IL LABORATORIO NELLA DIAGNOSTICA DELLA MALATTIA CELIACA

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3 IL LABORATORIO NELLA DIAGNOSTICA DELLA MALATTIA CELIACA La medicina di laboratorio è la disciplina clinica che ricerca dati relativi alla natura e all entità delle alterazioni di struttura e di funzione, su campioni ottenuti dal paziente o sul paziente stesso, con mezzi chimici, fisici e biologici. Questi dati vengono elaborati in informazioni da utilizzare accanto ai sintomi e ai segni clinici a scopo: Preventivo (screening) Diagnostico Terapeutico Di monitoraggio Riabilitativo )

4 La prevalenza nella popolazione generale in Europa e in Nord America è di circa: 0.5-1%

5 Circa 2,5 milioni di pazienti celiaci in Europa 80-90% non riconosciuti, a causa della variabile presentazione Clinica della patologia Studi epidemiologici eseguiti su vasta scala hanno dimostrato che solo il 10-20% dei casi di celiachia sono identificati sulla base, dei dati clinici

6 Malattia celiaca (sintomi tipici o atipici) Malattia celiaca silente Lesioni della mucosa+ Test sierologici + Malattia celiaca latente Lesioni della mucosa Predisposizione genetica: DQ2 DQ8

7 Studi epidemiologici hanno suggerito l opportunità di effettuare screening di popolazione in toto o di gruppi a rischio, mediante l impiego di test sierologici sensibili e specifici con l obiettivo di esplorare la profondità dell iceberg. Gruppi a rischio di sviluppare MC 1. parenti di primo grado dei soggetti celiaci 2. soggetti affetti da malattie autoimmuni sistemiche e organo-specifiche 3. Soggetti affetti da sindromi genetiche 4. Soggetti con deficit di IgA

8 La Malattia Celiachia viene ridefinita come malattia sistemica immuno-mediata, scatenata dal glutine e dalle prolamine correlate, in individui geneticamente predisposti e caratterizzata dalla presenza di una variabile combinazione di: 1) Sintomi glutine-dipendenti, 2) Anticorpi specifici 3) Aplotipi HLA-DQ2 o DQ8 4) Enteropatia (può esserci, ma anche no)

9 La malattia celiaca si distingue dalle altre intolleranze alimentari per la peculiarità della risposta immunitaria indotta dal glutine: 1) Da un lato si osserva una vivace risposta cellulomediata anti-glutine responsabile di un danno alla mucosa intestinale su base prevalentemente infiammatoria 2) Dall altro lato si assiste ad una varietà di risposte umorali e alla produzione di autoanticorpi nel siero EMA ttg DGP

10 CELIACHIA FISIOPATOLOGIA

11 1) Innesco 2) Predisposizione genetica 3) Intestino tenue permeabile

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13 gliadina la più tossica, costituita da 266 aminoacidi Per quale motivo? Perché questa catena è costuita da sequenze aminoacidiche glutamina prolina, di difficile digestione da parte di peptidasi gastroenteriche perciò rimane indigerita anche per ore.

14 Le Tj intercellulari dell epitelio intestinale sono intatte e funzionano da barriera per il passaggio di macromolecole come il glutine La zonulina è un peptide intestinale coinvolto nella regolazione delle TJ che sembra essere responsabile dell incremento di pearmeabilità caratteristica della fase precoce della malattia celiaca

15 COMPROMESSO La zonulina è over-espressa per la stimolazione della gliadina La zonulina si lega al recettore sulla superficie degli enterociti, portando all apertura dell Tj I frammenti tossici della gliadine attraversano l epitelio intestinale e raggiungono la sottomucosa

16 I frammenti tossici di gliadina che attraversano l epitelio intestinale sono deamidati dalla ttg L APC presenta i complessi derivati ttg-gliadina sulla propria superficie attraverso le molecole DQ2/ DQ8

17 deamidazione ttg Glutamina Acido glutamico La ttg converte i residui di glutamina in residui di acido glutamico attraverso un processo di deamidazione I residui di acido glutamico, caricati negativamente, migliorano l affinità di legame e quindi il riconoscimento da parte dei linfociti T Peptide gliadina Peptide gliadina deamidata

18 La cellula T mediante il TCR riconosce il complesso gliadina-ttg presentato dall APC sulla molecola DQ2/DQ8 e sintetizza citochine che conducono al danno epiteliale

19 CELIACHIA GENETICA

20 94% HLA DQ2 (DQ2A1*0501,DQ2B1*0201) in linkage con DRB1 *03;*05;*07 4% HLA DQ8 (DQ8A1*0301, DQ8B1*0302) in linkage con DRB1 *04 2-3% HLA DQ2/DQ8 negativo o DQ2 con un unico dimero: DQ2A1*05/ DQ2B1*02

21 Le molecole HLA DI CLASSE 2 sono presenti solo in alcune cellule immunocompetenti in grado di effettuare la presentazione dell'antigene (apc = antigen presenting cell) quali linfociti B, macrofagi, cellule dendritiche e anche le cellule del Langerhans (cellule dendritiche presenti sulla cute). Il complesso HLA e un eterodimero formato da una catena alfa di 34 k dalton e una catena beta di 29 k dalton.

22 I loci che codificano per l HLA si trovano sul braccio corto del cromosoma 6

23 La catena a è codificata dagli alleli HLA DQA1 localizzati nel locus DQA1 La catena b è codificata dagli alleli HLA DQB1 localizzati nel locus DQB1

24 La posizione specifica di un gene su un cromosoma è definita locus genetico Un individuo ha 2 tipi differenti dello stesso gene (alleli) riferiti allo stesso locus La combinazione di alleli in loci differenti di un cromosoma può essere trasmessa in blocco A P L O T I P O

25 Nella popolazione generale si osserva un numero relativamente piccolo di combinazioni alleliche (aplotipi) dei geni del sistema HLA I geni della classe II nella celiachia sono disposti in particolari combinazioni alleliche (aplotipi) tra alleli dei loci DQa1, DQB1 e DRB1 Ad esempio, spesso si trovano nello stesso aplotipo gli alleli DQA1*05-DQB1*02-DRB1*03 (aplotipo DR3-DQ2) o gli alleli DQA1*03- DQB1*0302-DRB1*04 (aplotipo DR4-DQ8)

26 DQ2 e DQ8 sono glicoproteine di membrana espresse come eterodimeri a chain (34kD) e b chain(29kd) Sono localizzati sulla superficie di cellule immunocompetenti (LB, Macrofagi, cellule endoteliali, LT)

27 Circa il 90% dei celiaci presenta l aplotipo DQ2 e il rimanente 10% presenta l aplotipo DQ8 Durante il riarrangiamento della meiosi si verifica una forte associazione tra gli alleli dei loci DR e DQ del sistema HLA di classe II Gli aplotipi più comuni associati con la celiachia sono:

28 PERCHE L ASSOCIAZIONE TRA DQ2 e/o DQ8 E LA CELIACHIA? Il riconoscimento dei peptidi derivati dal glutine è possibile solo da parte di molecole DQ2 e/o DQ8

29 Gli alleli DQA1*05 e DQB1*02 si trovano sullo stesso cromosoma: si trovano in cis e in linkage disequilibrium con l allele DRB1*03

30 Gli alleli DQA1*05 e DQB1*02 si trovano in 2 cromosomi diversi: sono in trans

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32 HLA DQ2 / DQ8 NELLA POPOLAZIONE GENERALE Nella popolazione normale elevata frequenza dell eterodimero DQ2: 20-30% Solo il 3% dei soggetti DQ2 positivi sviluppano la celiachia

33 NOMENCLATURA DEL SISTEMA HLA Più recentemente sono state caratterizzate sequenze geniche, quindi è possibile determinare le varianti alleliche direttamente sul DNA Ciascuna specificità sierologica (definita a livello proteico) può corrispondere ad alleli differenti (definiti a livello di DNA)

34 NOMENCLATURA DEL SISTEMA HLA I geni che codificano le molecole del sistema HLA sono altamente polimorfici Le sequenze dei nuovi alleli HLA sono contenute nel Database IMGT/HLA

35 INTERPRETAZIONE DEL TEST GENETICO Soggetti omozigoti per l allele DQB1*02 presentano un rischio maggiore di sviluppare la celiachia

36 Il riconoscimento della gliadina è possibile solo se sono presenti molecole HLA DQ2 e/o DQ8 DQ2 e DQ8 sono glicoproteine di membrana espresse come eterodimeri formati da una catena alfa e una catena beta La catena alfa è codificata dagli alleli HLA DQA1 La catena beta è codificata dagli alleli HLA DQb1 Assenza DQ2 DQ8 NO malattia celiaca!!!

37 ACG Clinical Guidelines: Diagnosis and Management of Celiac Disease Alberto Rubio-Tapia, MD 1, Ivor D. Hill, MD 2, Ciar á n P. Kelly, MD 3, Audrey H. Calderwood, MD 4 and Joseph A. Murray, MD 1 Am J Gastroenterol 2013; 108: ; doi: /ajg ; published online 16 April 2013

38 Indicazioni all esecuzione dei test per la diagnosi di MC Dovrebbero essere sottoposte a test di laboratorio per la diagnosi di MC le seguenti categorie di soggetti: Soggetti con sintomi e segni di malassorbimento, come diarrea cronica con perdita di peso, steatorrea, dolore addominale post-prandiale e aerofagia, o con indici biochimici suggestivi di malassorbimento determinati in occasione di un controllo di laboratorio Soggetti con sintomi, segni o risultati di analisi di laboratorio, che possono indurre il sospetto di MC (osteoporosi, sterilità, calo ponderale, positività anticorpali, ecc.) Soggetti asintomatici per MC con un familiare di primo grado con diagnosi confermata di MC Soggetti con elevazione dei valori plasmatici delle transaminasi, non altrimenti spiegabile Soggetti con diabete di tipo I, che presentino sintomi gastrointestinali, o segni o analisi di laboratorio suggestivi per MC Soggetti che presentano possibili segni o sintomi di MC, aventi un familiare di primo grado con diagnosi confermata di MC

39 Quali test di laboratorio eseguire I test di laboratorio devono essere eseguiti in pazienti che praticano una dieta con contenuto libero di glutine Nei soggetti con età > 2 anni, eseguire solo il dosaggio degli anticorpi anti transglutaminasi IgA (TG-IgA) Nello screening di bambini con età < 2 anni, il test TG-IgA deve essere combinato con il test per la rilevazione degli anticorpi anti peptidi deamidati della gliadina di tipo IgG (DGP-IgG) e IgA (DGP-IgA) In caso di alta probabilità di MC e test TG-IgA negativo, deve essere considerata l ipotesi di deficit di IgA e devono essere dosate le IgA sieriche. Un approccio alternativo è quello di dosare contemporaneamente TG-IgA e gli anticorpi IgG contro i peptidi deamidati della gliadina (DGP-IgG) Nei soggetti con deficit di IgA, eseguire il dosaggio di TG-IgG e di DGP-IgG In caso forte di sospetto diagnostico, in assenza di positività dei marcatori di laboratorio, eseguire comunque la biopsia duodenale Gli anticorpi diretti contro i peptidi nativi della gliadina non devono essere dosati per la diagnosi di MC, ma per la diagnosi di gluten sensitivity L esecuzione di test diagnostici oltre al solo dosaggio di TG-IgA incrementa in maniera non significativa la sensibilità della diagnosi di MC, diminuendone la specificità, e per tale motivo non è raccomandata nelle popolazioni a basso rischio

40 Ruolo della ricerca degli aplotipi HLA a rischio per la predisposizione alla MC Il test HLA-DQ2/DQ8: non deve essere utilizzato di routine nella diagnosi della MC, tranne che in condizioni selezionate, quindi: deve essere eseguito solo per escludere la diagnosi di MC nei seguenti casi: A) soggetti negativi ai test di laboratorio con biopsia intestinale dubbia (Marsh I-II) B)valutazione di pazienti in regime dietetico privo di glutine nei quali non siano stati in precedenza effettuati test di laboratorio per la diagnosi di MC C) soggetti con diagnosi di laboratorio e istologica contraddittorie D) soggetti con sospetto di MC refrattaria al regime dietetico privo di glutine, laddove la precedente diagnosi di MC non sia certa E) soggetti con sindrome di Down

41 Monitoraggio di laboratorio della MC Il monitoraggio di laboratorio della MC comprende: il controllo dell aderenza alla dieta priva di glutine del soggetto affetto da MC mediante il dosaggio di TG-IgA e DGP IgG il monitoraggio dei soggetti con MC deve includere il controllo della normalizzazione del quadro anticorpale determinato all atto della prima valutazione di laboratorio

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44 ALGORITMO DIAGNOSTICO PROPOSTO DALL ESPGHAN (European Society of Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition)

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46 L UNICO MODO PER FARE UN OTTIMO LAVORO è AMARE QUELLO CHE SI FA

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48 ...la buona medicina non consiste nell indiscriminata applicazione degli esami di laboratorio ad un paziente, ma piueosto nell aver chiaro in mente quali probabilità ci sono che una certa analisi possa avere importanza nella diagnosi... W.G. Peabody, Boston med.j., 1922

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