Mutazioni. Un cambiamento nel materiale genetico che non venga riparato dai meccanismi di riparo costituisce una mutazione

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1 Mutazioni Un cambiamento nel materiale genetico che non venga riparato dai meccanismi di riparo costituisce una mutazione Le mutazioni possono essere spontanee oppure causate da agenti fisici, chimici o biologici Le mutazioni sono la principale causa della variabilità genetica. Costituiscono il substrato su cui opera la selezione naturale e sono un elemento fondamentale per l evoluzione Mutagenesi: introduzione di alterazioni in una sequenza nucleotidica Mutagenesi random: le mutazioni avvengono a caso su un tratto di DNA. In genere si ottengono trattando il DNA con agenti chimici (es. Hydroxylamine). La miscela di mutanti ottenuta viene poi selezionata e, tramite sequenziamento, si identificano le mutazioni di interesse. Sono stati messi a punto diversi metodi per introdurre mutazioni in un gene clonato. Tutti questi impiegano enzimi o reattivi chimici in grado di degradare, tagliare o sintetizzare il DNA. Le mutazioni possono essere raggruppate in: Semplici delezioni o inserzioni di una o più basi Sostituzioni di una o più basi Frameshifts 1

2 Mutagenesi sito-specifica: introduzione di mutazioni in siti predeterminati del DNA. In questo caso, non si dovrebbe ottenere una popolazione mista di mutanti, ma una popolazione di mutanti portanti tutti la stessa mutazione. E buona norma, comunque, verificare sempre l avvenuta mutazione tramite sequenziamento. Attualmente il metodo più usato per la mutagenesi sito-specifica è quello che fa uso della PCR. Mutagenesi tramite PCR: Singoli errori di appaiamento presenti all interno dei primers possono essere incorporati nella molecola stampo durante la reazione di amplificazione. Si scrivono due primers che appaiano su filamenti opposti sulla stessa regione che si intende mutare. Durante la reazione di PCR si producono molecole di DNA che portano la stessa mutazione nella regione comune. 2

3 Il vantaggio di tale metodo è che il DNA stampo viene poi eliminato tramite digestione con l enzima DpnI. Solo lo stampo viene digerito perchè metilato. Il DNA mutato resta intatto e si usa per trasformare cellule ospiti producendo la mutazione desiderata con un efficienza del 90%. Effetti delle mutazioni sulla struttura delle proteine mutazione O trascrizione traduzione gene mrna La Traduzione ha due possibili esiti: (1) un cambio nella sequenza aminoacidica o (2) nessun cambiamento. A.Cambiamenti di una singola base Un cambiamento in una singola base di DNA: 1. Mutazioni silenti 2. Mutazioni missenso 3. Mutazioni nonsenso 3

4 1. Mutazioni Silenti DNA...TAC......ATG... mutazione...tat......ata... RNA Polipeptide...UAC... tirosina...uau... tirosina Nessun cambiamento nel polipeptide 2. Mutazioni Missenso DNA...TAC......ATG... mutazione...aac......ttg... RNA Polipeptide...UAC... tirosina...aac... asparagina Un aminoacido è cambiato nel polipeptide. 3. Mutazioni Nonsenso (la mutazione resulta in un codone di stop) DNA...TAC......ATG... mutazione...tag......atc... RNA...UAC......UAG... Polipeptide tirosina stop codon Si produce un polipeptide troncato. 4

5 B. Delezioni Una o più basi vengono perse ATGAAAGAG... ATGGAG... Risultati possibili a. aminoacidi o polipeptidi possono essere persi b. può avvenire frameshifts C. Inserzioni Uno o più basi vengono aggiunte ATGGAG... ATGAAAGAG... Possibili resultati a. aminoacidi o polipeptidi possono essere inseriti b. può avvenire un frameshifts D. Frameshift Inserzioni o delezioni che cambiano il frame di lettura ATGCAAGTTG... delezione di una coppia di basi ATGAAGTTG... Due cambiamenti nel polipeptide sono possibili: (1) tutti gli aminoacidi a valle della mutazione cambiati, (2) viene prodotta una proteina tronca 5

6 DNA può avere 3 frames di lettura: A T G C A A G T T G A A T G C A A G T T G A #1 met gln val A T G C A A G T T G A #2 cys lys leu A T G C A A G T T G A #3 ala ser STOP Le mutazioni di frameshift cambiano il frame di lettura ATGCAAGTTGA. met gln val ATCAAGTTGA ile lys leu delezione di una singola base (Frameshifts avviene solo se l inserzione o la delezione è in una porzione codificante per una proteina.) Effetto delle mutazioni in una sequenza amminoacidica: sequenza wild type: 5 -ATG CCT TCA AGA TGT GGG CAA-3 Met Pro Ser Arg Cys Gly Gln Mutazione silente: 5 -ATG CCT TCA AGA TGT GGA CAA-3 Met Pro Ser Arg Cys Gly Gln Mutazione missenso: 5 -ATG CCT TCA GGA TGT GGA CAA-3 Met Pro Ser Gly Cys Gly Gln Mutazione non senso: 5 -ATG CCT TCA AGA TGA GGA CAA-3 Met Pro Ser Arg Stop Gly Gln Frame shift in seguito a delezione: 5 -ATG CCT TCA AGT GTG GGC AA-3 Met Pro Ser Ser Val Gly etc 6

7 III. Effetti delle mutazioni sulla funzione di una proteina 1. Nessun effetto (comune) 2. Perdita di funzione (comune) 3. Parziale perdita di funzione (rara) 4. Eventuale perdita di funzione 5. Cambio di funzione (raro) 6. Recupero della funzione (reversione) 1. Nessun effetto (comune) A seconda della proteina, fino all 80% degli aminoacidi possono non avere nessun ruolo funzionale wild type (proteina normale) Proteina mutata 2. perdita di funzione (comune) Esempi: a. un cambiamento in un aminoacido che partecipa direttamente alla catalisi (cambio nel sito attivo) wild type (proteina normale) Proteina mutante 7

8 2. Perdita di funzione b. Un cambiamento in un aminoacido che causa un alterazione della struttura della proteina Proteina wild type misfolded Proteina mutante aminoacidi degradazione 3. Parziale perdita di funzione, (comune) Riduzione dell attività catalitica di un enzima dovuta ad una variazione di struttura e/o di stabilità. wild type Proteina mutante 4. Potenziale perdita di funzione (comune) Es: mutanti sensibili al calore 30 C 42 C foldata proteina mutante misfolded degradazione amino acidi 8

9 5. Cambio di funzione Es. cambio in specificità wild type proteina Converte il maltosio in 2 molecole di glucosio proteina mutante converte il lattosio a glucosio e galattosio 6. Ripristino della funzione "mutazione inversa" (rara) Proteina mutante Non funzionale una seconda mutazione funzionale a) Mutazione inversa vera Una seconda mutazione ripristina la sequenza di DNA originale. b) Mutazioni casuali Una seconda mutazione sullo stesso sito dà luogo ad un cambio di amino acido meno drammatico. 9

10 Frequenza delle mutazioni Le mutazioni spontanee avvengono con una frequenza di circa 10-9 / basi / generazione I mutageni sono usati per incrementare la frequenza di mutazioni a ~10-6 to 10-7 / basi / generazione radiazioni UV ionizzanti Fisici calore Agenti mutageni Chimici analoghi delle basi modificanti le basi intercalanti Biologici elementi trasponibili Qualunque elemento presente nell ambiente che aumenti in maniera significativa il tasso di mutazione al di sopra di quello spontaneo viene detto MUTAGENO Timina O H N CH 3 O N H Bromouracile O H N Br O N H Il Bromouracile viene incorporato nel DNA al posto della timina. Durante la replicazione del DNA, il bromouracile non appaia con l adenina e causa una mutazione puntiforme 10

11 Agenti alchilanti Composti che modificano le basi del DNA chimicamente Durante la replicazione il DNA modificato non appaia causando una mutazione puntiforme. Agenti intercalanti Si inseriscono tra le basi del DNA. Legami idrogeno Basi del DNA Agente intercalante (bromuro d etidio) Agenti intercalanti portano a piccole delezioni e inserzioni durante la replicazione del DNA. Radiazioni Luce ultravioletta (UV) O O H CH 3 CH 3 N O N N N O H Dimeri di Timina: due "T sullo stesso filamento si legano in modo covalente. I dimeri di Timina portano ad errori nella replicazione. 11

12 Trattamento dei batteri con un mutageno (produce mutazioni in siti random). Coltura mutagenizzata diluire e piastrare su un medium ricco Selezione o screening di ceppi mutanti che rechiedono un particolare substrato per crescere Piastra di replica Medium minimale senza substrato Medium minimale con substrato - Preparazione di colture per ceppi che richiedono il substrato per crescere. - Questi ceppi hanno mutazioni su geni necessari per la biosintesi di substrato. - Si scrive una lista di ceppi mutanti per indicare il loro genotipo e fenotipo. 12

13 Si nominano i geni e le mutazioni (Ad esempio per un gene che sintetizza istidina) Gene hisc Geni mutanti hisc1, hisc2, hisc3 Proteina Fenotipi HisC or (name of protein) His+ (può produrre istidina) His- (non può produrre istidina Organismi geneticamente modificati Un organismo transgenico è un organismo che porta materiale genetico trasferito (il transgene) che è stato inserito nel suo genoma. Utilità: -La funzione del gene può essere studiata nell intero organismo. -Il gene può essere sovraespresso-inattivato-modificato. -Tali manipolazioni possono essere dirette a tutti i tessuti del corpo oppure a tessuti/cellule specifiche -Tali manipolazioni possono essere dirette a stadi specifici dello sviluppo dell animale. Topi transgenici 1980: ottenimento del primo topo transgenico tramite Microiniezione di DNA estraneo in uova fecondate. Tre stadi: 1) Microiniezione del DNA nell uovo fecondato 2) Impianto dell embrione in una madre 3) Analisi dei cuccioli e delle generazioni successive. 13

14 1) Microiniezione del DNA nell uovo fecondato Le uova di topo femmina sono prelevate e fecondate. Il DNA estraneo(promotore, cdna codificante per il gene di interesse, segnale di poliadelinilazione) viene microiniettato nell uovo fecondato. Il DNA deve integrarsi nel genoma del topo prima che il DNA venga duplicato in prima divisione (att.ne topo mosaico). 2) Impianto dell embrione in una madre Gli embrioni sono impiantati in una madre pseudogravida. 3) Analisi dei cuccioli e delle generazioni successive. Si analizzano i cuccioli a 3-4 settimane di età per valutare la presenza del transgene (F 0 ). I topi positivi F 0 vengono incrociati tra loro per ottenere una seconda generazione F 1. Si analizzano i livelli di espressione dell mrna e della proteina codificata dal transgene. Possibile complicazione: Il gene è vitale per la sopravvivenza necessità sistemi inducibili. L integrazione del transgene avviene con una frequenza del 2.5-6% ed è casuale (avviene per ricombinazione NON omologa). Se si inserisce interrompendo un gene endogeno del topo ne impedisce la sua espressione necessità identificazione sito di inserzione del transgene. Topi Knock-out Un gene viene interrotto: non si esprime più. Cinque stadi: 1) Costruzione del vettore di targeting 2) Trasfezione cellule staminali embrionali (ES) 3) Selezione cellule 4) Introduzione delle cellule in embrioni di topo 5) Analisi e incrocio dei topi 14

15 1) Costruzione del vettore di targeting Il gene di interesse è interrotto tramite inserzione del gene neo r (neomicina fosfotrasferasi). Tale inserto è fiancheggiato da sequenze del gene di interesse che servono per la ricombinazione con il gene endogeno del topo. 2) Trasfezione in cellule ES Sono cellule staminali embrionali di topo: proliferano all infinito sono pluripotenti Queste sono trasfettate con il vettore di targeting; 3 possibilità: non c è ricombinazione/ si ha ricombinazione omologa (rara)/ si ha ricombinazione non omologa ( inserimento casuale) 3) Selezione cellule trasfettate Si selezionano le rare cellule in cui si è avuta ricombinazione Omologa. 4) Introduzione delle cellule in un embrione di topo. Si prendono embrioni di topo allo stadio di blastocisti (4,5 giorni) e qui si iniettano le cellule ES selezionate. L embrione ottenuto viene impiantato poi in una madre. 5) Analisi e incrocio dei topi Si analizzano i cuccioli ottenuti (analisi DNA) I maschi positivi si incrociano con femmine wt. I figli eterozigoti si incrociano tra loro per avere l omozigote. Blastocisti di topo 15

16 Cellule ES KO 650bp; WT 450bp; +/- 650 e 450bp Si conferma che il KO sia stato efficace. Si valutano tutte le possibili alterazioni fenotipiche, morfologiche o comportamentali degli animali KO rispetto alla popolazione wt. 16

17 Le stesse tecniche sono state modificate per essere impiegate anche per altri animali: animali domestici, pesci, scimmie. Utilità primati non umani per comprendere malattie che non si possono ricreare nel modello murino. Problemi etici e costi. 17