La diagnosi genetica della talassemia. Dott.ssa L.Pagano. Unità Operativa Microcitemia Dipartimento di Onco-Ematologia A.O.R.N. A.

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Orlando Grosso
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1 Diapositiva 1 La diagnosi genetica della talassemia Dott.ssa L.Pagano Unità Operativa Microcitemia Dipartimento di Onco-Ematologia A.O.R.N. A. Cardarelli Napoli 2 Dicembre 2005 Castel dell Ovo Sala Virgilio Napoli Diapositiva 2

2 Diapositiva 3 CHE COS E IL DNA DNA La molecola di DNA è un lungo polimero costituito da quattro unità monomeriche chiamate nucleotidi. Il singolo filamento di DNA è costitutito da una catena di nucleotidi uniti da legami fosfodiesterici, nei quali un gruppo fosfato forma un ponte tra gruppi OH di due residui adiacenti di zucchero. Infine le singole catene sono stabilizzate da legami idrogeno che si formano tra i nucleotidi complementari. Diapositiva 4 Localizzazione dei geni globinici sui cromosomi 11 e 16

Il singolo filamento di DNA è costitutito da una catena di nucleotidi uniti da legami fosfodiesterici, nei quali un gruppo

3 Diapositiva 5 L Emoglobina (Hb) Struttura quaternaria Proteina contenuta nei globuli rossi che ha la funzione di trasportare l ossigeno alle cellule del corpo e di eliminare l anidride carbonica Emoglobine nell adulto Hb A: α 2 β 2 (>96%) Hb A 2 : α 2 δ 2 (<3.4%) Hb F: α 2 γ 2 (<1%) Diapositiva 6 Emoglobine normali γ 2 α 2 β 2 α 2 δ 2 α 2

eliminare l anidride carbonica Emoglobine nell adulto Hb A: α 2 β 2 (>96%) Hb A 2 :

4 Diapositiva 7 Emoglobinopatie (Difetti dell emoglobina) Sintesi Difetti di: Struttura Talassemie Varianti Hb Varianti con fenotipo talassemico Diapositiva 8 β Talassemia La BETA TALASSEMIA consiste in una ridotta o assente sintesi della catena beta globinica causata da mutazioni prevalentemente puntiformi all interno del gene: microdelezioni, difetti di trascrizione e traduzione, difetti di maturazione del trascritto e difetti che compromettono la stabilità della catena globinica

catena beta globinica causata da mutazioni prevalentemente puntiformi all interno del gene: microdelezioni, difetti di

5 Diapositiva 9 β (nonα) α Sintesi bilanciata: si ha nel soggetto normale e in presenza della maggior parte di varianti Hb β β + Beta Talassemie: α / non α > 1 Diapositiva 10 Localizzazione dei difetti talassemici sul gene β promoter 1 IVSI 2 IVSII nel promoter: ( β+ ) 2- microdelezione CD6 (-A): codon non-senso ( β ) 3- segnale di stop: codon non-senso CD39 (C T) ( β ) 4- abolita giunzione di splicing: ( β ) 5- sequenza di consenso alterata: ( β+ ) 6- attivazione sito criptico: ( β+ ) 7- delezione di 600 basi, inizio in IVS2 ( β )

promoter: ( β+ ) 2- microdelezione CD6 (-A): codon non-senso ( β ) 3- segnale di stop: codon non-senso CD39 (C T) ( β ) 4- abolita

6 Diapositiva 11 INCIDENZA DELLA BETA TALASSEMIA IN ITALIA 2.4% 4.5% 3% 12% 2% 5% 13% 2.5% 3.5% 8% 6% 7% 7% Diapositiva 12 Frequenza dei difetti β Tal. nelle zone a maggior incidenza Cod 39 IVSI 110

7 Diapositiva 13 Frequenza delle mutazioni β-talassemiche in 261 coppie a rischio di origine campana (n=522) CD 39 39,0% IVS I ,0% IVS I 1 10,5% IVS I 6 8,6% IVSII 1 5,4% IVS II 745 5,0% Hb Lepore 3,8% HbS 2,5% -87 1,7% Hb Neapolis 1,5% -COD 6 1,3% Delta Beta 0,6% ,4% Non identificate 0,7% Diapositiva 14 α Talassemia L ALFA TALASSEMIA consiste in una ridotta o assente sintesi delle catene α globiniche: è causata da disordini ereditari caratterizzati prevalentemente da delezione dei geni alfa globinici α1 e/o α2 o più raramente da mutazioni puntiformi o microdelezioni.

identificate 0,7% Diapositiva 14 α Talassemia L ALFA TALASSEMIA consiste in una ridotta o assente sintesi delle catene α globiniche: è causata da

8 Diapositiva 15 Normale β α Alfa Talassemie: α / non α < 1 α α + Diapositiva 16 Struttura dei geni α globinici S.A.Liebhaber, 1989

9 Diapositiva 17 tratto α+ (α-talassemico tipo 2) portatore sano tratto α (talassemico tipo 1) portatore sano malattia da HbH idrope fetale Diapositiva 18 Delezioni nel cluster α che danno origine ad α Talassemia

10 Diapositiva 19 α Thalassemia nel Mediterraneo Difetti Frequenza(%) Del -3.7 Kb 61.1% Del Kb 2.0% Del Kb (--Med) 7.4% Del Kb 4.5% NCO-I 11.5% HpH-I 4.5% Altre 9.0% Diapositiva 20 Emoglobinopatie (Difetti dell emoglobina) Sintesi Difetti di: Struttura Talassemie Varianti Hb Varianti con fenotipo talassemico

11 Diapositiva 21 Distribuzione delle più frequenti Hb varianti in Italia Diapositiva 22 Hb variants Amino acid substitution Origin 1.Hb Lepore δ87/β116 Campania 2.HbA2 Yialausa δ27(b9) Ala Leu Campania 3.Hb S β6(a3)glu Val Campania (Costa D Avorio) 4.Hb D Los Angeles β121(gh4)glu Gln Campania 5.Hb Neapolis β126(h4)val Gly Campania 6.Hb G-San Josè β7(a4) Glu Gly Campania 7.Hb C β6(a3)glu Lys Campania (extracomunitari) 8.Hb E β26(b8)glu Lys Campania (extracomunitari) 9.Hb Koln β98(fg5)val Met Campania 10.Hb O-Arab β121(gh4)glu Lys Campania (extracomunitari) 11.Hb Rainier β145(hc2)tyr Cys Campania 12.Hb Peterborough β111(g13)val Phe Campania 13.Hb Villejuif β123(h1)thr Ile Campania 14.Hb Leiden β6(a3) or β7(a4)glu 0 Campania 15.Hb Cardarelli β86(b3)ala Pro Campania 16 Hb City of Hope β69(e13)gly Ser Campania 17 Hb Copenaghen β47(cd6)asp Asn Campania 18.Hb Indianapolis β112(g13)cys Arg Campania 19.Hb Vila Real β36(c2)pro His Campania 20.Hb M-Hyde Park β92(f8)his Tyr Campania 21.Hb J-Bangkok β56 (D7)Gly Asp Campania 22.Hb Tende β124(h2)pro Leu Campania 23.Hb J-Oxford α15(a13)gly Asp Campania 24.Hb Shimonoseki α54(e3)gln Asp Campania * nuove varianti identificate

Hb G-San Josè β7(a4) Glu Gly Campania 7.Hb C β6(a3)glu Lys Campania (extracomunitari) 8.Hb E β26(b8)glu Lys Campania (extracomunitari) 9.Hb Koln β98(fg5)val Met Campania 10.

12 Diapositiva 23 Hb Neapolis β126(h4) val gly Diapositiva 24 Hb Neapolis β126(h4) val gly Hb (g/dl) - MCV (fl) 75.8 MCH (pg) 25.1 HbA2 (%) 3.5 HPLC delle emoglobine Hb Neapolis Spettro di massa della catena beta variante HPLC delle catene globiniche

13 Diapositiva 25 ARMS Neapolis GTG GGG 633 bp 287 bp Linea 1, 3 e 5 : soggetti eterozigoti per l Hb Neapolis Linea 2 e 6 :soggetti normali Diapositiva 26 Hb Cardarelli β86(f2) Ala Pro

14 Diapositiva Stranieri che soggiornano legalmente in Italia nuovi arrivi nell ultimo anno di cui per ricongiungersi ai familiari nati nell ultimo anno da genitori entrambi stranieri Dal Dossier Statistico Immigrazioni 2005 della Caritas Italiana e dati del Ministero dell Interno Diapositiva 28 Indagini di 1 livello per Talassemie e/o Varianti Hb Anamnesi e Prelievo Esame della morfologia eritrocitaria Separazione cromatografica delle diverse componenti emoglobiniche mediante HPLC Valutazione del Ferro Elettroforesi Hb (alcalina e/o acida) Diagnosi presuntiva

000 nati nell ultimo anno da genitori entrambi stranieri Dal Dossier Statistico Immigrazioni 2005 della Caritas Italiana e dati del Ministero dell

15 Diapositiva 29 Dal 1 livello Altre indagini a supporto del 1 1 livello Test di Sickling Conteggio reticolociti Hb S Ricerca inclusioni endoeritrocitarie Test di stabilità in vitro dell Hb Analisi affinità per l O 2 : P50 Separazione cromatografica delle catene globiniche mediante HPLC Diapositiva 30 Quando proseguire con le indagini di 2 livello: Il 1 livello non riesce ad escludere o accertare la presenza di difetti Hb (talassemie o varianti). Si sospetta la presenza di più difetti Hb. La caratterizzazione dei difetti, mostrati dal 1 livello, può essere di supporto alla valutazione del rischio genetico o all approccio terapeutico. Occorre conoscere i difetti molecolari per consentire la diagnosi prenatale.

1 livello non riesce ad escludere o accertare la presenza di difetti Hb (talassemie o varianti). Si sospetta la presenza di più difetti Hb.

16 Diapositiva 31 Diapositiva 32 FAMILY PEDIGREE D.L. I N 1 2 II 1 N N N III III N CD 39 α2 HphII -α 3.7 IVSI-6

17 Diapositiva 33 COSA DEVE FARE UNA COPPIA A RISCHIO? Se due portatori di beta talassemia decidono di avere un figlio, devono sottoporsi alle indagini di 2 livello: Estrazione del DNA ( ) Analisi delle mutazioni del DNA ( ) Diapositiva 34 Tecniche di biologia molecolare applicate alla diagnostica ESTRAZIONE DEL DNA O RNA CAMPIONI BIOLOGICI conservazione a -20 C PCR DGGE IDENTIFICAZIONE DELL AMPLIFICATO analisi di un gene e delle sue mutazioni ASO REVERSE DOT BLOT MICROPIASTRA SEQUENZIAMENTO DEL DNA ARMS

(91.36.5) Analisi delle mutazioni del DNA (91.30.

18 Diapositiva 35 Analisi molecolare per la ricerca di eventuali difetti talassemici Indagini di 2 2 livello HPLC dei peptidi triptici e analisi della sequenza aminoacidica Spettrometria di massa Analisi della sequenza nucleotidica Valutazione del possibile fenotipo clinico in rapporto al genotipo noto Consultazione banche-dati Diagnosi conclusiva Diapositiva 36 Valutazione del possibile fenotipo clinico in rapporto al genotipo noto Consultazione banche-dati Diagnosi conclusiva Consulenza genetica in relazione alle mutazioni identificate, Valutazioni del rischio ed eventuale indicazione alla diagnosi prenatale

Consultazione banche-dati Diagnosi conclusiva Diapositiva 36 Valutazione del possibile fenotipo clinico in rapporto al genotipo noto Consultazione

19 Diapositiva 37 Diagnosi Prenatale La diagnosi prenatale della talassemia e delle emoglobinopatie attualmente viene eseguita, quasi esclusivamente, mediante analisi molecolare del DNA da un prelievo di villi coriali (Villocentesi). L approccio diagnostico deve essere tale da permettere la caratterizzazione dei genitori e ridurre il più possibile il rischio di diagnosi non-informative Diapositiva 38 VILLOCENTESI La villocentesi consiste nel prelievo di tessuto placentare,villi coriali, si esegue tra la settimana di gestazione. L esame consiste in una puntura dell addome materno sotto guida ecografica e comporta un rischio di aborto inferiore all 1%. Dai villi coriali si estrae il DNA FETALE e con le tecniche di biologia molecolare si ricercano le mutazioni identificate nei genitori.

L approccio diagnostico deve essere tale da permettere la caratterizzazione dei genitori e ridurre il più possibile il rischio di diagnosi non-informative Diapositiva 38 VILLOCENTESI La villocentesi

20 Diapositiva 39 INFORMAZIONE SCREENING Distribuzione di materiale informativo alle coppie che richiedono documenti agli uffici comunali Corsi di formazione per medici di base e dei consultori familiari, ginecologi Informazione presso i corsi Prematrimoniali Divulgazione agli studenti degli Istituti Superiori PREVENZIONE Popolazione target: coppie a rischio in età fertile Esami di I livello: emocromo, dosaggio HbA2, Dosaggio HbF Resistenze osmotiche, sideremia, ferritina Identificazione delle coppie a rischio Esami di II livello: Studio del DNA Spot pubblicitari su TG regionale e/o televisioni private Diagnosi prenatale: tra la 10 alla 12 sett di geastazione Diapositiva 40 Unità Operativa Microcitemia Dipartimento di Onco-Ematologia A.O.R.N. A. Cardarelli Napoli Dirigente medico Dott. L. Prossomariti Dirigente biologo Dott.ssa L.Pagano Dirigente biologo Dott.ssa C. Placida Tecnici di laboratorio A. Salamandra C.Zito Biologo volontario Dott.M.Ammirabile

livello: emocromo, dosaggio HbA2, Dosaggio HbF Resistenze osmotiche, sideremia, ferritina Identificazione delle coppie a rischio Esami di II livello: Studio del DNA Spot pubblicitari su TG regionale

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