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1 Valorizzazione delle farine disoleate mediante proteasi industriali Alessandra Stefan Unità operativa: CSGI (Consorzio per lo Sviluppo dei Sistemi a Grande Interfase, Firenze) Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Unibo

2 Alejandro Hochkoeppler Alessandra Stefan Susanna Cinti Luisa Ugolini DIMORFIPA Giacomo Biagi Carlo Pinna

3 3 Attività e obiettivi OR1. Biomolecole per l industria: studio di tecnologie microbiologiche per la valorizzazione della glicerina (lieviti ingegnerizzati) OR2. Mezzi per l agricoltura: produzione di idrolizzati proteici ad alto contenuto amminoacidico per utilizzo nella fertilizzazione fogliare OR3. Alimentazione animale: produzione di idrolizzati proteici da utilizzare come integratori per l alimentazione degli animali di interesse zootecnico e di affezione

4 SEMI OLEAGINOSI Biodiesel OLIO Estrazione FARINA GLICERINA Idrolisi enzimatica Idrolisi enzimatica Biomolecole per l industria Mezzi tecnici per l agricoltura Alimentazione animale

5 Contenuto d olio variabile (25-45 %) 5 SEME OLEOSO Estrazione meccanica (pressa) Estrazione chimica (solventi) OLIO BIODIESEL PANNELLO FARINA

6 6 PANNELLO/FARINA IDROLIZZATI PROTEICI - Miscele complesse di peptidi di dimensioni variabili - Origine animale o vegetale - Diverse metodologie di produzione (idrolisi chimica o enzimatica) Prodotti con azione nutrizionale e biostimolante APPLICAZIONI: Fertilizzanti Integratori alimentari

7 7 FASI di STUDIO 1) caratterizzazione del materiale di partenza (farina girasole/colza) 2) screening di enzimi proteolitici 3) analisi dei parametri di processo 4) ottimizzazione del processo di idrolisi (a singolo/doppio stadio) 5) caratterizzazione dell idrolizzato proteico 6) scale-up (prove di digeribilità)

8 (1) Materiale di partenza Composizione della farina industriale estratta con esano e macinata Girasole Colza Olio 0,7 % Olio 3,5 % Proteine 28,8 % Proteine 32,5 % Cellulosa 24,3 % Cellulosa 24,3 % Ceneri 6,0 % Ceneri 6,5 % Umidità 8,3 % Umidità 9,5 % Azoto 4,6 % Azoto 5,2 % Fosforo 0,7 % Fosforo 0,8 % Carbonio 47,0 % Carbonio 42,7 % Sostanza organica (%) 93,1 % Sostanza organica (%) 93,5 % ph 6.1 ph 5.7 8

9 (1) Materiale di partenza Farina tal quale Isolato proteico (28,8-32,5 %) (73,4-92%) Idrolizzati proteici come fertilizzanti fogliari Idrolizzati proteici come integratori alimentari Peptidi e aa liberi Peptidi 9

10 10 (2) Screening enzimatico Individuazione di enzimi industriali presenti in commercio, facilmente reperibili ed economici PROTEASI: enzimi in grado di idrolizzare il legame peptidico tra gli amminoacidi di una proteina -esopeptidasi (accorciano la catena peptidica dall estremità) -endopeptidasi (frammentano la catena peptidica dall interno)

11 11 ENZIMI Termolisina: metallo-proteasi. Prodotta dal batterio Bacillus thermoproteolyticus. Attività a ph 8 e a 70 C. Endo-peptidasi. Pepsina: aspartato-proteasi. Enzima digestivo, estratta dallo stomaco di maiale. Attività a ph 2-4. Endo-peptidasi. Esperase: serin-proteasi. Prodotta da batteri del genere Bacillus. Attività a ph Endo-peptidasi ALCALASE: serin-proteasi. Prodotta da Bacillus licheniformis. Attività a ph Endo-peptidasi FLAVOURZYME: miscela di proteasi prodotte da Aspergillus oryzae. Attività a ph 6-7. Eso-peptidasi ed endo-petipdasi

12 12 (3) Analisi dei parametri del processo di idrolisi -Quantità di enzima (unità) -Temperatura di idrolisi (50-70 C) -Tempo di idrolisi (30, 60 e 120 min) -ph ( )

13 13 (4) Ottimizzazione del processo di idrolisi - a singolo stadio: alcalasi Idrolizzato proteico come additivo alimentare - a doppio stadio: alcalasi + flavourzyme Idrolizzato proteico come fertilizzante fogliare

14 14 Processo a singolo stadio Isolato proteico Idrolisi con Alcalasi 0.2 AU/gr proteina Temperatura di idrolisi: 50 C Tempo di idrolisi: 60 min ph 8 Liofilizzazione dell idrolizzato

15 15 Processo a doppio stadio Farina tal quale Idrolisi con Alcalasi 0.2 AU/gr proteina 50 C - 60 min ph 8 + Idrolisi con Flavourzyme 50 LAPU/gr proteina 50 C min ph 7 Liofilizzazione dell idrolizzato

16 16 CARATTERIZZAZIONE degli idrolizzati Composizione e contenuto proteico finale Analisi e composizione amminoacidica (HPLC) Analisi elettroforetica (SDS-PAGE) dei peptidi presenti

17 17 1) Idrolizzato come additivo alimentare Composizione % Farina di girasole Idrolizzato di girasole Farina di colza Idrolizzato di colza Umidità 5,92-6,51 - Proteine 28,8 75,7 32,5 63 Lipidi 0,79 1,11 2,96 7,35 Ceneri 6,74 13,1 7,01 12,4 NDF 47,2 1,08 36,1 0,38 ADF 38,3 1,52 21,9 1,2 ADL 11,9 0,39 10,3 0,3 Amido 3,78 1,89 14,4 1,98 Contenuto a.a. liberi 500 mg/l Peptidi di peso molecolare compreso tra 7-25 kda

18 18 Additivo alimentare -Digeribilità -Ipoallergenicità -Appetibilità Peptidi a basso peso molecolare facilmente digeribili a livello intestinale Incapaci di indurre reazioni allergiche all alimento Efficaci nel migliorare l appetibilità dell alimento da parte di cani e gatti

19 Scaleup Per eseguire le prove di digeribilità sono state preparati: 19 3,2 kg di farina di girasole 4,8 kg di farina di colza 480 g di idrolizzato liofilizzato (75 %) 456 g di idrolizzato liofilizzato (63 %) 2,6 kg scarto residuo solido 3,6 kg scarto residuo solido (3,2 % azoto) (3,4 % azoto) Produzione di biogas

20 20 Prove di digeribilità La digeribilità esprime la porzione di un alimento che può essere digerita ed assorbita dal tratto digerente di un animale Prove in vitro: il campione è sottoposto a due fasi di digestione enzimatica per simulare i processi digestivi (gastrico ed intestinale) La valutazione della digeribilità è stata eseguita su 4 diete: 1) 5 g Mix Cereali per cani + 4,85 g farina di Girasole 2) 5 g Mix Cereali per cani + 4,45 g farina di Colza 3) 5 g Mix Cereali per cani + 1,92 g Idrolizzato Girasole 4) 5 g Mix Cereali per cani + 2,43 g Idrolizzato Colza

21 21 Prove di digeribilità DIETA Digeribilità totale Digeribilità proteine Digeribilità lipidi Digeribilità ceneri gregge Mix + farina Girasole 63,4 89,1 93,8 38,4 Mix + farina Colza 72,5 87,1 95,4 35,8 Mix + Idrolizzato Girasole 90,1 96,1 95,8 89 Mix + Idolizzato Colza 90,4 96,1 97,8 89,7

22 2) Idrolizzato ad uso fertilizzante L idrolisi enzimatica a doppio stadio ha permesso di ottenere un prodotto con potenziale azione biostimolante - Contenuto di azoto pari al 9 % - Contenuto finale in a.a. liberi pari a 10 g/l - Peptidi a basso peso molecolare (inferiori a 6.5 kda) Gel elettroforesi 22

23 Composizione amminoacidica 23 Prodotto ad alto contenuto e varietà di aa liberi Contenuto: 10 g/l a.a. liberi (35 % azoto totale) Amminoacidi Fertilizzante di origine animale Fertilizzante di origine vegetale Idrolizzato Valso Ac. asp - 998,2 189,7 Ac. glut ,2 346,1 Asn - 140,6 638,3 Ser - 308,2 559,3 Gln ,8 His 48830,0-498,9 Gly - 167,0 342,1 Thr - 208,3 509,3 Arg - 206,6 1027,9 Ala 11810,0 703,0 511,3 Tyr ,3 Cys ,0 Val - 205,2 726,3 Met ,5 Ile ,6 Phe ,0 Leu - 363,8 925,7 Lys ,0 Pro ,2 TOTALE mg/l 4590 mg/l 10441,5 mg/l 10,8 % 2,9 % 34,5 %

24 CONCLUSIONI SEMI OLEAGINOSI Biodiesel OLIO Estrazione Residuo solido FARINA Idrolisi enzimatica BIOGAS IDROLIZZATI PROTEICI

25 CONCLUSIONI 25 Idrolizzato proteico (medio-corti peptidi e basso contenuto in a.a. liberi) INTEGRATORE ALIMENTARE Idrolizzato proteico (corti peptidi ed alto contenuto in a.a. liberi) FERTILIZZANTE FOGLIARE

26 GRAZIE PER L ATTENZIONE

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