SEMPRE PIU IN ALTA CON IL SEQUENZIAMENTO

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Ilario Testa
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1 Facoltà di Medicina e Chirurgia Corso di Laurea in TECNICHE DI LABORATORIO BIOMEDICO Polo Universitario delle Professioni Sanitarie di Rovereto Dipartimento di Medicina Trasfusionale U.O. di Immunoematologia e Servizio Trasfusionale Banca del Sangue e del Plasma Laboratorio di Tipizzazione Tissutale HLA Direttore: Massimo Ripamonti TESI DI LAUREA SEMPRE PIU IN ALTA CON IL SEQUENZIAMENTO Relatore: Dott.ssa Ceschini Nadia Correlatore: Dott. Gottardi Paolo Laureando: Amistadi Simona ANNO ACCADEMICO 2010/2011

SCOPO L HLA (Human Leukocyte Antigen) è in prima linea nei meccanismi coinvolti nel trapianto di organi o di Midollo Osseo poiché codifica per antigeni specifici per ciascun individuo, deputati ad

La sua tipizzazione è finalizzata alla ricerca delle caratteristiche genotipiche e fenotipiche possedute ed espresse dalle cellule immunocompetenti per determinare le condizioni di compatibiltà di

2 SCOPO L HLA (Human Leukocyte Antigen) è in prima linea nei meccanismi coinvolti nel trapianto di organi o di Midollo Osseo poiché codifica per antigeni specifici per ciascun individuo, deputati ad accogliere epitopi da presentare ai linfociti T per la risposta immune. La sua tipizzazione è finalizzata alla ricerca delle caratteristiche genotipiche e fenotipiche possedute ed espresse dalle cellule immunocompetenti per determinare le condizioni di compatibiltà di un ricevente necessarie per evitare rigetto o complicanze. Da questo nasce l esigenza di tipizzare i donatori di midollo nei Registri Provinciale e Italiano con metodiche molecolari sempre più specifiche e precise, affiancando allo studio in bassa e in alta risoluzione la metodica del Sequenziamento. DRB1:02 DRB1:02:01 DRB1

presentare gli antigeni ai linfociti T CD8: a loro volta, questi hanno azione citolitica, ovvero

3 HLA I CLASSE Le molecole di I classe comprendono i gruppi A, B, C, ecc. Sono espresse sulla maggior parte delle cellule nucleate ed il loro compito è quello di presentare gli antigeni ai linfociti T CD8: a loro volta, questi hanno azione citolitica, ovvero si occupano della distruzione delle cellule infettate da virus, le quali ne ospitano la replicazione e ne espongono gli epitopi.

HLA II CLASSE Le molecole di II classe comprendono i gruppi DRB1, DQA1, DQB1,

dendritiche) che processano gli antigeni batterici fino ad ottenere peptidi da

Il loro compito è quello di presentare gli epitopi ai linfociti T CD4 che a

4 HLA II CLASSE Le molecole di II classe comprendono i gruppi DRB1, DQA1, DQB1, ecc. Sono espresse solo sulle APC (macrofagi, linfociti B e cellule dendritiche) che processano gli antigeni batterici fino ad ottenere peptidi da esporre per attivare la risposta immune. Il loro compito è quello di presentare gli epitopi ai linfociti T CD4 che a loro volta, tramite citochine, attivano linfociti T CD8 (citotossici) e linfociti B (attivati a plasmacellule sintetizzanti anticorpi).

Il MATERIALE utilizzato nello studio delle sequenze HLA è il DNA dei globuli bianchi, ottenuto da matrici di: - Sangue intero (utilizzato nella maggior parte dei casi);

Solitamente per studio su sangue intero vengono prelevate 2 provette, ciascuna contenente un diverso tipo di anticoagulante: per evitare eventuali interferenze nella

5 Il MATERIALE utilizzato nello studio delle sequenze HLA è il DNA dei globuli bianchi, ottenuto da matrici di: - Sangue intero (utilizzato nella maggior parte dei casi); - Buffy-coat (utilizzato quando si ha scarsa quantità di DNA). Solitamente per studio su sangue intero vengono prelevate 2 provette, ciascuna contenente un diverso tipo di anticoagulante: per evitare eventuali interferenze nella fase di reazione dovute al tipo di anticoagulante utilizzato Sangue intero + ACD Acido Citrico Destrosio, chela gli ioni Calcio liberi rendendo il sangue incoagulabile. Sangue intero + K 2 EDTA Solitamente presente nella provetta in forma liofila, per non diluire il campione.

6 METODI

7 FOGLIO ATTACHMENT IDENTIFICAZIONE DEGLI APLOTIPI DRB1*11,08 ad Alta Risoluzione PM C+ C-

8 METODI F R F R F R

9 Estensione 72 C Denaturazione 95 C METODI Appaiamento dei primers 60 C

10 Polymer pouch Anode Buffer AB 3500 Dx Array da 8 capillari Cathode Buffer METODI

11 Interpretazione con SequencePilot Il software permette di tradurre le sequenze in informazioni utili alla definizione degli alleli HLA. Elabora l elettroferogramma e lo confronta con un database proprio, associando alla sequenza rilevata sequenze uguali o simili, corrispondenti ad alleli noti. Il database (IMGT-HLA) deve essere aggiornato frequentemente per disporre anche delle sequenze di alleli scoperti recentemente. Per l elaborazione è necessario verificare base per base l analisi del sequenziatore, eventualmente modificando manualmente l interpretazione del software ed andando a valutare la corrispondenza tra la sequenza campione e la sequenza proposta dal consensus.

12 PROBLEMATICHE Campione con rumore di fondo sufficientemente alto da causare ambiguità nel riconoscimento dei picchi Sequenza fuori scala

13 PROBLEMATICHE consensus DRB1*14: DRB1*03: E2 forward aplotipo 1 S4R10 E2 forward aplotipo 2 S4R5 14: 03: Presenza di due picchi differenti nella medesima posizione (64)

14 MATERIALI Fra i donatori presentatisi presso il Laboratorio di Trento ne sono stati selezionati, in modo casuale, 30; a questi sono stati aggiunti 5 campioni UCLA per il controllo di qualità esterno: su questo materiale si è eseguita la bassa risoluzione, l alta risoluzione e infine il sequenziamento. Distribuzione dei 35 campioni per sesso Distribuzione dei 35 campioni per età anagrafica Femmine 34,29% Controlli Qualità 14,28% Frequenza in % 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 17,14 20,00 31,44 17,14 14,28 10,00 5,00 Maschi 51,43% 0, CQ intervallo d'età Una conferma dell esattezza dei risultati ottenuti con il sequenziamento è stata possibile: confrontando i dati con i risultati ad alta risoluzione ottenuti in precedenza per i medesimi campioni; eseguendo 5 controlli provenienti dall Ente esterno UCLA (University of California, Los Angeles).

15 RISULTATI Distribuzione dei 35 campioni per la caratteristica DRB1 a Bassa Risoluzione Frequenza in % 14,00 12,00 11,43 11,43 11,43 11,43 11,42 10, ,58 8,00 6,00 5,71 5,71 5,71 4,29 4,00 2,00 1,43 1,43 0,00 *03 *04 *07 *08 *10 *11 *12 *13 *14 *15 *16 blank DRB1 Fenotipi DRB1, riscontrati nello studio a Bassa Risoluzione Fenotipi DRB1 riscontrati nello studio ad Alta Risoluzione Distribuzione dei 35 campioni per la carateristica DRB1 in Alta Risoluzione Frequenza in % ,94 10,43 8,95 8,95 7,46 7,46 4,47 4,47 4,47 2,98 2,98 2,98 2,98 2,98 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 *02 *03 *02 *02 *03 *04 *06 *04 *02 *02 *03 *02 * DRB1*

16 SBT 1 SBT 2 RISULTATI \ \ : :01 08: 13:03: \ :03:01 04:04:01 Distribuzione dei 35 campioni per la caratteristica DRB1 in sequenziamento \ \ \ : 01:02:01 13:02:01 14:54 15: 14: Frequenza in % ,97 2,98 1,49 10,46 1,49 4,48 1,49 2,98 1,491,49 11,94 4,48 1,49 7,48 2,98 4,48 1,49 7,46 1,491,49 5,97 1,491,49 10,46 1, \ \ \ \ \ \ \ : :01 04:03:01 10:. 03: 11: 03:. 01:03:01 11: 11: 11:04:01 07: omozigote 11: \ : 13: 01:02 01:03 02:01 02:01 03:01 04:01 06:01 04:01 02:01 02:01 03:01 02: * 03* 04* *07*08*10 *11 *12 *13 *14 *15*16 DRB \ \ / \ : 04: 07:. 14: 07: 12: 14:02: \ : omozigote CQ UCLA 2011 N ID # 676 #677 #678 #679 Gruppo etnico Asiatico Nero Caucasico Caucasico DRB1 SBT 07: 12:02:02 03:02:01 12: 07: 15: 04:06:01 16: \ \ \ \ \ \ \ \ :02:01 :01 08: 14: 03: 13: 07: 03: 13: 13: 11:04:01 15: 15: 15: 12: 04: #680 Ispanico 04:02:01 07: \ \ : :01 13: 08:

Differenze aminoacidiche e nucleotidiche DRB1*04 Pos.

Gln Asp Gln Asp Asp 208-210 CAG GAC CAG GAC GAC 71 Lys Glu Arg Ser Ser 211-213 AAG GAG AGG AGC AGC 74

Leu Ile Leu Leu Leu 286-288 CTC ATC CTC CTC CTC 99 Gln Asp Gln Gln Gln 295-297 CAG GAC CAG CAG CAG

17 Differenze aminoacidiche e nucleotidiche DRB1*04 Pos. *04: *04:02:01 *04:03:01 *04:06:01 *04:07:01 67 Leu Ile Leu Val Val CTC ATC CTC GTG GTG 70 Gln Asp Gln Asp Asp CAG GAC CAG GAC GAC 71 Lys Glu Arg Ser Ser AAG GAG AGG AGC AGC 74 Ala Ala Glu Gly Gly GCG GCG GAG GGG GGG 86 Gly Val Val Asp Asp GGT GTG GTG GAT GAT 96 Leu Ile Leu Leu Leu CTC ATC CTC CTC CTC 99 Gln Asp Gln Gln Gln CAG GAC CAG CAG CAG 100 Lys Glu Arg Arg Arg AAG GAG AGG AGG AGG 103 Ala Ala Glu Glu Glu GCG GCG GAG GAG GAG 115 Gly Val Val Gly Val GGT GTG GTG GGT GTG

18 CONCLUSIONI Nel Laboratorio HLA di Trento l introduzione del sequenziamento nel lavoro di tipizzazione molecolare consentirà di: fornire risultati maggiormente specifici offrendo tipizzazioni più accurate, utili alla ricerca di donatori compatibili; ridurre i costi imposti al Laboratorio dall utilizzo di innumerevoli kits per eseguire gli esami in alta risoluzione con termociclatore ed elettroforesi; individuare nuove mutazioni puntiformi nucleotidiche corrispondenti a nuovi alleli; caratterizzare e definire anche gli alleli non ritrovabili con lo studio in alta risoluzione, senza sequenziamento.

19 Vi ringrazio per l attenzione!!

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