GLOBAL AMPHIBIAN DECLINE

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1 GLOBAL AMPHIBIAN DECLINE La perdita di biodiversità globale è attualmente una delle maggiori preoccupazioni a livello mondiale. Benché l esatto numero di specie che sta scomparendo non sia nota, si è stimato che l attuale tasso di estinzione sia maggiore di quello mai conosciuto negli ultimi anni (Wilson, 1992; Eldridge, 1998). Come parte della globale crisi di biodiversità molte popolazioni di anfibi sono in declino in tutto il mondo. Dal 1993 si è registrato che più di 500 popolazioni sono in declino o sono elencate come specie che necessitano di particolari azioni di conservazione (Alford & Richards, 1999; Blaunstein & Kiesecker, 2002). Le cause sono state imputate ad una combinazione di fattori locali come l alterazione e frammentazione dell habitat (Alford & Richards, 1999), la scomparsa di ambienti idonei alla riproduzione, l inquinamento, l introduzione di specie alloctone, patogeni (Daszak et al., 1999 e 2000; Harvell et al., 2002) unitamente a fenomeni su larga scala come il cambiamento climatico globale (Pounds, 2001) e l aumento delle radiazioni UV-B (Blaustein et al., 1994 Marquis et al., 2008). In alcuni casi sono state documentate estinzioni di popolazioni in aree apparentemente incontaminate, che possono essere spiegate solo da effetti globali come i cambiamenti climatici e/o aumento di radiazioni. Gli Anfibi sono particolarmente sensibili ai cambiamenti ambientali: la loro doppia vita, acquatica e terrestre, li espone infatti a pressioni ambientali proprie di ambienti diversi molto più di quanto avvenga per le altre Classi di vertebrati. Spesso gli Anfibi sono quindi i primi animali a soffrire in aree in cui il degrado dell ambiente è al suo inizio, spesso non evidenziato da altri descrittori. Questo motivo fa di essi importanti bioindicatori (Blaustein, 1994; Blaustein & Wake, 1995; Blaunstein & Johnson, 2003): il monitoraggio dello stato di salute delle loro popolazioni consente infatti di controllare lo stato dell ambiente che sta loro intorno e di riconoscere tempestivamente situazioni di degrado. EFFETTI DELLE RADIAZIONI UV-B SUGLI ANFIBI Le radiazioni UV-B sono una delle cause di declino degli anfibi. E noto che le radiazioni UV-B inducono effetti subletali che possono influenzare crescita e sviluppo, comportamento, fisiologia ed anatomia degli anfibi (Betsy et al. 2008). Gli effetti dell esposizione agli UV-B possono manifestarsi nella fase embrionale con una riduzione del tasso di schiusa (Blaunstein 2002; Marquis et al., 2008); inoltre diversi studi dimostrano che l esposizione degli embrioni alle radiazioni ultraviolette può non manifestarsi nella fase embrionale, ma gli effetti si possono osservare negli stadi di sviluppo seguenti. Ad es., embrioni di Rana temporaria esposti ad UV-B non mostrano una diminuzione del tasso di sopravvivenza, o riduzione della taglia degli embrioni (Pahkala 2001) e nemmeno un aumento della frequenza di anomalie a

2 livello embrionale. Tuttavia le larve sviluppatesi da embrioni sottoposti ad UV mostrano un aumento nella frequenza di anomalie nello sviluppo, metamorfosano più tardi e sono più piccole delle larve derivate da embrioni non sottoposti ad UV-B (Pahkala, 2001). Quindi gli effetti delle radiazioni UV sugli anfibi sono complesse. Le radiazioni UV possono uccidere direttamente gli anfibi, causare effetti subletali oppure sommare i loro effetti negativi a quelli di inquinanti ambientali (ph, nitriti, nitrati etc.), patogeni o cambiamenti del clima. E da considerare inoltre che gli effetti delle radiazioni UV- B possono variare da specie a specie (Betsy et al. 2008), e tra popolazioni della stessa specie con le condizioni climatiche, geografiche e le caratteristiche chimiche dell acqua (Blaunstein, 1998; Betsy et al. 2008). RANA TEMPORARIA COME BIOINDICATORE Il presente progetto ha verificato la possibilità di utilizzare Rana temporaria per la valutazione degli effetti delle radiazioni ultraviolette, in modo tale da poter esser impiegata per il monitoraggio del territorio valdostano. Questo anfibio è diffuso su tutto il territorio valdostano dalle basse alle alte quote. E inoltre particolarmente sensibile ai cambiamenti ambientali per le sue caratteristiche biologiche: sensibilità delle uova non protette da guscio calcareo (Ashley Mattoon, 2000), rapidi tassi di crescita larvale, permeabilità ed elevata sensibilità della pelle, ciclo vitale complesso. Le femmine di Rana temporaria in genere depongono centinaia di uova spesso in acque basse di pozze o stagni privi di vegetazione, dove sono esposte direttamente ai raggi del sole. Dopo la schiusa le larve trascorrono un arco di tempo considerevole in acque basse dove sono ancora sottoposte a raggi solari diretti. In questo stadio della vita, impossibilitati ad allontanarsi, i girini sono esposti ai deleteri effetti degli UV-B. Mentre le larve di alcune specie di anfibi evitano attivamente l esposizione agli UV- B, quelle di Rana temporaria non lo fanno. Esiste infatti un conflitto tra la necessità di esporsi a temperature elevate che aumentano il tasso di crescita e quindi la fitness individuale (negli anfibi, soprattutto nelle femmine, la taglia è correlata positivamente con il successo riproduttivo) e quella invece di ripararsi dagli effetti nocivi dell esposizione alle radiazioni ultraviolette. LO STUDIO SPERIMENTALE Durante l estate 2007 abbiamo condotto uno studio sperimentale su girini di Rana temporaria. Lo studio è stato svolto in tre località situate nella parte Nord occidentale della Valle d Aosta: Saint Pierre m 650 s.l.m., Planaval m 1512 s.l.m. (Valgrisenche) e Thumel m 2000 s.l.m. (Val di Rhemes). In ognuna delle tre aree di sperimentazione sono state poste 6 vasche contenenti uova di Rana temporaria raccolte in tre ambienti di quote diverse: Arpnouva (Comune di Courmayeur), sito a circa 1750 m s.l.m.

3 Combal (Comune di Courmayuer), sito a 1964 m s.l.m Alpe Vaudet (Comune di Valgrisenche), sito a circa 2283 m s.l.m Tutte le vasche sono state poste sotto i raggi diretti del sole, ma tre, una per ciascuna zona di provenienza, sono state protette dal plexiglass + Mylar (pellicola di polietilene che scherma le radiazioni ultraviolette). La capacità di filtro è stata testata presso l ARPA della Valle d Aosta con la gentile collaborazione del dr. Diemoz, attraverso l utilizzo di 2 radiometri a banda larga in grado di misurare la radiazione ultravioletta (UV-B) ponderato secondo la curva eritemale. Dall esame è risultato che il plexiglass da solo scherma l 86% dell UV-B mentre il plexiglass + Mylar scherma il 99,8% degli UV-B. Ciascuna vasca conteneva 10 litri d acqua sostituita ogni 7 giorni. I girini sono stati nutriti ad libitum. Le vasche sono state controllate una volta alla settimana; i parametri ambientali quali la temperatura minima e massima dell acqua sono stati raccolti tre volte alla settimana. Sono stati misurati, negli stadi larvali, parametri di: 1) Accrescimento: una volta alla settimana veniva rilevato lo stadio di sviluppo secondo Gosner (1960) e misurata la lunghezza del corpo (SVL) da foto digitale attraverso opportuni programmi grafici (imagej). 2) Anomalie di sviluppo: mortalità (N larve morte) e malformazioni (N larve con malformazioni). 3) Effetti genotossici: allo stadio di sviluppo 41 secondo Gosner (1960) 8 girini per ogni campione sono stati sacrificati per prelevare il sangue necessario per l analisi dei micronuclei. Strisci di sangue dei girini, fissati in metanolo e successivamente colorati con arancio di acridina, sono stati osservati al microscopio a fluorescenza. Si è proceduto alla conta delle cellule ed all identificazione delle anomalie nucleari. 4) Parametri comportamentali: ogni due settimane sono state effettuate delle riprese video dell attività di nuoto delle larve di Rana temporaria. Le riprese video dei girini sono ancora in corso di analisi, effettuata attraverso un apposito programma informatico: Swimming Behavioural Recorder (SBR). Questo programma permette l analisi dinamica del movimento di organismi, in questo caso delle larve di Rana temporaria, al fine di verificare la presenza di alterazioni nel comportamento dei girini. Al momento si sta procedendo all analisi di sette minuti delle riprese video del nuoto di sette girini per ogni campione. Per ogni filmato verranno considerati i seguenti parametri: velocità media del girino, in millimetri/secondi; velocità massima istantanea del target, in millimetri/secondi e percentuale di tempo (in relazione alla sua durata) in cui il girino si è mosso con velocità maggiore della soglia MinSpeedFilter.

4 RISULTATI ATTESI Da questo studio ci attendevamo di rilevare effetti negativi su girini che sono esposti alle radiazioni UV, mentre ci attendevamo che quelli protetti da Mylar risentissero in misura minore di tale effetto. In particolare abbiamo ipotizzato che in generale, per i girini allevati in presenza di schermo agli UV-B si dovessero registrare: 1. tassi di sopravvivenza e sviluppo maggiori rispetto a girini esposti a UV-B; 2. tassi di alterazioni del DNA inferiori. 3. tassi di malformazione inferiori; RISULTATI OTTENUTI Dall analisi dei dati raccolti risulta che per le tre località di sperimentazione, Saint Pierre, Planaval e Thumel: 1. la taglia dei girini allo stadio 41 di (Gosner, 1960) protetti nello sviluppo dalle radiazioni UV-B è risultata significativamente maggiore per le quote di allevamento più elevate (Planaval p<0,001 e Thumel p<0,052) e vicino alla significatività nel sito di St. Pierre (p=0,069) 2. il tasso di anomalie nucleari in assenza di esposizione ad UV-B è significativamente inferiore nei girini non esposti direttamente ai raggi del sole nelle popolazioni di St. Pierre (p<0.001) e Thumel (p=0.001) e vicino alla significatività nel sito di Planaval (p=0.063). 3. Non sono stati osservati invece casi di malformazione o mortalità. CONCLUSIONI Le radiazioni ultraviolette svolgono un ruolo non trascurabile nel declino mondiale delle popolazioni degli anfibi soprattutto per quanto riguarda l esposizione delle loro larve. Infatti nell esperimento effettuato i girini di Rana temporaria esposti alle radiazioni ultraviolette hanno dimostrato una diminuzione dell accrescimento e un maggior numero di anomalie nucleari, indipendentemente dalla quota di allevamento, rispetto ai girini dotati di filtro protettivo. BIBLIOGRAFIA Alford, R. A. & Richards, S. J Global Amphibian declines:a problem in applied ecology. Ann. Rev. Ecol. Syst., 30:133-16

5 Bancroft, B. A., Baker, N. J., Searle, C. L., Garcia, T. S. & Blaustein A. R., Larval amphibians seek warm temperatures and do not avoid harmful UVB radiation. Behavioral Ecology. Blaustein, A. R., Hoffman, P. D, Hokit, D. G., Kiesecker,J. M., Walls, S. C., Hays, J. B., UV repair and resistance to solar UV-B in amphibians egs: a link to population declines. Proc. Nat. Acad. Sci. 91: Blaustein, A.R. & Wake, D.B.,1995. The puzzle of declining amphibian populations. Sci. Am. 272:52-57 Blaunstein, A. R. & Kiesecker, J. M Complexity in conservation: lessons from the global decline of amphibian population. Ecology Letters, 5: Blaunstein, A.R. & Johnson, P.T.J., The complexity of deformed amphibians. Front. Ecol. Envir. 1(2):87-94 Daszak, P, Berger, L., Cunningham, A.A.,1999. Emerging infectious diseases in amphibian population decline. Emerg. Infect. Dis. 5: Daszak, P, Cunningham, A.A., Hyatt A.D., Emerging infectious diseases of wildlife threats to biodiversity and human healt. Science 287: Eldridge, N Life in the Bilance: Humanity and the Biodiversity Crisis. Princeton University Press, Princeton, NJ. Harvell, C.D., Mitchell C.E., Ward, J.R., Climate warmingand disease risks for terrestrial and marine biota. Science 296: Gosner, A simplified table for staging anuran embryos and larvae with notes on identification. Herpetologica 16: , 1960 Marquis, O., Miaud C. & Lena J Developmental responses to UV B radiation in common frog Rana temporaria embryos from along an altitudinal gradient. Popul. Ecol. 50: 123_ 130. Pahkala, M., Laurila, A & Merilä, J Carry-over effects of ultraviolet-b radiation on larval fitness in Rana temporaria. Proceedings of the Royal Sciety of London 268: Pounds, J. A., 200. Climate and amphibian declines. Nature 410:

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