ANTICORPI. T regolatori e/o suppressor LINFOCITI

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Gennara Quarta
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1 specifica-elementi di riconoscimento immunità umorale ANTICORPI innata-elementi effettori COMPLEMENTO immunità cellulare LINFOCITI LINFOCITI LINFOCITI LINFOCITI T helper T regolatori e/o suppressor T citotossici B CELLULE PRESENTANTI L'ANTIGENE MONOCITI-MACROFAGI NATURAL KILLER GRANULOCITI NEUTROFILI GRANULOCITI EOSINOFILI MASTOCITI/BASOFILI

2 L ORGANIZZAZIONE e e LE LE CELLULE DEL DEL SISTEMA IMMUNE -Il -Il sistema immune organizza tessuti linfoidi periferici idonei allo allo svolgimento dei dei processi immunitari -Il -Il sistema richiede: -- alta alta capacità di di ricircolo delle delle cellule dell immunità :: linfociti, macrofagi, APC APC -capacità delle delle cellule del del sistema di di cooperare -necessità di di amplificare i i segnali anche deboli -promuovere la la regolazione della della risposta

3 L'origine emopoietica delle cellule del sistema immune

4 L'immunità specifica umorale (gli (gli anticorpi sierici), oltre a essere facilmente trasferibile in in individui non immunizzati, sono utili nella pratica medica (siero profilassi), gli gli anticorpi anticorpi sierici sierici rappresentano attualmente attualmente uno uno strumento strumento indispensabile per per lo lo studio studio dei dei componenti componenti biologici biologici e e dei dei processi processi normali normali e e patologici patologici PER PER LA LA CONOSCENZA DEI DEI MECCANISMI BIOLOGICI E PATOLOGICI NELLA DIAGNOSTICA CLINICA

5 MARCATORI DI DI LINEA LINEA LINFOIDE LINFOIDE MARCATORI MARCATORI DI DI LINEA LINEA DIFF.DELLE DIFF.DELLE CELLULE CELLULE B B le molecole presenti sulla superficie cellulare sono utilizzati come antigeni per ottenere anticorpi specifici

6 MARCATORE DI DI DIFFERENZIAMENTO MARCATORE DI DI ATTIVAZIONE

7 Citometria Citometriaaaflusso flussocontinuo continuo scattered LASER 488nm fotomoltiplicatore Convertitore analogico/ digitale Computer Forward Flusso liquido = velocità delle cellule costante

8 Separazione su grafico per dispersione 1000 scattered Forward 1000

9 Citometria Citometria aa flusso flusso continuo continuo scattered LASER 488nm fotomoltiplicatore Forward Flusso liquido = velocità delle cellule costante Convertitore analogico/ digitale Computer

10 1000 scattered 1000 GATE CANALI di fluorescenze Forward Canale rosso chiaro Canale verde 1000

citofluorimetro Gli anticorpi sono indispensabili per mettere in

11 L'utilizzo L'utilizzo di di anticorpi anticorpi nell'analisi nell'analisi del del fenotipo fenotipo cellulare cellulare il citofluorimetro Gli anticorpi sono indispensabili per mettere in evidenza le espressioni di molecole per cellula riconoscibili in citofluorimetria a flusso continuo

12 Applicazioni del citoflurimetro a flusso Conteggio degli elementi positivi al marcatore specifico: superficiale Intracitoplsmatico Nucleare (es fattori trascrizionali) Misura delle intensità della positività per cellula (evento) Separazione delle cellule positive (evento)

13 Tecniche per lo studio delle cellule Tecniche istologiche Immunoistochimica Tecniche citologiche Immunoflurescenza in microscopia confocale Elettronmicroscopia ed immunoelttronmicroscopia Tecniche biochimiche: enzimologia, struttura delle molecole Tecniche biologia cellulare: coltura cellulare Tecniche di biologia molecolare scaricato da

14 B cell progenitor CD117, CD43 HSC CD34 + CD34 - PLC CD34, CD117, CD33 T cell precursor CD7, CD1 MyeloidSC CD34,CD33, HLADR

15 immunità specifica cellule specifiche vergini effettrici memoria accessorie per per la la fase fase di di riconoscimento di di attivazione attivazione effettrice effettrice

16 I Linfociti ELEMENTI DERIVATI DAL MIDOLLO OSSEO : GLOBULI BIANCHI mm Il ruolo nell immunità : i linfociti trasferiscono l immunità immunodeficienze congenite ed acquisite presentano alterazioni a carico delle popolazioni linfocitarie (quantitative qualitative) presenza ed aumento dei linfociti nelle sedi della risposta antigeni in coltura stimolano i linfociti come in vivo presentano sulla superficie recettori specifici per gli antigeni

17 Morfologia Morfologia dei dei linfociti linfociti LINFOCITI LINFOCITI NATURAL NATURAL KILLER KILLER large granular lymphocytes da 9-10 micrometri a micrometri

20 Le classi di linfociti classe funzioni recettore di superfice LINFOCITI B produzione di anticorpi IMMUNITÀ UMORALE Anticorpi di membrana BCR marcatori fenotipici Fc IIb CD32B HLA-DR (MHCII) CD19, CD20 CD21 sangue linfonod milza i

21 classe funzioni recettore di superfice LINFOCITI T helper citotossici -stimolazione della crescita e del differanziamento dei linfociti B L.adiuvanti -attivazione dei macrofagi e secrezione di citochine IMMUNITÀ CELLULO-MEDIATA L.infiammatori -associato alle barriere cute e mucose attivazione della risposta immune Attivazione dei macrofagi IMMUNITÀ CELLULO-MEDIATA Lisi cellulare nelle infezioni da virus, antitumorale IMMUNITÀ CELLULO-MEDIATA marcatori fenotipici TCR CD3; CD rispetto ai linf.b TCR TCR NKT Immunità naturale e regolazione TCR ο Natural Killer lisi delle cellule infettate antitumorale CD3, CD4 CD3 TCR CD3, CD8 KIR, KAR, CD3 CD16 (Fc IIIa) CD56, CD57(HNK-1) sangue linfonodi milza rare 10

22 Molecole accessorie dei linfociti

23 POSTULATI DELL'IPOTESI DELLA SELEZIONE CLONALE Ogni Ogni linfocita ha ha un un solo solo tipo tipo di di specificità recettore con con unica unica L'interazione tra tra molecola estranea e il il recettore linfocitario ad ad elevata affinità affinità porta porta all'attivazione del del linfocita Le Le cellule cellule effettrici differenziate derivate da da un un linfocita attivato porteranno lo lo stessa stessa specificità recettoriale I I linfociti con con recettori verso verso molecole proprie self self vengo vengo eliminati durante gli gli stadi stadi precoci dello dello sviluppo e quindi quindi in in larga larga parte parte mancano nel nel repertorio dei dei linfociti maturi maturi

recettore di uno specifico recettore Recettore linfocitario specifico verso

24 Organi Organilinfoidi linfoidiprimari primari Organismo immunocompetente vergine ogni linfocita BBooTTèèdotata ogni linfocita dotata antigene di uno specifico recettore di uno specifico recettore Recettore linfocitario specifico verso l'antigene repertorio clonale è selezionato per non riconosce antigeni propri o self Delezione clonale

25 Organi Organi linfoidi linfoidi secondari secondari Sostanza esogena Organismo immunocompetente vergine Attivazione ed Espansione clonale

26 valori arbitrari di Anticorpo Ag primaria secondaria terziaria giorni

27 Teoria Teoria clonale clonale sostanza a il repertorio di linfociti linfocita vergine piccolo linfocita attivato Plasmacellula linfocita memoria piccolo grande linfocita linfoblasto

28 I leucociti non linfocitari del sangue MONOCITI NEUTROFILI BASOFILI EOSINOFILI PIASTRINE nel sangue mm 3 M 300 N4500 E 200 B 40 E 200 L 2500

29 Neutrofili membrana granuli specifici o secondari Lattoferritina, lisozima, Fosfatasi alcaline granuli azzurrofili o primari Elastasi,collagenasi, catepsine C G B D, glicuronidasi, galattosidasi Arilsolfatasi, Mieloperossidasi, lisozima, Condrotinsolfato, proteine basiche

30 Eosinofili citoplasma tripsina Catalasi Fosfatasi Acide Fosfolipasi granuli membrana lisofosfolipasi Cristalli di Leyden proteina basica maggiore proteina cationica eosinofila Perossidasi eosinofila Neurotossina derivata da Eosinofili Istaminasi, fosfatasi acide, aminopeptidasi, catepsine, RNAsi, DNAsi,glicuronidasi, ArilsolfatasiB

31 Basofili membrana Cristalli di Leyden granuli Istamina Condrotin 4 & 6 solfato Istaminasi, Callicreina, glicuronidasi, Attivatore della Callicreina

33 neutrofilo dotato di alta capacità di movimento, oltre che fagocitaria 3µ coda lamellipodium

34 Le piastrine

35 TIPI cellulari tutti leucociti granulociti monociti Linfociti T Linfociti T helper Linfociti T killer Linfociti B piastrine Natural Killer CD markers CD45+ CD45+,CD15+ CD45+,CD14+ CD45+,CD3+ CD45+,CD3+,CD4+ CD45+,CD3+,CD8+ CD45+,CD19+ or CD20+ CD45+,CD61+ CD34+,CD31- CD16+,CD56+,CD3-

36 monocita

38 cellule cellulemonocito-macrofagiche monocito-macrofagiche sangue Monociti midollo osseo tessuti solidi ossa linea monocitica Macrofagi residenti istiociticellule Dentritiche mieloide osteoclasti cute cellule del Langerans rene macrofago mesangiale fegato cellule del Kupffer sinovia cellue tipo A sinoviali Sistema Nervoso Centrale microglia macrofago alveolare polmone cavità pleurica macrofago pleurico cavità pertoneale macrofago peritoneale granuloma macrofagi extravasati cellule epitelioidi multinucleate giganti infiammazione cronica

40 Fagocitosi

41 RECETTORI DELLA FAGOCITOSI recettori del mannosio e fucosio Lectine C tipo I e tipo II recettori spazzino scavenger Rec. * lipoproteine a bassa densità LDL Integrine MAC-1 CR3, CR4 Recettori del Complemento Recettori del frammento Fc degli Anticorpi CD14- per il legame del LBP-LPS

42 Molecole solubili concorrono al riconoscimento, OPSONINE

43 Scavenger receptors

44 Lectine di tipo C

46 Recettori chemotattici e anafilotossinici

47 Analogie tra i recettori chemotattici

48 NADPH OSSIDASI NADPH O 2 SUPEROSSIDO NADP+H H H 2 O 2 DISMUTASI O 2 Cl, H H ClO mieloperossidasi H 2 O R-NH R-NCl CLORAMINAZIONE H 2 O

51 Le Le cellule cellule presentanti presentanti l'antigene l'antigene professionali

53 DC DC immature >>migrazione DC DC attivate>>dc mature Tessuto vaso linfatico linfonodo

54 Cellule Dentritiche Mieloidi

59 Molecole per la cattura dell'antigene lectine tipo C Capacità di riconoscere strutture ricche di carboidrati

60 Recettori tipo TOLL TLR per l'attivazione cellulare del fagocita o dell'apc

61 Segnali non TLR

62 I due segnali servono per avviare l'azione immunitaria

63 Anche verso l'immunità specifica

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