Diagnostica HLA nel laboratorio di A.V.R. Pievesestina 23 novembre 2013

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1 Diagnostica HLA nel laboratorio di A.V.R Pievesestina 23 novembre 2013

2 Sistema HLA Ruolo del sistema HLA (Human Leukocyte Antigens) Nomenclatura Metodiche utilizzate Correlazione a patologie autoimmuni Dati attività Pievesestina 23 novembre 2013

3 Sistema HLA Ruolo fondamentale del SISTEMA HLA Processi di riconoscimento self/non-self Coordinamento della risposta immunitaria umorale e cellulare Patogenesi di alcune malattie autoimmuni e infettive Compatibilità dei trapianti di CSE e organi solidi La compatibilità tra donatore e ricevente è un requisito fondamentale nei trapianti,in quanto riduce il rischio di rigetto e Graft Versus Host Disease GVHD

4 Sistema HLA Il sistema HLA fa parte del sistema MHC (Major Histocompatibility Complex) presente in tutti i mammiferi e coinvolto nella risposta immunitaria. Il sistema HLA è composto da un insieme di geni posti sul braccio corto del cromosoma 6. L'estensione di MHC e di circa 4 milioni di paia di basi (circa 0,1% dell'intero genoma). I geni HLA di classe I e II occupano circa 1/3 di questa lunghezza,la parte restante è composta da geni definita di III classe responsabili della produzione di fattori del complemento, ormoni, proteine reattive, citochine.

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6 Polimorfismo HLA Ad Ottobre 2013 Per i loci A; B ;C si contano 7679 alleli Per i loci DR; DQ si contano 2268 alleli

7 Sistema HLA I geni della classe I del sistema HLA codificano per antigeni glico-proteici di superficie : HLA-A, HLA-B, HLA-Cw sono presenti sulla superficie di tutte le cellule, fatta eccezione per i globuli rossi il loro ruolo è quello di presentare sulla superficie cellulare i peptidi estranei ai linfociti T - CD8 ( T suppressor /citotossici)

8 Sistema HLA I geni della classe II del sistema HLA codificano per antigeni glico-proteici di superficie: HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP sono presenti esclusivamente sulle cellule immunocompetenti linfociti B,macrofagi e cellule presentanti l'antigene (APC). Il loro ruolo è quello di presentare sulla superficie cellulare i peptidi estranei ai linfociti T - CD4 (helper ).

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10 DEFINIZIONE DI APLOTIPO L'aplotipo è la combinazione allelica presente su un gamete, che viene ereditata in blocco da un genitore. Ciascun individuo possiede quindi 2 aplotipi,uno di provenienza paterna e uno di provenienza materna.

11 A B DR

12 LINKAGE DISEQUILIBRIUM Gli alleli HLA hanno in una determinata popolazione frequenze diverse. La combinazione degli alleli negli aplotipi rispecchia in linea di massima la frequenza dei diversi alleli in quella popolazione. In teoria la frequenza dei diversi aplotipi è deducibile dalla frequenza dei singoli alleli. In pratica alcune combinazioni alleliche si osservano con maggiore o minore frequenza di quelle attese. Questo fatto viene detto squilibrio dell associazione gametica o linkage disequilibrium.

13 Nomenclatura

14 NOMENCLATURA HLA Sierologia I classe : Antigeni HLA A2, B7, Cw5 Molecolare : Alleli HLA bassa risoluzione: A*02:XX, B*07:XX, C*05:XX alta risoluzione: A*02:01, B*07:02, C*05:01

15 Laboratorio Immunogenetica Dal 1996 il nostro laboratorio ha iniziato a tipizzare per il Registro Donatori di Midollo Osseo a Ravenna. Negli anni successivi in seguito a riorganizzazione del Registro e con l'aumento delle richieste per Patologie Autoimmuni correlate ad antigeni HLA il nostro laboratorio esegue prevalentemente test specifici per la ricerca di antigeni e alleli predisponenti tali patologie. Dal 2012 il laboratorio a Pievesestina esegue tipizzazioni in biologia molecolare e per tutta Area Vasta Romagna.

16 Laboratorio Immunogenetica Pievesestina Test eseguiti : Metodica SSP e SSO. Locus A, B, C, DRB1, DQA1, DQB1, Ricerca alleli B27 - B57 Celiachia (DQA1, DQB1) SSP - Real.Time.

17 Sistema HLA metodiche di tipizzazione Metodica in sierologia (microlinfocitossicità). Metodica molecolare SSP. Metodica molecolare SSO. Metodica molecolare R.T. Metodiche di sequenziamento.

18 PCR-SSP Reazione di polimerizzazione a catena con primers sequenza specifica sviluppata nel 1992 E una metodica di tipizzazione molecolare che prevede l uso di coppie di primers sequenza specifica complementari ( estremità 5' (antisense) rispetto all'estremità 3' ) in grado di riconoscere in modo specifico un allele o un gruppo di alleli. In questa metodica si eseguono contemporaneamente per ogni campione e per ogni locus, diverse reazioni di PCR, ciascuna caratterizzata da una differente coppia di primer. L'amplificazione di sequenze specifiche dà un risultato positivo.. coppie di primers non complementari non si amplificano (risultato negativo).

19 Denaturazione: Tubi contenenti il DNA vengono riscaldati a C per un tempo che può variare da uno a pochi minuti, al fine di denaturare il DNA cioè di separare la struttura a doppia elica nei suoi due filamenti

20 Sintesi: La temperatura è portata a 72 C per uno o più minuti, al fine di consentire a molecole di enzima Taq polimerasi di raggiungere le estremità degli inneschi e di estendere questi ultimi copiando lo stampo di DNA

21 Ibridizzazione: La temperatura viene ridotta a C per uno o più minuti, al fine di consentire l adesione dei due inneschi alle rispettive sequenze complementari presenti sul DNA, a destra e a sinistra della regione che si desidera amplificare

22 Secondo ciclo: Durante il secondo ciclo si formano molecole ibride con un filamento della lunghezza desiderata

23 Terzo ciclo: Durante il terzo ciclo si formano le prime molecole di DNA corrispondenti esattamente alla zona del genoma che si vuole amplificare, e vengono indicate con una freccia nel quadro finale.

24 Quarto ciclo: man mano che prosegue la sintesi aumenta la percentuale di molecole di DNA con le caratteristiche desiderate. Alla fine del 4 ciclo, otto molecole su sedici (cioè il 50% delle molecole presenti) corrispondono esattamente alla zona bersaglio

25 Separazione dei prodotti amplificati La valutazione dei prodotti di amplificazione in SSP avviene tramite corsa elettroforetica su gel di agarosio al 2% con un colorante intercalante del DNA( etidio bromuro) e successiva lettura delle bande con raggi UV. Un software di interpretazione della bande aiuta il dirigente nell'individuazione dell'allele presente.

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27 Elettroforesi

28 Traditional PCR o END POINT PCR cycles dntps Mg++ Taq Pol. Primers buffer

29 Metodica SSO Dopo una iniziale amplificazione gli ampliconi si fissano in maniera complementare alle microsfere a cui sono legate sonde a sequenza specifica (ibridazione ).Il prodotto ibridato e legato a sostanze fluorescente (streptavidina coniugata con ficoeritrina) viene analizzato dai laser. L'analizzatore elabora i dati identificando i vari gradi di intensità di fluorescenza confrontandoli con pattern associati a sequenze note.

30 Metodica SSO Luminex

31 Metodica Real Time Il Dna viene amplificato, da reazioni a catena usando intercalari del DNA fluorescenti, dopo ogni turno di amplificazione il Dna viene quantificato. L aumento della fluorescenza è direttamente proporzionale al numero di ampliconi generati. La misurazione dei prodotti di amplificazione avviene in tempo reale.

32 PCR Real-Time

33 Real Time PCR ( TaqMan) dntps Mg++ Taq Pol. Primers buffer PROBE

34 HLA malattie Dagli anni 70 in poi sono stati fatti numerosi studi di associazione,confrontano le frequenze di alleli specifici ad un certo locus in una popolazione di malati con una popolazione di controllo. Il numero di malattie poste in correlazione col sistema HLA è altissimo. In generale si tratta di patologie legate all'autoimmunità che presentano caratteristiche comuni : - sono malattie a genesi multifattoriale - hanno solitamente un decorso subacuto o cronico - sono spesso associate ad alterata reattività immunitaria

35 ASSOCIAZIONE HLA MALATTIE MALATTIA ANTIGENE RR SPONDILITE B27 91 S.REITER B27 38 UVEITE B27 10 PSORIASI Cw6 35 TIROIDITE SUBACUTA B35 19 S.BECHET B51 8 DIABETE GIOVANILE DRB1*03 - DRB1* CELIACHIA DQ2(DQA1*05, DQB1*02) 20 DQ8(DQA1*03,DQB*03:02) 4 NARCOLESSIA DQB1*06:02 5

36 Rischio Relativo Probabilità di un soggetto con l'antigene di sviluppare la malattia rispetto ad un soggetto che non ha l'antigene. RR = pazienti con antigene x controlli senza antigene pazienti senza antigene x controlli con antigene

37 HLA e Farmacogenetica Nei pazienti HIV positivi Abacavir è un farmaco di elezione per il trattamento della patologia,ma è un farmaco che può sviluppare una reazione avversa in presenza dell allele B57:01

38 HLA e Farmacogenetica Il farmaco Abacavir è un nucleoside inibitore della trascriptasi inversa virale si comporta come ligando nel sito recettoriale delle molecole HLA. In presenza dell'allele B57:01 si modifica il sito di legame in vicinanza della tasca F e si attiva cosi' una reazione di ipersensibilità.

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40 Celiachia Malattia multifattoriale in cui il fattore ambientale scatenante è il glutine e interazione genetica. Solo eterodimeri DQ2 e DQ8 interagiscono con i peptidi derivati dalla digestione della gliadina del glutine attivando i linfociti T presenti nel lume intestinale. Linfociti T attivati formano anticorpi e tramite le citochine determinano l'atrofia della mucosa.

41 HLA e celiachia Celiachia silente: Asintomatica con atrofia intestinale Celiachia latente: Mucosa intestinale normale, anticorpi positivi

42 HLA CELIACHIA Il test di tipizzazione HLA per celiachia non è un test diagnostico in quanto è solo indicativo della suscettibilità genetica alla patologia

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44 Celiachia Eterodimero DQ2 è codificato dagli alleli : DQA1*05 e DQB1*02 Eterodimero DQ8 è codificato dagli alleli: DQA1*03 e DQB1*03:02 Eterodimero DQ2: con DQB1 *02 positivo e DQA1 *05 negativo solo catena beta del DQ2

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46 HLA celiachia APLOTIPI RISCHIO DR3/DR3 DR3/DR7 DR5/DR7 trans DR3/DRX cis Molto alto Molto alto Alto Moderato

47 Aplotipi correlati a celiachia DRB1*03 DQA1*05, DQB1*02 DRB1* 07 DQA1*02, DQB1*02 DRB1*11 trans con*07 DQA1*05, DQB1*03 DQA1*02, DQB1*02 DRB1*04 DQA1*03, DQB1*03:02

48 Laboratorio Immunogenetica Test per celiachia maggio -dicembre 2012 Pievesestina Totale richieste positivi 72% positivi DQ positivi DQ8 8 - positivi DQ2+DQ8

49 Laboratorio Immunogenetica Maggio - Dicembre 2012 Totale richieste per ricerca B Totale positivi - 17 (6%) Totale richieste per ricerca B57: Totale positivi - 11 (6%)

50 Laboratorio Immunogenetica Test per celiachia gennaio - ottobre 2013 Totale richieste: POSITIVI 78% positivi DQ positivi DQ positivi DQ2+DQ8

51 Laboratorio Immunogenetica Gennaio - ottobre 2013 Totale richieste per ricerca B Totale positivi - 34 ( 9,9%) Totale richieste per ricerca B57: Totale positivi 5 ( 3%)

52 Grazie