HLA: Stato dell arte della ricerca e delle patologie correlate

Transcript

1 HLA: Stato dell arte della ricerca e delle patologie correlate Andrea Bontadini Immunogenetica Policlinico S.Orsola-Malpighi Bologna Centro Servizi Pievesestina 23 novembre 2013 Ciclo di Incontri Scientifici 2013

2 J. Dausset Premio Nobel per la Medicina 1980 La storia dell HLA 1956 K. Mullis Premio Nobel per la Chimica Hu1 = Dausset LA = (Payne-Bodmer) H-LA HLA= Human Leukocyte Antigen

3

4 Reazione polimerasica a catena (PCR) PCR-SSO PCR-SSOrev Mullis PCR-SSP Reazione polimerasica a catena (PCR) PCR-Luminex PCR-SBT Taq polimerasi PCR- Micro Array

5 DOVE SI TROVA IL COMPLESSO MAGGIORE DI ISTOCOMPATIBILITA (HLA)? Cromosoma 6

6 The Major Histocompatibility Complex MHC mammiferi Human leukocyte antigen (HLA) - humans

7 The Major Histocompatibility Complex Class II DP, DQ, DR TAP, LMP Class III C proteins TNF Class I HLA-A, A, -B, -C

8 HLA class I. molecules 1. Heavy chain α1, α2 2 domain: polymorphic sites α3 3 domain: binding of CD8 2. β-2 β 2 microglobulin 3. peptide

9 Structure of HLA class II. molecules 1. α chain α1: polymorphic sites α2: binding of CD4 2. β chain β1: polymorphic sites β2: binding of CD4 3. peptide

10 MHC Class I polymorphism Number of alleles/proteins Alleles Proteins A B C E F G The most important HLA class I loci in transplantation are those with the largest number of alleles; HLA-A, -B, and -C

11 MHC Class II polymorphism Number of alleles/proteins Alleles Proteins a b a1 b1 a1 b1 DR DQ DP The most important HLA class II loci in transplantation are those with the largest number of alleles; HLA-DR β, -DQ α1 and β1, and DP α1 and β1

12 Polymorphism of HLA Class I and Class II Molecules The MHC region is one of the most polymorphic regions of the human genome polymorphism is focused around the peptide binding region Polymorphisms help to ensure survival of the species against major pathogen epidemics Top view of MHC

13

14 Come studiare l HLAl Antigeni HLA Superficie cellulare Sierologia Geni o alleli DNA Biologia molecolare

15

16

17 Nomenclatura: sierologia vs biologia molecolare Sierologia Anticorpi DR4 Molecolare Amplificazione DNA DRB1*0401 DRB1*0402 DRB1*0403 DRB1*0404 DRB1*0405 DRB1*0424

18 >

19 Nomenclatura HLA Complesso HLA HLA-A Locus HLA-A* A*02 Antigene equivalente HLA-A*02: A*02:0101 Specificità allelica HLA-A*02:01 A*02:01N Null allele HLA-A*02:01: A*02:01:0101 Mutazione silente (coding region) HLA-A*02:01: A*02:01:01:0101:01 Mutazione regione non codificante HLA-A*02:01:01 A*02:01:01L Bassa espressione del gene

20 La definizione e l estensione del polimorfismo HLA è stata resa possibile da: Evoluzione delle tecniche di tipizzazione Grandi numeri (Registri donatori di CSE) Globalizzazione della tipizzazione HLA

21 Common and Well -documented HLA Allelles Report of the Ad-Hoc Committee of the American Society for Histocompatibility and Immunogenetics P. Cano et al. Human Immunology 2007

22 Studi di popolazione: Frequenza antigeni HLA (%) Ag Cauc Afr-Am Asian Hisp A A A B B B

23 Pressione selettiva dell ambiente sul Sistema HLA Evoluzione dei patogeni per evitare la presentazione dell antigene Mediata da determinate specificità HLA - 60% della popolazione cinese delle regioni Est e della Nuova Guinea esprimono l HLA-A11: nella popolazione caucasica il 10%. - L HLA -A11 lega un importante peptide del EBV. Molti ceppi di EBV isolate da queste aree sono mutant pertanto il peptide non viene riconosciuto dalla molecola HLA-A11. Evoluzione dell HLA per eliminare i patogeni - Nelle aree dell Africa occidentale dove la malaria è endemic, l HLA-B53 è associate ad una forma di protezione di forme letali della malaria.

24

25 ETEROGENEITA DELLA POPOLAZIONE IN ESAME % probabilità ricerca positiva Componenti Giappone Europei Nord America Registro

26 Quante combinazioni HLA esistono? N. Possibili fenotipi 9.48 x N. Possibili aplotipi N. Possibili genotipi 3.14 x x Perché è possibile trovare un donatore HLA identico? ANTIGENI HLA PIU FREQUENTI IN ASSOCIAZIONE PREFERENZIALE (Linkage disequilibrium) Fenomeno per cui, a livello di popolazione, specifiche combinazioni di alleli a due o più loci concatenati tendono a trovarsi insieme sullo stesso cromosoma piu' frequentemente di quanto ci si attenda per caso. E un evento che riguarda loci molto strettamente concatenati tra i quali, quindi, sono molto rare le ricombinazioni.

27 Valutazione statistica dell Associazione HLA e Malattie L'esistenza della associazione si dimostra confrontando la frequenza della malattia in due popolazioni costituite rispettivamente da soggetti esposti e non esposti. In uno studio prospettivo la misura di associazione è il rischio relativo (RR). Uno studio prospettivo inizia suddividendo la popolazione in esposti e non esposti e poi osservando nel tempo quanti fra gli esposti (e quanti fra i nonesposti) si ammalano. malattia esposizione Si no totali Si A B A+B no C D C+D A+C B+D N Rischio relativo: incremento della frequenza di malattia in individui con determinato allele rispetto a quelli senza l allele Un valore =1 indica assenza di associazione tra malattia ed esposizione Un valore <1 indica una associazione negativa (cioè il fattore può proteggere dalla malattia) Un rapporto >1 indica l'esistenza di una associazione positiva (il fattore può causare la malattia). Naturalmente, valori crescenti indicano associazioni più forti.

28 HLA in associazione con le malattie Tipologia di malattia/condizione associata a HLA N. di malattie/condizioni Immunitaria 63 Infettiva 8 Respiratoria 2 Neurologica 4 Psichiatrica 3 Vascolare/cardiovascolare 8 Neoplastica 8 Metabolica 4 Dermatologica 1 Ginecologica 1 Oculistica 2 Epatologica 2 Nefrologica 1 Otorino-laringoiatrica 2 Totale 109

29 HLA e Malattie Due eziopatogenesi L HLA svolge presentazione un ruolo primario nella di peptidi ai linfociti T patologie su base autoimmune L associazione con HLA è dovuta a linkage disequilibrium con il gene che svolge un ruolo primario e che spesso non è conosciuto. l emocromatosi ereditaria è fortemente associata ad HLA- A*03 in quanto questo allele è in linkage disequilibrium con il gene HFE che presenta la mutazione tipica della malattia

30 Genetica del Diabete Tipo 1 Osservazioni Il 40-50% dei gemelli monozigoti di pazienti affetti, sviluppa la malattia (contro una prevalenza di 0,4% nella popolazione americana) Il 12-16% 16% dei fratelli HLA identici di pazienti affetti svilupperà malattia contro il 5-6% dei fratelli non HLA identici. Considerazioni 1. Il T1D ha una forte componente genetica MA 2. solo una parte di chi eredita gli alleli predisponenti va incontro a malattia (fattori ambientali). 3. Questa è una chiara evidenza del ruolo di uno (o più) geni MHC nella genesi del T1D MA 4. il tasso di concordanza più elevato tra i gemelli monozigoti rispetto ai fratelli HLA identici depone per un ruolo ANCHE di fattori genetici non-mhc.

31 Possibili associazioni HLA e Diabete Tipo 1 DR3 DR4 DR3/4 Più del 90% dei pazienti di origine Caucasica sono portatori dell'aplotipo DRB1*0301-DQA1*0501-DQB1*0201 o DRB1*0401-DQA1*0301-DQB1*0302. E' stato visto un effetto sinergistico negli eterozigoti DRB1*03/DRB1*04 con un rischio di sviluppare T1D che diventa dalle 20 alle 40 volte superiore rispetto alla popolazione in generale. DRB1* DQB1* DRB1* DQB1* OR

32 Uveite anteriore acuta B27 Anteriore, unilaterale, ad esordio improvviso Malattia di Behçet B51 Anteriore, acuta, posteriore acuta o cronica Uveite Circa il 55% dei Caucasici con uveite anteriore presenta una positività per HLA-B27, contro l 8-10% della popolazione generale; spesso questa positività si associa con la comparsa di spondiloartropatie quali la spondilite anchilosante Malattia di Bechet La presenza del gene HLA-B*5101, pur conferendo un alto rischio di malattia (RR va da 6 a 10), non esaurisce la totalità dei casi. Molti pazienti hanno la malattia e non l allele di suscettibilità.

33

34 HLA-B27 and Ankylosing Spondylitis A.S. >90% B27+ HLA-B*27 ~8% of population ~2% of B*27+ AS B*27:01, B*27:04, B*27:05 predispongono B*27:05, B*27:09 protettivi

35 DQ2-DQ8 e Celiachia TEST DI II LIVELLO: Tipizzazione HLA (dopo anticorpi e/o biopsia non diagnostici) Paziente Negatività DQ2/ DQ8 bassissima probabilità di celiachia Positività DQ2 o DQ8 predisposizione alla malattia Nei familiari di 1 1 grado Negatività di DQ2 e di DQ8: i casi di celiachia DQ2, DQ8 negativi sono estremamente rari. Positività per DQ2 o DQ8 nei familiari di celiaci è indicativa di predisposizione genetica alla celiachia e deve indurci al monitoraggio periodico di questi soggetti con controlli

36

37 Test genetico di suscettibilità La tipizzazione HLA nella celiachia è un test genetico di suscettibilità che valuta la maggiore o minore predisposizione di un individuo a sviluppare la malattia; ha un valore diagnostico limitato, in quanto le molecole HLA a rischio non sono da sole sufficienti a determinare la malattia che compare soltanto in seguito all esposizione a fattori ambientali scatenanti e in presenza di altri fattori genetici. L analisi dei geni HLA di suscettibilità ha soprattutto valore predittivo negativo, in quanto l assenza di alleli a rischio rende altamente improbabile lo sviluppo della malattia. Quando e a chi fare l indagine L indagine HLA è indicata come test di II livello in caso di incertezza diagnostica (p.e. anticorpi e/o biopsia dubbi o discrepanti) o in soggetti appartenenti a categorie a rischio, cioè familiari di celiaci (genitori, figli e fratelli) e pazienti affetti da malattie associate alla celiachia

38

39 HLA e farmacogenetica L ipersensibilità ai farmaci è una realtà clinica che affligge circa il 7% della popolazione generale e la non predittibilità ne rappresenta il lato più disarmante. Vi sono essenzialmente due teorie sull associazione HLA ed ipersensibilità al farmaco: 1) il farmaco si comporta da aptene e 2) il farmaco si comporta da ligando. L Abacavir è uno dei farmaci utilizzati per il trattamento dell HIV; lo screening prospettico per HLA-B*5701 può ridurre l incidenza dei casi di ipersensibilità; escludendo dalla terapia con ABC i pazienti positivi per B*5701, sono state eliminate le reazioni di ipersensibilità lo stato di portatori di HLA-B*5701 (6%) demarca chiaramente un gruppo di pazienti ad alto rischio.

40 Tipizzazione HLA Costi e appropriatezza

41 Quando richiedere l l HLA Il Laboratorio di Immunogenetica non eroga solo un referto, ma un consulto E giusto chiedere subito l l HLA come test diagnostico? Quale è il giusto rapporto costo/benefici per eseguire la tipizzazione HLA?

42 Che cosa valutare Tipizzazione dei loci HLA in associazione con la patologia che stiamo inquadrando. E un dato genetico e come tale non va ripetuto Valutare l associazione l HLA, ma anche l etnia del paziente Valutare se necessario estendere la tipizzazione ad altri componenti familiari

43 Trapianto di midollo osseo allogenico COMPATIBILI NON COMPATIBILI TRAPIANTO NO TRAPIANTO RICERCA DI UN DONATORE NON CORRELATO BMDW REGISTRO BANCA DI SANGUE CORDONALE

44 Gli antigeni del MHC nel TMO da donatore non correlato Petersdorf et al, Blood 1998 GVHD Allele match Single Class I Multiple Class I Single Class II Class I and Class II TMO da consanguineo Days after transplantation

45 Compatibilità HLA e stato della malattia al trapianto N trapianti di CSE (dati dal programma NMDP) Periodo Patologia: LAL, LAM, LMC, SMD Studio compatibilità Alta risoluzione Malattia in prima RC Malattia avanzata S u r v i v a l 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 8/8 HLA Matched (n=835) 7/8 HLA Matched (n=379) Log-rank p-value = < Months after transplant 6/8 HLA Matched (n=241) S u r v i v a l 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Log-rank p-value = /8 HLA Matched (n=327) 7/8 HLA Matched (n=195) 6/8 HLA Matched (n=123) Months after transplant Lee et al, Blood 2007

46 MIDOLLO OSSEO Centro Trapianti Laboratorio HLA Test di conferma Finale pre-trapianto REGISTRO Tipizzazione per attivazione IBMDR BMDW Se il paziente non va al midollo, il midollo va al paziente

47 Immunogenetica S.Orsola-Malpighi Dr.ssa F. Fruet Dr.ssa S. Iannelli Dr.ssa F. Franceschetti Sig.ra S. Capelli Sig. R. Masi Sig.ra L. Pravisano Sig.ra E.Matteucci Sig.ra A.Pallotti Sig. D. Pisapia