse prevedono una verifica delle cause e la messa in atto di azioni correttive e preventive. Se analizziamo le possibili cause, è certo che l aumento del numero di laboratori sul territorio (da 15 nel 2001 a 24 nel 2003), la frequente sostituzione del personale e l insufficiente formazione del personale di nuova acquisizione sono le cause più importanti coinvolte nelle risultanze delle ispezioni. È quindi indispensabile che tutti i laboratori mantengano o acquisiscano adeguati standard qualitativi, con la predisposizione di procedure scritte per la gestione di tutte le attività previste. Le azioni preventive si imperniano essenzialmente sulla formazione e sensibilizzazione costante del personale dedicato all attività di sorveglianza, alla vigilanza dell attività da parte del responsabile del laboratorio con l ausilio di frequenti controlli interni e all adeguamento delle procedure alle revisioni proposte dal CEA in base alle successive acquisizioni tecniche e scientifiche. VI Convegmo 2003

7 SORVEGLIANZA DELLA BSE: DIAGNOSI DIFFERENZIALE IN BOVINI CON SINTOMATOLOGIA NEUROLOGICA Corona C.*, Casalone C.*, Cravero GC.***, Gelmetti D.**, Crescio MI.*, Gazzuola P.*, Corci C.*, Caramelli M.* *CEA Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D Aosta; **Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia Romagna; ***ASL N 17 L attività di sorveglianza passiva riveste un ruolo di primaria importanza nella diagnosi di patologie neurologiche, oltre ad essere strumento indispensabile nell identificazione di eventuali casi di BSE. Lo scopo del presente lavoro è quello di descrivere le diagnosi effettuate nel corso del triennio su bovini con sintomatologia clinica neurologica ed in quanto tali potenzialmente positivi per BSE. Complessivamente sono stati esaminati 162 animali, in prevalenza femmine di razza Frisona, con un età compresa tra 12 mesi e 16 anni provenienti da 13 Regioni. Dopo aver escluso la positività per BSE mediante test di conferma (istologia, immunoistochimica e Western Blot) tutti gli encefali sono stati sottoposti ad esame neuropatologico ed in taluni casi sono stati eseguiti esami batteriologici o virologici. Per l esame istologico gli encefali sono stati fissati in formalina tamponata al 10% successivamente sezioni coronali di encefalo sono state incluse in paraffina e colorate con Ematossilina e Eosina. I principali quadri neuropatologici riscontrati sono stati: BSE (n 1), listeriosi (n 6), meningoencefaliti purulente (n 2), meningoencefaliti non purulente (n 4), encefaliti granulomatose (n 3), encefalopatie tossico metaboliche (n 8), neoplasie (n 2), ipoplasia cerebellare (n 1). In 51 campioni esaminati le lesioni riscontrate non erano riferibili a patologie primarie del sistema nervoso centrale mentre 56 encefali sono risultati nella norma e 4 sono stati classificati come non idonei. I risultati ottenuti in questo studio confermano quanto riportato in letteratura sia per quanto riguarda la bassa incidenza della BSE - a fronte di un solo caso confermato su 162 animali esaminati- sia per quanto concerne la distribuzione della principali patologie neurologiche nella specie bovina. Un altro risultato in accordo con quanto descritto in precedenti indagini (Vandevelde & Higgins,1991) è quello di un elevato numero di encefali in cui pur in presenza di una sintomatologia nervosa non si evidenziano lesioni significative. Ulteriori studi sono senz altro necessari al fine di approfondire le conoscenze nel campo della neuropatologia bovina ed in tale ottica l attività di sorveglianza passiva si rivela ancora una volta strumento portante per l identificazione di sospetti clinici. VII Convegno 2003

8 VALUTAZIONE DEL TEST PRIONICS CHECK-LIA PER LO SCREENING DEL SISTEMA LINFO-RETICOLARE DEGLI OVINI IN FOCOLAI DI SCRAPIE. Nappi R., Abatematteo M., Martucci F., Acutis P.L., Sbaiz L., Caramelli M., Bozzetta E. CEA Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D Aosta È ormai noto che la BSE può essere trasmessa all uomo e che alcuni ceppi di TSE possano superare la barriera di specie; inoltre, sperimentalmente, è stata dimostrata la trasmissione orale della BSE alla specie ovina con il coinvolgimento del sistema reticolo-endoteliale già in fase precoce di infezione. Pertanto, anche se gli SRM vengono specificatamente rimossi, la carne di pecora e di capra potrebbe rappresentare un rischio ulteriore per la salute umana. Da qui la necessità di avere a disposizione un test che permetta di fare una diagnosi precoce di scrapie attraverso lo screening del sistema linfo-reticolare. Per valutare l applicabilità del test sul tessuto linfatico sono stati selezionati 6 animali provenienti da focolai nazionali, risultati positivi sia al SNC con i test di conferma, sia al tessuto linfatico (tonsilla, linfonodo retrofaringeo, linfonodo sottomandibolare, linfonodo mesenterico, milza, valvola ileo-cecale, intestino tenue) con il test western-blot (metodica NaPTA). Dal momento che tutti gli animali sono risultati positivi al test rapido, il test è stato utilizzato per lo screening di un focolaio piemontese di scrapie, confrontando i risultati ottenuti con la metodica western-blot (NaPTA). Per questo studio sono stati selezionati 97 animali di razza Biellese con genotipo ARQ/ARQ (72), ARR/ARQ (11), ARQ/AHQ (9), ARQ/VRQ (4), ARQ/ ARH (1), di cui 3 positivi ai test di conferma. Per lo screening del sistema linfo-reticolare sono stati analizzati il linfonodo sottomandibolare (n = 97), il linfonodo retrofaringeo (n =66), la tonsilla (n =48), la milza (n =6) e l intestino tenue (n = 2). Al fine di garantire la confrontabilità dei risultati, i campioni di milza e intestino sono stati sminuzzati per mezzo di bisturi e ripartiti in due aliquote per i test, mentre il linfonodo e la tonsilla sono stati semplicemente tagliati a metà e ripartiti in cieco. I risultati ottenuti mostrano una concordanza tra Western-blot (NaPTA) e il test Prionics- ChecK LIA. Infine, non è stato possibile evidenziare una positività riferibile ad uno stato preclinico dell animale e, dei 3 animali (genotipo ARQ/ARQ) positivi al SNC, solo 2 sono risultati positivi al tessuto linfo-reticolare. I risultati mostrano che il test Prionics check-lia può essere considerato un valido strumento per lo screening del sistema linfo-reticolare degli ovini in focolai di scrapie. Il test ha mostrato una notevole sensibilità, tuttavia presenta delle criticità legate alle fasi della omogeneizzazione e risospensione del pellet, che possono comportare la perdita del segnale se non attentamente eseguite. Infine dei 3 animali positivi al SNC, 1 è risultato negativo al tessuto linfo-reticolare. Questi dati dimostrano che in alcuni casi l infezione potrebbe pervenire al SNC senza coinvolgere i tessuti linfatici. Ulteriori studi saranno comunque necessari per ottenere dati rappresentativi dei genotipi della popolazione ovina presente sul territorio nazionale. VIII Convegmo 2003

9 DETERMINAZIONE DELLA PrP Sc IN TESSUTI EXTRANEURALI DI OVINO MEDIANTE PRECIPITAZIONE CON NaPTA. Martucci F, Mazza M, Crescio MI, Corona C, Riina MV, Maniaci MG, Nodari S, Caramelli M, Acutis PL CEA Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D Aosta L individuazione della PrPsc nei tessuti periferici viene considerata uno strumento per la diagnosi preclinica in molti studi. Tuttavia, alcuni autori riferiscono che la PrPsc non sempre si accumula prima a livello dei tessuti linfatici che nel sistema nervoso centrale (SNC), probabilmente a causa di influenze da parte del genotipo. Inoltre in letteratura sono riportati alcuni casi di scrapie in cui la positività si evidenzia solo al SNC. L estrazione della PrPsc dai tessuti extraneurali è tecnicamente difficoltosa e i test diagnostici possono perdere sensibilità. Utilizzando un immunoblot altamente sensibile, basato sulla tecnica di precipitazione con ac. sodico fosfotungstico (NaPTA), abbiamo voluto valutare il possibile ruolo dei tessuti periferici nella diagnosi di scrapie. Sono stati analizzati 53 ovini di età superiore ai 12 mesi, di razza biellese, provenienti da focolai di scrapie, esaminati in precedenza con il test rapido Prionics Check Western (48 campioni negativi e 5 campioni positivi). Il tronco encefalico, i linfonodi della testa, la milza, la valvola ileo-ciecale di tutti gli animali e la placenta delle pecore in gravidanza avanzata sono state esaminate mediante Western blot (WB), con l utilizzo del Mab P4. Il tronco encefalico e i linfonodi della testa sono anche stati sottoposti ad analisi istologica (EE) ed immunoistochimica (IHC), con l utilizzo del Mab F99/ Per tutti gli ovini e per i feti è stato determinato il genotipo del gene della PrP. Per quanto riguarda il WB, tre dei cinque campioni positivi analizzati sono risultati positivi a livello del SNC e dei tessuti extraneurali, mentre gli altri due campioni sono risultati positivi solo al SNC; un campione negativo al test rapido ha dato esito positivo all analisi con WB (campione n. 6). I risultati ottenuti con l IHC rispecchiano i dati del WB, tranne per quanto riguarda il campione n. 6 che, analizzato con questa tecnica, è risultato negativo. L analisi genetica ha dato i seguenti risultati: ARQ/ARQ (62%), ARQ/ARR (22%), ARQ/AHQ (6%), ARR/ARR (4%), ARQ/VRQ (4%), AHQ/ARH (2%); tutti i campioni positivi sono risultati ARQ/ARQ. La tecnica di estrazione della PrP sc mediante NaPTA è stata accuratamente analizzata per valutare l effettiva capacità di separazione dell isoforma patologica della PrP da quella cellulare, con ottimi risultati; inoltre sono state effettuate prove di sensibilità del metodo mediante l utilizzo di diluizioni scalari: la tecnica ha consentito di riconoscere chiaramente il campione positivo sino a diluizioni di 1: La negatività del tessuto linfatico in due campioni positivi al SNC potrebbe essere attribuita, come riportato da altri autori, a fattori genetici o essere legata alla dose. I nostri risultati mostrano che il metodo di precipitazione con NaPTA può essere una tecnica efficace e relativamente semplice per la determinazione della PrP sc in tessuti extraneurali, tecnicamente difficili da trattare, sebbene tali tessuti non possano essere sempre considerati il sito adeguato per una diagnosi preclinica. Studio finanziato dal Ministero della Salute, Ricerca finalizzata 2001: Fattori genetici, patogenetici e biochimici responsabili della sensibilità/resistenza alle EST (1AA/F3). IX Convegno 2003

10 LA CONCORDANZA NELLE PROVE INTERLABORATORIO: ESAME ISTOLOGICO IN EMATOSSILINA-EOSINA ED IMMUNOISTOCHIMICO PER LA DIAGNOSI DI TSE. Crescio M.I..Ingravalle F, Bozzetta E., Gazzuola P, Corsi M,.Corci C, Casalone C, Ru G &.Caramelli M. CEA Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D Aosta Gli esami istologico in ematossilina-eosina (EE) ed immunoistochimico (IHC) sono due delle tre metodiche diagnostiche previste dal regolamento 999/2001/CE per le prove di conferma da eseguire sui campioni risultati positivi ai test di screening per le TSE (Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili). Per tali esami il Centro di Referenza Nazionale (CEA) prevede la verifica dell uso corretto dei metodi diagnostici mediante la periodica programmazione di ring test. Scopo del lavoro è valutare la concordanza, sensibilità e specificità relative sia all EE, sia all IHC per la diagnosi di TSE. Al ring test hanno partecipato 17 lettori, operanti nei 10 Laboratori degli IZS che prevedono un servizio di diagnostica istologica nei confronti delle TSE. Per la valutazione della concordanza, della sensibilità e della specificità sia dell IHC per la diagnosi di TSE sia dell EE si è proceduto come segue: per ogni esame è stato allestito un set di 30 vetrini colorati secondo la rispettiva metodica accreditata SINAL (per l IHC è stato utilizzato l anticorpo F99/97.6.1). I vetrini selezionati provenivano da campioni bovini od ovini, già sottoposti a tali prove diagnostiche presso il CEA nel triennio Ogni set di 30 campioni era composto da 11 positivi e 19 negativi. La riproducibilità del metodo è stata valutata mediante indice k di Cohen. La concordanza globale tra i lettori è stata stimata calcolando il valore del k overall. È stato inoltre stimato il k overall per ogni singolo lettore. Valutazione dell EE I risultati sono stati espressi, conformemente a quanto dettato dal Centro di Referenza Europeo per le TSE (VLA- Weybridge), come segue: POSITIVO: presenza di vacuolizzazione spongiosa nel neuropilo (in particolare nel nucleo del tratto solitario o del nucleo del tratto spinale del trigemino o di entrambi). NEGATIVO: assenza di spongiosi nei siti target NON CONCLUSIVO: Inadeguatezza del campione (siti target poco rappresentati o presenza di autolisi), o spongiosi del neuropilo insufficiente per una diagnosi certa. Risultati: Concordanza globale:k overall: 0,53 (IC 95%: 0,51-0,56). Sensibilità: 75%(IC 95%: 88,2-55,6 %) Specificità: 86,5% (IC 95%: 95,6-68,2 %) Se per la valutazione della concordanza si assume che il limite inferiore dell intervallo di confidenza al 95% per il k overall abbia un valore almeno pari a 0.6, il metodo è poco riproducibile, poiché solo 6 lettori su 11 rientrano nei parametri. La sensibilità del metodo, cioè la capacità di distinguere i veri positivi, è piuttosto bassa, ma si tratta di una prova di conferma e non di un test di screening; pertanto si privilegia la specificità, cioè la capacità di individuare i veri negativi, che è risultata discreta. Non desta sorpresa che la sensibilità dell EE, sia bassa: il legislatore stesso ha previsto nel REG 999/2001/CE, ulteriori esami (IHC e western blot) cui sottoporre il campione risultato negativo o dubbio all EE. La concordanza relativa all EE è, inoltre, legata all esperienza del lettore. Valutazione dell IHC: Espressione dei risultati: POSITIVO: comparsa di reazione immunoistochimica alla PrP NEGATIVO: assenza di reazione immunoistochimica alla PrP Risultati: Concordanza globale:k overall: 97% (IC 95%: %) Sensibilità: 98,9% (IC 95%: 84,1-100%) Specificità: 99,7% (IC 95%: 85,4-99,8%) Conclusioni: Il livello di k ottenuto è molto buono, l ampio intervallo di confidenza è dovuto al ridotto numero di campioni analizzati. La sensibilità e la specificità della prova sono ottime. X Convegmo 2003

11 DIAGNOSI DI SCRAPIE MEDIANTE WESTERN-BLOT ED IMMUNOISTOCHIMICA SU TESSUTI LINFATICI DI PECORE SINTOMATICHE E CLINICAMENTE SANE. Barbaro K.*, Scholl F.*, Guarducci M.*, Sala M.*, Vaccari G.**,Agrimi U.**, Conte M.**,Marcon S.**, Perfetti M.G.*, Falchi A.*, Nonno R.** * Istituto Zooprofilattico Sperimentale Lazio e Toscana; ** Istituto Superiore di Sanità Introduzione e scopo - La forma clinica della scrapie è correlata all accumulo dell isoforma patologica della PrP (PrPSc) a livello del sistema nervoso centrale, fase che avviene successivamente alla diffusione ed accumulo di PrPSc nel sistema linforeticolare (SLR). L età di comparsa della sintomatologia neurologica è condizionata dal momento dell infezione, dalla carica infettante e da un lungo periodo di incubazione la cui durata può dipendere anche dalle interazioni tra genotipo dell ospite e ceppo dell agente infettante. La scrapie presenta quindi una lunga fase preclinica durante la quale la diagnosi ufficiale, effettuata mediante ricerca della PrPSc nell obex, può risultare negativa. Metodi diagnostici in grado di rivelare la PrPSc in tessuti linfatici, come l immunoistochimica (IHC), offrono un maggior grado di precocità, ma il loro uso è precluso dalla difficoltà di utilizzo su larga scala. Per ovviare a tali difficoltà è stata impiegata una metodica rapida per la rilevazione della PrPSc mediante Western Blot (WB) in organi del SLR. Si riassumono i risultati preliminari di uno studio condotto in collaborazione tra l Istituto Zooprofilattico Sperimentale Lazio e Toscana e l Istituto Superiore di Sanità. Materiali e metodi- Lo studio è stato condotto in fasi successive: 1) sono state valutate le prestazioni del metodo WB in confronto con l IHC su organi linfatici provenienti da soggetti con sintomatologia clinica; 2) sono stati analizzati in IHC e WB i linfonodi e le tonsille di animali asintomatici positivi al test rapido (Prionics+) a livello di obex; 3) il WB, in parallelo con l IHC, è stato applicato per la diagnosi da SLR di soggetti risultati negativi all obex (Prionics -) provenienti da un focolaio di scrapie. Risultati - I risultati del WB eseguito su 7 ovini sintomatici provenienti da 2 focolai di scrapie (n=5 e n=2) hanno confermato le positività ottenute all IHC in tutti i tessuti del SLR analizzati. Il WB effettuato su tonsille, linfonodi retrofaringei e sottomandibolari di ovini pre-clinici positivi al test rapido (Prionics +) provenienti da tre focolai (n=11, n=8, n=1) è risultato positivo su 19 soggetti mentre su uno non è stata evidenziata PrPSc. È emersa una congruenza dei risultati con quelli ottenuti in IHC per gli animali nei quali è stato possibile effettuare il confronto (n=12). Infine, in 38 ovini negativi al test rapido (Prionics-) provenienti da un focolaio di scrapie con prevalenza di infezione pari all 1% (1 positivo su 100 testati), il WB e l IHC eseguiti su tonsille, linfonodi retrofaringei e sottomandibolari hanno svelato 2 ulteriori animali positivi (2/38=5,3%). Conclusioni - Il WB ha mostrato una elevata concordanza di risultati con l IHC. Il metodo è stato inoltre in grado di individuare la presenza di PrPSc in organi linfatici di ovini sia sintomatici che pre-clinici infetti da scrapie naturale. Tali caratteristiche del WB si accompagnano alla maggiore rapidità di esecuzione rispetto alla IHC prefigurando una maggior applicabilità alla diagnosi corrente di EST a partire dal SLR. Il riscontro di positività in soggetti risultati negativi al test rapido dimostra la sensibilità del WB su SLR e conferma la sua precocità rispetto al test rapido su obex. La messa a punto di metodi di facile esecuzione, in grado di rilevare la presenza di PrPSc durante la fase preclinica, potrebbe risultare di notevole ausilio nella diagnosi delle EST ovine, aprendo nuove possibilità nell ambito sia degli studi epidemiologici sulla scrapie naturale, sia delle misure di sorveglianza speciale in focolai gestiti secondo le nuove disposizioni nonchè per la conduzione degli studi patogenetici. XI Convegno 2003

12 TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DI ISOLATI DI SCRAPIE OVINA IN ITALIA. Nonno R.*, Esposito E.*, Vaccari G.*, Conte M.*, Marcon S.*, Di Bari M.*, Ligios C.**, Di Guardo G.***, Agrimi U.* *Istituto Superiore di Sanità, **Istituto Zooprofilattico della Sardegna, ***Facoltà di Medicina Veterinaria Università di Teramo. Il rischio che la BSE possa circolare, non riconosciuta, nelle popolazioni ovi-caprine europee è fortemente allarmante dal punto di vista sanitario ed apre nuovi percorsi di sorveglianza sulle Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (EST) dei piccoli ruminanti. Inoltre la rapida diffusione della BSE in diverse specie, uomo incluso, rappresenta un nuovo paradigma nello studio delle EST e del loro potenziale zoonotico ed evidenzia la necessità di sviluppare strumenti rapidi di tipizzazione dei ceppi di EST. La mancanza di un esatta conoscenza della natura dell agente responsabile delle EST impedisce però l uso dei comuni metodi microbiologici nella tipizzazione dei ceppi di EST. La discriminazione dei ceppi di scrapie si basa tutt oggi su un complesso schema di tipizzazione biologica, che però permette di differenziare la BSE dai più comuni ceppi di scrapie solo in tempi molto lunghi (> 2 anni). Recentemente sono stati utilizzati metodi rapidi di tipizzazione molecolare dei ceppi di EST in grado di distinguere diversi isolati di EST umane e di ceppi adattati a roditori da laboratorio. Questi metodi sono basati sullo studio delle caratteristiche fisico-chimiche della PrP Sc isolata da cervelli di animali affetti da EST. In particolare vengono analizzate le caratteristiche elettroforetiche della porzione proteinasi-resistente della PrPSc, con particolare riferimento al peso molecolare della forma non-glicosilata ed alla quantità relativa delle tre glicoforme della PrPSc (di-glicosilata, mono-glicosilata e non-glicosilata). Obiettivo del nostro studio è investigare la potenziale applicazione delle tecniche molecolari di tipizzazione nella sorveglianza delle EST dei piccoli ruminanti ed in particolare nel riconoscimento di possibili infezioni di BSE negli ovini e nella differenziazione dei ceppi di scrapie circolanti nel territorio italiano. A tal fine sono stati studiati 38 casi di scrapie ovina italiana a genotipo PrP noto e sono stati confrontati con un caso di scrapie inglese, 3 casi di BSE ed un campione di BSE sperimentale in pecora. Dopo parziale purificazione, la PrP Sc è stata analizzata mediante elettroforesi e Western Blot, le membrane sono state sviluppate con due diversi anticorpi, rivelate in chemiluminescenza ed esposte a lastre autoradiografiche. Per l analisi delle glicoforme, le lastre sono state digitalizzate ed analizzate tramite densitometria. Entrambi i criteri molecolari utilizzati sono stati in grado di differenziare tutti gli isolati di scrapie sia dalla BSE che dalla BSE ovina sperimentale. La BSE infatti appare caratterizzata da un elevato rapporto tra isoforme di-glicosilate e mono-glicosilate e da un basso peso molecolare della banda non-glicosilata. I casi di scrapie hanno mostrato caratteristiche molecolari molto omogenee indipendentemente dalla provenienza geografica, dalla razza e dal genotipo. Con l obiettivo di adattare tale metodologia all analisi di un maggior numero di campioni, è stato successivamente studiato l impatto di diverse variazioni metodologiche sull analisi molecolare della PrP Sc ed è stata selezionata una procedura altamente sensibile che permette una adeguata visualizzazione anche di bassi livelli di PrP Sc0 in omogenati di cervello non purificati. È stato inoltre introdotto l uso di un lettore di chemiluminescenza al fine di ottenere un analisi più accurata sia del peso molecolare che delle glicoforme. L analisi di campioni di scrapie e di BSE con queste nuove metodologie conferma ed estende, anche mediante l uso di diversi anticorpi monoclonali, i risultati precedentemente esposti. Questi risultati, pur meritando ulteriore conferma mediante l analisi di un maggior numero di casi di BSE ovina sperimentale e di scrapie, suggeriscono che la ricerca della BSE su larga scala nel patrimonio ovino possa essere effettuata con metodiche molecolari. XII Convegmo 2003

13 SELEZIONE GENETICA IN ALLEVAMENTI CON SCRAPIE NEL TRIVENETO. Aufiero G.M, Vascellari M., Magarotto R., Falcaro C., Mutinelli F. Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Legnaro (PD) Studi effettuati sul gene che codifica per la proteina prionica (PrP), la cui isoforma patologica (PrP Sc ) è un marker, se non l agente causale, comune a tutte le EST, hanno evidenziato uno stretto legame tra le forme alleliche di tale gene e la sensibilità all infezione. In particolare si è visto che il codone in posizione 136 della sequenza del gene può codificare per gli aminoacidi alanina (A) o valina (V), il codone 154 per arginina (R) o istidina (H) ed il codone 171 per arginina (R), istidina (H) o glutammina (Q). Delle 12 possibili combinazioni solo 5 alleli (A136R154R171, ARQ, AHQ, ARH e VRQ) sono stati osservati nelle popolazioni ovine europee finora analizzate. Tali alleli generano 15 possibili genotipi che, in base ai risultati degli studi genetici condotti, risultano associati ad una diversa sensibilità alla scrapie. L omozigosi ARR/ARR è associata al livello di rischio di malattia più basso, mentre l omozigosi VRQ/VRQ e ARQ/ARQ, al livello di rischio più alto. Fra questi due estremi si collocano altri genotipi con livelli di rischio intermedio. Il presente lavoro riassume quanto realizzato in due focolai di scrapie presenti nella Regione Veneto, per i quali si sono adottati piani di abbattimento su base genetica sulla base del Regolamento CE 260/2003. L analisi dei polimorfismi ai codoni 136, 154 e 171 è stata eseguita utilizzando la discriminazione allelica mediante Real Time PCR. Il DNA è stato estratto da campioni di sangue raccolti da tutti i capi presenti nei due allevamenti (2.068), utilizzando l High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche). La discriminazione allelica è stata eseguita utilizzando per ogni codone due sonde oligonucleotidiche complementari ai polimorfismi (SNP) marcate al terminale 5 con fluorofori diversi (VIC o FAM), mentre al 3 con un gruppo MGB (Minor Groove Binder) ed un quencher non fluorescente. Le differenze di degradazione delle sonde durante l amplificazione, dovute alla diversa complementarietà delle sonde, può essere letta in fluorescenza determinando quale sostituzione aminoacidica è presente. Combinando i risultati ottenuti per ogni codone si arriva a determinare il genotipo del campione in esame. Sulla base dei risultati ottenuti con l analisi genetica si è proceduto all abbattimento dei capi considerati geneticamente ad alto rischio. A tale categoria appartengono tutte le femmine il cui genotipo non presenti almeno un allele ARR e con almeno un allele VRQ. Sono stati inoltre abbattuti tutti i maschi non omozigoti per l allele ARR. L analisi genetica ha evidenziato 800 capi (39%) con genotipo sensibile all infezione da scrapie. Dei 113 arieti presenti nei due greggi, solo 17 hanno presentato il genotipo resistente ARR/ARR. Il genotipo ARR/ARQ è risultato quello maggiormente presente nei due allevamenti (42%), mentre tra quelli considerati sensibili all infezione l ARQ/ARQ è il maggiormente rappresentato (25%). L analisi delle frequenze alleliche ha rilevato per l allele VRQ una frequenza del 3.89% mentre l allele ARR presenta una frequenza del 41%. Degli 800 capi abbattuti, 620 sono stati sottoposti a test rapido Prionics Check-Western perché superiori ai 18 mesi. L analisi ha portato a rilevare 21 campioni positivi che non presentavano sintomatologia nervosa, la maggior parte dei quali con genotipo ARQ/ARQ (n=17). La normativa Europea (Decisione 2002/ 1003/CE; Decisione 2003/100/CE; Regolamento CE 260/2003), definisce la selezione genetica per i caratteri di resistenza alle EST come l asse portante della gestione sanitaria EST degli ovini. A tale proposito l analisi genetica ha permesso di fornire dati preliminari sulla distribuzione dei polimorfismi del gene della PrP nelle pecore di razza Massese. La bassa frequenza dell allele VRQ (<4%), e l alta frequenza dell allele ARR indicano che la selezione genetica può essere un approccio favorevole alla gestione dei focolai di scrapie. XIII Convegno 2003

14 DISTRIBUZIONE DELLA PrP Sc NEL TESSUTO LINFATICO E NERVOSO DI PECORE DI RAZZA MASSESE IN UN FOCOLAIO DI SCRAPIE. Vascellari M., Aufiero G.M., Basilicata L., Marchioro W., Caldon M., Falcaro C., Bozza M.A., Mutinelli F. Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Legnaro (PD) La distribuzione della PrP Sc nei tessuti linfatico e nervoso di pecore affette da scrapie è oggetto di studio al fine di approfondire la patogenesi della malattia. Nella scrapie naturale il tratto digerente è considerato la via di infezione più frequente e le sedi più precoci in cui si può reperire la PrP Sc sono le placche del Peyer, i linfonodi meseraici, la tonsilla, i linfonodi retrofaringei, la milza ed il tessuto linfatico annesso alla terza palpebra. Nel presente studio sono stati considerati due focolai di scrapie in pecore di razza Massese, la cui gestione è stata effettuata mediante abbattimento selettivo su base genetica, al fine di valutare da un punto di vista immunoistochimico la presenza della proteina prionica in alcuni organi linfatici e nel tessuto nervoso. I soggetti con genotipo sensibile sono stati abbattuti e quelli di età superiore a 18 mesi (637 capi) sono stati sottoposti al test rapido sull obex (Prionics Check-Western ), utilizzando 2 diversi anticorpi monoclonali: 6H4 e P4. Da questi animali sono stati prelevati obex, tonsilla, linfonodo retrofaringeo e terza palpebra, immediatamente fissati in formalina tamponata al 10%, pretrattati con acido formico al 98% per 1 ora a temperatura ambiente, routinariamente processati ed inclusi in paraffina. Tutti i campioni prelevati dalle pecore positive ed i linfonodi retrofaringei di 235 pecore negative sono stati testati con metodica immunoistochimica utilizzando l anticorpo monoclonale F99/ Nei casi di positività linfonodale in pecore negative al test rapido, sono stati successivamente testati anche obex, tonsilla e terza palpebra. Ventuno capi sono risultati positivi al test rapido sia con l anticorpo 6H4 sia con il P4. L anticorpo P4 ha identificato 3 ulteriori casi di positività, non rilevati dal 6H4. Delle 24 pecore positive al test rapido, 15 sono risultate positive in tutti gli organi considerati, 6 sono risultate positive nell obex, tonsilla e linfonodo retrofaringeo, e 3 sono risultate positive nell obex e negative in tutti i tessuti linfatici considerati. Dei 235 soggetti negativi al test rapido, 7 sono risultati positivi all immunoistochimica nei follicoli del linfonodo retrofaringeo. Di questi, tutti sono risultati positivi in sede tonsillare, 2 hanno dimostrato depositi di PrP Sc nel tessuto linfatico annesso alla terza palpebra e 4 sono risultati positivi all obex. Il confronto tra i due anticorpi utilizzati nel test rapido sembrerebbe evidenziare una maggiore sensibilità dell anticorpo P4 nei confronti della scrapie rispetto al 6H4. I risultati dell indagine immunoistochimica concordano con le ipotesi patogenetiche che individuano i tessuti linfatici annessi al tratto digerente quali organi bersaglio nelle fasi iniziali dell infezione da scrapie. L individuazione di alcuni casi di positività immunoistochimica dell obex, non rilevati dal test rapido, suggerisce inoltre una maggior sensibilità della tecnica immunoistochimica. La totale concordanza dei risultati fra tonsilla e linfonodo retrofaringeo indica che entrambi possono essere idonei per la diagnosi precoce di scrapie. La terza palpebra sembra invece meno adatta quale organo di scelta per uno screening diagnostico. Infatti, presenta maggiori difficoltà di prelievo e lavorazione in immunoistochimica, la quantità di tessuto linfoide è molto minore, come anche il riscontro di campioni positivi rispetto a tonsilla e linfonodo retrofaringeo. XIV Convegmo 2003

15 ADOZIONE DEI PROTOCOLLI DI ERADICAZIONE DELLE EST OVINE MEDIANTE CRITERI SELETTIVI IN LAZIO E TOSCANA. Sala M., Scholl F., Marconi P., Lorenzetti R., Amaddeo D., Indino E., Fanelli R., Perfetti M.G. Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e della Toscana (IZS-LT) Introduzione e Scopo - La selezione per i caratteri di resistenza genetica (Dec. 2003/100/CE) costituisce l asse portante della nuova gestione sanitaria delle encefalopatie spongiformi trasmissibili (EST) degli ovini nell ambito dell Unione Europea (UE). Nel corso del 2003 l IZS-LT ha adottato procedure di eradicazione della scrapie secondo criteri selettivi (Reg. 260/2003/CE), sulla base di protocolli di eradicazione concordati con il Ministero della Salute ed il CEA di Torino. Ne vengono qui rappresentati i risultati. Metodologia - Sono stati definiti protocolli di eradicazione finalizzati alla elminazione delle fonti di infezione (abbattimento e distruzione dei soggetti positivi al test rapido) nonché alla prevenzione delle recrudescenze attraverso: 1) rimozione dei soggetti recanti genotipi sensibili (privi dell allele ARR o recanti allele VRQ); 2) ricostituzione degli effettivi con soggetti di genotipo resistente. Solo gli arieti omozigoti ARR/ARR sono stati autorizzati all attività riproduttiva. Accanto alle misure di selezione sono state adottate procedure di monitoraggio intensificato degli eventi inattesi (positività al test rapido in soggetti di genotipo resistente) attraverso esecuzione del test rapido su tutti i capi rimasti in allevamento successivamente agli abbattimenti selettivi, qualora venuti a morte (se di età superiore ai 12 mesi), e sui capi progressivamente destinati alla macellazione. Sono state previste la sospensione immediata del piano e l adozione dello stamping-out in caso di riscontro di positività in soggetti ARR/ARR o in caso di caratterizzazione molecolare delle PrPsc compatibile con BSE. I protocolli sinteticamente illustrati sono stati attuati nel corso del 2003 in tre focolai di scrapie, individuati nel corso dell anno 2002 nell ambito del piano di sorveglianza nazionale per le EST: focolaio 1 n=577 (index case= 1 capo sintomatico ARQ/ARQ); focolaio 2 n=565 (index case = 1 capo morto in azienda ARQ/ARQ); focolaio 3 n=295 (Index case = 1 capo regolarmente macellato ARQ/ARQ). Risultati - Sono stati esaminati 1437 campioni di sangue prelevati da ovini di razza sarda. Ad oggi, sono state completate le fasi relative al test rapido a campione, alla genotipizzazione dell effettivo ed all abbattimento dei capi recanti genotipo sensibile alle EST. Nel complesso è stata confermata una elevata frequenza complessiva dell allele ARR, superiore al 60%, di cui oltre il 13% in condizione di omozigosi ARR/ARR e circa il 50% in eterozigosi ARR/ARQ ed ARR/AHQ. Fra gli alleli correlati ad una maggiore suscettibilità alla scrapie, la frequenza maggiore è rappresentata dall allele ARQ (>56%) mentre la configurazione VRQ ha mostrato frequenze molto basse (<0,1%). Tale situazione è risultata sovrapponibile nei 3 focolai. Per le aziende 1 e 2 non sono emerse altre positività nell ambito del campionamento, oltre ai singoli index cases rilevati all apertura dei focolai. Per l azienda 3 il campionamento è tuttora in corso. Alcuna ulteriore positività è finora stata riscontrata in soggetti venuti a morte in azienda. Conclusioni I protocolli adottati hanno consentito di conservare circa i 2/3 degli effettivi aziendali confermando l applicabilità dell approccio selettivo nella gestione dei focolai di EST per la razza Sarda. Tuttavia emerge una carenza di riproduttori maschi utilizzabili direttamente ai fini del ripopolamento. La disponibilità di tale classe di animali rappresenta un fattore determinante per la progressione ed il successo delle misure di eradicazione selettiva. Emerge, quindi la necessità di costituire su base territoriale un adeguato parco di arieti resistenti (ARR/ARR) sostenendo l adozione dei piani di allevamento delle razze ovine per i fattori di resistenza alle EST (Dec. 2003/100/CE). XV Convegno 2003

16 CONSIDERAZIONI SUL PIANO DI SORVEGLIANZA NAZIONALE BSE NELLA REGIONE CAMPANIA. Caligiuri V*., Barca L.**, Giuliano G.A.**, Degli Uberti B.*, Valentino M.P.*, Di Sarno A.* *Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno (IZSM) **Osservatorio Epidemiologico Veterinario della Regione Campania (OEVRC) Scopo del presente lavoro è fornire dati relativi all attività di sorveglianza per la BSE, eseguita dalla Regione Campania a partire dal 01/01/2001 secondo quanto previsto dalla normativa vigente. Il numero dei campioni pervenuti in Istituto nel periodo preso in esame rende particolarmente significativo il lavoro presentato in quanto espressione di un intensa attività territoriale rispetto all andamento del Piano di Sorveglianza Nazionale. Le elaborazioni effettuate forniscono oggi un data-base di riferimento per la Regione Campania che dispone così di un quadro schematico del patrimonio bovino bufalino presente sul territorio e delle relative macellazioni. Gli esami eseguiti si riferiscono ai controlli effettuati su tronco encefalico bovino e bufalino mediante il test rapido Prionics Check nel periodo compreso tra il 01/01/01, data dell entrata in vigore del Piano di sorveglianza attiva tramite l utilizzo del test rapido, ed il 30/07/03. I dati analizzati derivano dal sistema informativo dell IZSM per quanto riguarda i test eseguiti in Campania, mentre per le macellazioni di origine campana eseguite fuori regione si è usufruito della banca dati del CEA. I dati relativi alla consistenza e alle caratteristiche della popolazione bovina-bufalina della regione Campania sono stati ottenuti dall archivio dell Osservatorio Epidemiologico Veterinario della Regione Campania (OEVRC). I dati riguardanti le macellazioni sono stati estrapolati dall anagrafe della Banca Dati Nazionale. In tutto il periodo di riferimento presso il laboratorio BSE dell IZSM di Portici sono stati esaminati complessivamente animali (bovini/bufalini), (6,6% dell ammontare nazionale degli esami), di cui regolarmente macellati e appartenenti alle categorie a rischio BSE. I capi macellati in Campania provengono per il 73,4% da allevamenti situati nel territorio regionale, per il 25,5% da allevamenti extraregionali, ed una piccolissima parte (1,1%) di provenienza estera (Belgio 25,74%, Francia 23,71%, Austria 22,27%, Germania 21,76%).Sono stati individuati due casi autoctoni di positività al test rapido nel 2003 ed un caso positivo di bovino proveniente da fuori regione nel 2001, tutti confermati dal Centro di Referenza Nazionale per le TSE (Transmissible Spongiform Encephalopaty) (Centro Encefalopatie Animali, CEA, Torino). L accertamento, in particolare, di due focolai verificatisi nella provincia di Caserta ha evidenziato una incidenza della malattia pari al 51.3 di casi per milione di capi nell anno 2003, valore che in ambito nazionale ci pone in una fascia di incidenza molto elevata. L indagine epidemiologica relativa ai due focolai non ha permesso di stabilire l origine della malattia; le due bovine positive sono entrambe nate nell azienda focolaio e la probabile somministrazione di mangimi contenenti farine animali non risulta, però, confermata da opportune documentazioni. Ad oggi in Campania, a fronte di una inconsistente attività di segnalamento dei casi sospetti e dei morti, il sistema di sorveglianza attiva, che controlla animali regolarmente macellati e animali cosiddetti a rischio, resta l unico strumento efficace per l eradicazione della malattia. La sorveglianza passiva, basandosi esclusivamente sulla specificità della diagnosi clinica e sul grado di sensibilizzazione dei veterinari e degli allevatori nel rilevare e quindi segnalare gli animali con sintomi compatibili con la BSE, potrebbe essere un punto debole della sorveglianza. Ciò richiederebbe quindi l esecuzione di ulteriori sforzi mirati da parte dei Servizi Veterinari regionali ad incentivare un sistema di sorveglianza passivo, come misura di controllo ordinario che possa sostanzialmente integrare la sorveglianza attiva. XVI Convegmo 2003

17 ANDAMENTO DEL PIANO DI SORVEGLIANZA NAZIONALE SCRAPIE NELLA REGIONE CAMPANIA. Di Sarno A., Valentino M.P., Spadari M.L., Barca L., Vitale V., Solimene F. Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno (IZSM), Osservatorio Epidemiologico Veterinario della Regione Campania (OEVRC) Scopo del presente lavoro è fornire dati relativi all attività di sorveglianza per la Scrapie eseguita nella Regione Campania secondo quanto previsto dalla normativa vigente. Sono stati presi in considerazione i controlli effettuati su tronco encefalico di ovi-caprini di età superiore ai 18 mesi regolarmente macellati e appartenenti a categorie a rischio (morti in stalla, sospetti), mediante il test rapido Prionics Check, nel periodo compreso tra il 01/01/02 ed il 30/07/03. I dati utilizzati per l elaborazione sono quelli rilevati dal sistema informativo dell IZSM per gli esami effettuati nel laboratorio di diagnostica BSE. Il CEA ha fornito i dati relativi agli esami effettuati da altri IZS su ovi-caprini provenienti dalla regione Campania e macellati fuori regione. I dati relativi al patrimonio ovi-caprino della regione ed alle caratteristiche della popolazione sono derivati dai piani di profilassi e di sorveglianza e sono raccolti ed elaborati dall Osservatorio Epidemiologico della Regione Campania. Complessivamente, nel periodo considerato, sono stati sottoposti a test rapido presso l IZSM di Portici 5873 capi di cui 4768 provenienti da aziende campane, ed i restanti provenienti da fuori regione. Circa 50 capi, appartenenti ad aziende campane già testate, sono stati macellati fuori regione e quindi analizzati presso altri Istituti Zooprofilattici. In particolare i capi testati distinti per specie sono 485 caprini (8,3%) e 5388 ovini (91,7%). In totale sono state campionate 714 aziende (pari al 7,7% del patrimonio regionale) con una media di 4 capi testati per azienda nel 2002 e 10 capi nel I tronchi encefalici sono stati prelevati su animali regolarmente macellati nel 83,5% dei casi e su animali appartenenti alle categorie a rischio per il restante 16,5%. I capi testati in Campania per il solo anno 2003 sono 3177, pari a 1,2% della popolazione adulta stimata. Solo i dati relativi al primo semestre 2003, sono stati utilizzati per fare un calcolo della prevalenza della malattia in Campania dal momento che nel periodo si sono verificati due focolai e che il patrimonio ovi-caprino autoctono si è leggermente ridimensionato rispetto all anno precedente. I due focolai campani si sono verificati nelle province di Caserta e Salerno, laddove il patrimonio è più consistente. Sono risultati tre capi positivi di cui due ovini appartenenti alla stessa azienda e un caprino proveniente da un allevamento misto ovi-caprino. Da questi dati la prevalenza nelle due province risulta essere rispettivamente dello 0.19% e del 0.1%. In entrambi i focolai non sono stati evidenziati particolari fattori di rischio per TSE. L eradicazione dei focolai è stata effettuata mediante abbattimento e distruzione di tutti i capi presenti in azienda. Tutti i capi superiori a 18 mesi sono stati testati con il test rapido, che ha dato esito negativo e per tutti i soggetti si è proceduto al prelievo di sangue per la genotipizzazione. Finora sono stati tipizzati 15 capi e da una prima analisi dei risultati ottenuti si evince che il 26,6% degli animali esaminati, presenta un genotipo ARQ/ARQ ed il 46,6% presenta genotipo ARR/ARR. A circa due anni dall inizio del piano, possiamo fare alcune considerazioni. La sorveglianza attiva ha consentito di svelare la presenza della malattia, con la messa in evidenza di tre casi positivi che altrimenti sarebbero sfuggiti alla diagnosi. La prevalenza attesa in Campania in base al campionamento era dello 0,09% (limiti fiduciari 0,02 e 0,3), e coincide esattamente con quella stimata sulla base del numero degli animali positivi rispetto agli animali controllati. A questo punto si potrebbe cominciare a pensare di rivedere le modalità di campionamento nella nostra regione, poiché considerata la bassa prevalenza intra-aziendale (0,7%), questo dovrebbe essere mirato, non tanto ad aumentare il numero dei prelievi da effettuare al macello in maniera casuale, ma quanto a stabilire il numero degli animali da testare per ciascuna singola azienda in considerazione della sua consistenza e dislocazione sul territorio. XVII Convegno 2003

18 BINDING OF RECOMBINANT PrP TO HUMAN PLASMINOGEN: KINETIC AND THERMODYNAMIC STUDY USING A RESONANT MIRROR BIOSENSOR. Cuccioloni M*, Eleuteri AM*, Amici M*, Sparapani L*, Biagetti M**, Barocci S** e Angeletti M* *MCAB Università di Camerino ** Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell Umbria e delle Marche Le Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (TSE) sono malattie neurodegenerative fatali che colpiscono uomini ed animali. Nelle TSE una normale proteina cellulare (proteina prionica, PrPc), diffusa in gran parte dell organismo, è convertita in un conformero insolubile (PrP Sc ), ricco di _-sheet e resistente a trattamenti con proteinasi K, che si accumula principalmente nel sistema nervoso centrale, causando la malattia. SCOPO In lavori precedentemente pubblicati, è stata data evidenza dell interazione del plasminogeno, una proproteasi serica, unicamente con l isoforma patologica PrPsc, aprendo la possibilità di utilizzo diagnostico di questa proteina del sangue. Per capire meglio la natura dell interazione citata, in questo lavoro è stato riportato uno studio dettagliato tramite il biosensore IAsys plus. Sono stati analizzati i parametri cinetici e termodinamici caratterizzanti l interazione fra plasminogeno umano e PrPc ricombinante (25-242), non glicosilata, in un ampio intervallo di ph. METODOLOGIA Il plasminogeno umano, dopo inattivazione e purificazione, è stato immobilizzato su una superficie CMD. L esperimento di legame fra plasminogeno e PrPc è stato ripetuto a concentrazioni crescenti di quest ultima. I passaggi di rigenerazione sono stati eseguiti utilizzando PBS-T, in quanto i detergenti influiscono sulle proprietà di legame della PrPc. RISULTATI I dati di legame sono stati analizzati con il software Fast Fit (Fison Applied Sensor Technology). I risultati rivelano un interazione ad alta affinità fra le specie prese in esame. Il ph influisce grandemente sulla cinetica di associazione e, meno significativamente, sulle proprietà di dissociazione delle due specie. Le due macromolecole si associano più facilmente a ph 7.2, mentre presentano una migliore dissociazione nell intervallo fra 6.2 e 6.6. L analisi di legame suggerisce il coinvolgimento di un residuo di HIS. Le analisi in western blotting (metodica Prionics-Check Western ) eseguite con varie diluizioni di PrPc e plasminogeno (incubate alla stessa concentrazione), trattati con proteinasi K, evidenziano che la proteina serica sembra modificare la conformazione della proteina prionica, rendendola parzialmente resistente alla proteasi utilizzata. CONCLUSIONI Il lavoro presentato suggerisce che, nelle condizioni sperimentali adottate, volutamente più vicine possibili alla situazione fisiologica, esiste una forte interazione fra plasminogeno umano e recprpc bovina. Il plasminogeno potrebbe agire da promotore della modificazione conformazionale di PrPc in PrP sc, infatti, dato che la glicosilazione maschera quasi completamente ampie aree della proteina e conferisce stabilità conformazionale alla proteina normale, causando un ritardo nella conversione, la PrPc bovina ricombinante, espressa in E. coli come proteina non glicosilata, dovrebbe perdere l effetto protettivo esercitato dai gruppi oligosaccaridici, risultante in un aumento della velocità di conversione. XVIII Convegmo 2003

19 VALUTAZIONE DELL IMPORTANZA DEL PRELIEVO DI TESSUTI LINFATICI NELLA SORVEGLIANZA SULLA SCRAPIE IN OVINI DI RAZZA SARDA. Carta P.*, Ru G.**, Melis P.*, Vargiu M.P.*, Delogu A.*, Ligios C.* *Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna G. Pegreffi. **CEA, Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte Liguria e Valle d Aosta Secondo il Regolamento 999/2001 e successive modifiche, nell ambito della sorveglianza attiva per la scrapie degli ovini è previsto l esame mediante test rapidi dell obex al quale, nei campioni risultati positivi, deve seguire la conferma con esame istologico ed immunoistochimico. Considerato che nella patogenesi della scrapie l accumulo di PrPSc si ha prima a livello del sistema linfatico e poi del sistema nervoso centrale (SNC) è ipotizzabile che, nell ambito di un piano di sorveglianza, l esame immunoistochimico per la evidenziazione del PrPsc su determinati tessuti linfatici permetta di riscontrare un numero maggiore di ovini affetti da scrapie. Al fine di verificare questa ipotesi sono stati esaminati 610 ovini provenienti da 5 greggi colpiti da scrapie. Di questi ovini 590 erano asintomatici e 20 erano clinicamente malati. Da ciascun capo sono stati prelevati l obex e le tonsille palatine che erano fissati in formalina, processati secondo tecniche routinarie e colorati immuno-istochimicamente utilizzando un anticorpo monoclonale anti PrP Sc (34C9, Prionics AG, CH). Nei capi controllati l esame immunoistochimico risultava positivo a livello dell obex in 43 soggetti, della tonsilla in 34 e dell obex e/o della tonsilla in 46. In 31 ovini il PrPsc era riscontrato contemporaneamente sia nella tonsilla che nell obex. I risultati sono stati statisticamente elaborati sia calcolando il valore del Kappa di Cohen, al fine di valutare la concordanza tra l esame immunoistochimico dell obex e quello della tonsilla, che confrontando, mediante il calcolo del Chi quadro di McNemar, le prevalenze dei positivi ottenuti con due strategie alternative: (1) esame obex; (2) esame obex e tonsilla. Si è osservata una concordanza fra i risultati ottenuti con il solo esame immunoistochimico dell obex e quelli ottenuti con il solo esame della tonsilla (Kappa di Cohen= 0,79). Considerando i capi risultati positivi esaminando il solo obex (n 43) si riscontrava una prevalenza della scrapie del 7,1% (IC95% 5,2 9,4) mentre considerando quelli riscontrati positivi esaminando anche la tonsilla (n 46) la prevalenza della scrapie raggiungeva il 7,5% (IC95% 5,6 9,9). Tuttavia, la differenza tra tali prevalenze non è risultata statisticamente significativa (Chi quadro di McNemar = 3,0 - P = 0,083). Sulla base dei nostri risultati, si può affermare che l applicazione dell esame immunoistochimico anche sulle tonsille oltre che sull obex non aumenta in modo statisticamente significativo la prevalenza dei capi positivi identificati e dunque la sensibilità dello stesso esame. XIX Convegno 2003

20 SORVEGLIANZA PASSIVA DELLA BSE IN LOMBARDIA NEL PERIODO GENNAIO 2002-SETTEMBRE 2003: ANALISI MULTIVARIATA DEI RISULTATI DI NEUROPATOLOGIA E DI IMMUNOBIOCHIMICA. Gelmetti D., Gibelli L., Peletto S., Carra E., Capucci L., Tranquillo V.M., Bonacina C. Istituto Zooprofilattico della Lombardia e dell Emilia Romagna, Università degli Studi di Milano. L epidemia di BSE in Inghilterra, iniziata nel 1986, ha portato in primo piano la necessità di vigilare sulle patologie neurologiche della specie bovina e bufalina. A seguito dell applicazione del Piano regionale di segnalazione dei casi sospetti d infezione da BSE negli animali presenti sul territorio della regione Lombardia (D.D.U.O. n del 30/11/2001) nel periodo compreso tra gennaio 2002-settembre 2003, sono stati segnalati 100 casi di animali con sintomatologia neurologica per i quali non è stato possibile escludere la diagnosi di BSE. Scopo del lavoro è quello di riportare i risultati dell indagine di neuropatologia e di immunoblot e di valutare la relazione tra le diagnosi raggiunte e i sintomi clinici neurologici mediante analisi delle corrispondenze multiple (MCA). Materiali e metodi Nel periodo gennaio 2002-settembre 2003, sono stati conferiti all IZSLER 100 encefali bovini appartenenti ad animali di razza Frisona e Bruna Alpina, di età compresa tra i 3 e i 13 anni di cui la classe più numerosa era distribuita tra i 3 e gli 8 anni. Ciascun caso sospetto era completato da scheda clinica neurologica per il rilevamento dei sintomi (all. 1 del D.M. 7 gennaio 2000). Tutti i campioni sono stati sottoposti al test rapido Prionics Western Blot e, dopo fissazione in formalina tamponata al 10%, sottoposti ad esame neuropatologico secondo le normali procedure in uso. Approfondimenti diagnostici eziologici sono stati eseguiti con la colorazione immunoistochimica usando il sistema biotinilato-streptoavidina. Le relazioni tra i sintomi, e tra questi e la classificazione istopatologica dei casi, è stata esplorata attraverso l uso della Multiple Correspondence Analysis (MCA). Risultati Novantanove campioni esaminati in WB sono risultati negativi. 1 campione è risultato positivo per la ricerca per la ricerca della PrPres, caso confermato BSE dal CEA. All esame neuropatologico 1 campione non era idoneo, 77 casi sono stati classificati nel Profilo Normale, 12 casi sono stati classificati nel Profilo Infiammatorio e 6 casi sono stati classificati nel Profilo Degenerativo. L elaborazione statistica con metodo MCA ha messo in evidenza che le modificazioni del comportamento, della postura e dell andatura si distribuiscono in modo caratteristico in ciascun profilo istologico. Conclusioni La sorveglianza passiva della TSE si basa sulla segnalazione dei casi clinici neurologici. L esperienza lombarda (2002-settembre 2003) evidenzia che nella maggior parte dei casi non si osservano lesioni neuropatologiche (77). Questo risultato potrebbe essere imputabile alla difficoltà di riconoscere i segni clinici propri delle patologie neurologiche e all attribuzione di cause neurologiche a sintomi di sofferenza generica. La valutazione statistica effettuata con il sistema MCA distribuisce i numerosi sintomi raccolti con le schede neurologiche e permette di attribuire, in base alle distanze tra i singoli livelli, delle associazioni che avvalorano le osservazioni cliniche. Il sistema MCA, pur non avendo identificato un quadro clinico definito associabile a ciascun profilo istologico ha mostrato una distribuzione dei sintomi caratteristica. Il rilievo della temperatura, dei dati sulla produzione del latte, la conservazione dell appetito in funzione del calo di peso potrebbero ulteriormente concorrere a caratterizzare dei quadri clinici. Il sistema di sorveglianza attiva garantisce attualmente il controllo della malattia e la tutela della salute dei consumatori. È tuttavia ipotizzabile che in futuro questo tipo di controllo possa essere ridotto o sospeso. L individuazione di profili clinici predittivi associata al segnalamento delle patologie neurologiche renderà ugualmente possibile evitare contaminazioni della filiera produttiva a salvaguardia della salute pubblica. XX Convegmo 2003