Regolazione della trascrizione I: sigma diversi oloenzimi diversi preferenza per promotori diversi tx geni diversi

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1 Regolazione della trascrizione I: sigma diversi oloenzimi diversi preferenza per promotori diversi tx geni diversi Regolazione della trascrizione II: L' OPERONE del lattosio TESTO: LEWIN s GENES X, CAPITOLI 19 E 26 LEWIN IL GENE VIII CAPITOLI 9, 10 e un po di 11

2 Regolazione della trascrizione I: sigma diversi promotori diversi geni diversi

3 E.coli ha sette sigma diversi

4 UNA POLIMERASI CHE CONTIENE UN SIGMA SPECIFICO RICONOSCE LA PROPRIA SERIE DI PROMOTORI QUINDI LA Tx DI UNA SERIE DI GENI ESCLUDE/SPEGNE IL VECCHIO PROGRAMMA E NE ACCENDE (transientemente) DI NUOVI.

5 codice di riconoscimento sul DNA

6 l azione dei sigma alternativi deve essere regolata controllando la sua concentrazione sequestrando il fattore sigma sintetizzando sigma con affinità crescente per core enzima producendo dei pro-sigma che vengono attivati da taglio proteolitico cascate

7 l esempio della risposta al calore due sigma s 32 e s E (s 24 ) finemente regolati s 32 è sottoposto a controllo a feedback (heat shock proteine citosol) in condizioni normali il livello di s 32 è mantenuto basso da proteasi (che si occupano anche della degradazione di proteine malripiegate) quando la temperatura aumenta e provoca la denaturazione delle proteine le proteasi vengono indirizzate alla eliminazione delle proteine malripiegate s 32 viene preservato il livello di s 32 aumenta,compete con s 70 che viene spiazzato comincia la trascrizione dei geni dell Heat shock prinicalmente chaperoni e proteasi che ripiegano o eliminano le proteine mal-ripiegate quando il livello delle proteine mal-ripiegate si riduce, perché diminuisce la temperatura e per il lavoro eseguito da chaperoni e proteasi, queste ultime sono libere di degradare s 32 il cui livello torna ai valori basali

8 l esempio della risposta al calore due sigma s 32 e s E (s 24 ) finemente regolati s E è controllato da anti-sigma factor (heat shock proteine periplasma) in condizioni normali s E è legato (sequestrato) ad una proteina della membrana interna RseA l accumulo di proteine mal-ripiegate nello spazio periplasmico provoca l attivazione di una proteasi (DegS) che taglia il C-terminale di RseA. questo taglio attiva un altra proteasi (YaeL) posta sul lato citoplasmatico che taglia l N-terminale di RseA liberando s E s E può trascrivere i geni dell Heat shock prinicalmente chaperoni e proteasi che ripiegano o eliminano le proteine mal-ripiegate specificamente nello spazio periplasmico

9 Sigma E risponde a modificazioni più estreme di temperatura di Sigma 32 Segnale Accumulo di proteine denaturate fuori dalla cellula Sigma E è stabile ma dormiente perché sequestrato Nota!! Fai un parallelo con eucarioti! Si pensi alla cascata di trasduzione di TGFb o di Notch. Proteina di membrana con dominio esterno e citoplasmatico lega il fattore sigmae, sequestrandolo. In questo caso SigmaE e' stabile MA DORMIENTE/LATENTE

10 Il taglio proteolitico di Notch richiede due diverse proteasi che lavorano in serie L azione delle proteasi è attivata dal cambio conformazionale di Notch indotto dall interazione con i ligandi di tipo Delta L interazione ligando-recettore coinvolge anche la cellula sorgente, in cui l endocitosi di Delta è parte integrante dell attivazione di Notch (l endocitosi tira su Notch cambiandone la conformazione)

11 tornando ai batteri

12 fagi: infezione litica

13 una cascata di fattori sigma coordina eventi complessi: controllo temporale il fago di B.subtilis (SPO1) per realizzare la transizione tra le diverse fasi di infezione ( precoce, intermedia e tardiva) a cui corrispondono l espressione di diversi gruppi di geni utilizza sigma alternativi s 70 gp28 Geni precoci trascritti dalla polimerasi dell ospite batterico Geni intermedi trascritti utilizzando un sigma prodotto di un gene fagico della fase precoce Geni tardivi trascritti utilizzando un sigma prodotto da due geni fagici della fase intermedia gp33 gp34

14 una cascata di fattori sigma coordina eventi complessi: controllo comunicazione cellula/cellula la mancanza di nutrimenti innesca la sporulazione LA SPORULAZIONE comporta l espressione di geni specifici coordinamento tra eventi così diversi che avvengono nel batterio vegetativo (che si liserà) e nella spora. Non ci puo' essere sfasamento temporale tra i due eventi..! due diversi destini

15 NON SERVE SAPERE A MEMORIA TUTTI I NOMI DEI GENI e MECCANISMI DELLA SPORULAZIONE! COCETTI IMPORTANTI: la sporulazione e' controllata da due cascate di vari sigma in ciascun compartimento (batterio vegetativo e spora) vengono attivati IN SUCCESSIONE DIVERSI SIGMA, ognuno dirige la trascrizione di gruppi di geni specifici spesso tra questi geni ci sono i sigma della fase successiva il "trucco" per realizzare il coordinamento è la sintesi di un PRO-SIGMA (latente, ma "ready-to-go", attivato da taglio proteolitico) il taglio è controllato dalla localizzazione (in membrana del setto) del ProSigma e dagli eventi che avvengono nell'altra cellula..!!!. Cio' realizza la COORDINAZIONE spazio-temporale nelle e tra le due cellule con destini così diversi.

16 In CONDIZIONI AMBIENTALI AVVERSE Tx dei Geni della lisi

17 Regolazione della trascrizione II: l' OPERONE del lattosio

18 i batteri vivono in un mare di nutrienti diversi e per ottimizzare il dispendio energetico hanno evoluto dei sistemi di percezione di segnali (quale metabolita è presente) e hanno collegato questi segnali a precisi programmi di regolazione genica

19 elementi trans attivi - elementi cis attivi un regolatore è elemento trans attivo (diffusibile): RNA pol, fattori di trascrizione, mirna ecc. agisce su qualunque copia del suo bersaglio il sito di legame (bersaglio) sul DNA/RNA è elemento cis attivo (promotore, operatore, enhancer ecc.) ha effetto solo sul DNA adiacente

20 REGOLAZIONE NEGATIVA E POSITIVA REPRESSORI E ATTIVATORI basso livello di tx costitutiva (non regolata) basale un repressore si lega alla regione OPERATORE, parzialmente sovrapposta al promotore un attivatore, si lega ad una sequenza vicina al promotore e recluta la RNA pol al promotore: esempio di legame cooperativo

21 elementi cis attivi attivatore repressore start point

22 elementi trans attivi: repressore

23 elementi trans attivi: attivatore/i

24 elementi trans attivi: attivatore/i in altri casi, non è il legame della polimerasi ad essere limitante, ma la sua attività. Attivatori e repressori legati nelle vicinanze possono interferire a questo livello. complesso chiuso, tx inefficientemente bassa l attivatore influenza la polimerasi causando in essa un cambiamento conformazionale con cui si passa al complesso aperto

25 i geni sono controllati da segnali extracellulari come fa questa informazione ad arrivare ai promotori? soluzione: questi segnali sono comunicati, attraverso dei mediatori molecolari (piccole molecole, metaboliti, cataboliti, altre proteine) ai regolatori trascrizionali In molte proteine regolatrici si distinguono due domini: il sito di legame al DNA ed il sito allosterico, che spesso funziona come INTERRUTTORE che influenza il legame al DNA predisponendolo in due possibili configurazioni: funzionale e NON funzionale = ALLOSTERIA ALLOSTERIA vedi definizione

26 visione d'insieme di possibili circuiti regolatori

27 Allosterismo e cooperatività È importante precisare che il termine "allosterico" è spesso usato impropriamente per descrivere la cinetica cooperativa, esibita da alcuni enzimi multimerici. Il termine allosterico, in accordo con il significato originale, dovrebbe essere riservato per quegli enzimi la cui attività è regolata da ligandi (effettori o modulatori - che a loro volta possono essere proteine o piccole molecole) che interagiscono con un sito diverso da quello attivo o catalitico. Il termine fu infatti introdotto da Monod, Jacob e Changeux per descrivere il comportamento di enzimi inibiti competitivamente da composti strutturalmente (stereos) molto diversi (allos) dal substrato. Poiché la maggior parte di questi enzimi mostra anche una cinetica sigmoide, tipica dei catalizzatori oligomerici con siti multipli interagenti, il termine allosterico è spesso usato come sinonimo di cooperatività, pur in assenza di una reale regolazione allosterica. IN BIOCHIMICA, una macromolecola esibisce LEGAME COOPERATIVO SE LA AFFINITA' PER IL SUO LIGANDO CAMBIA CON LA QUANTITA' DI LiGANDO GIA' LEGATO La cooperatività può essere positiva o negativa (a seconda che l'effetto sia di attivazione o di inibizione) "An allosteric effector is one that acts by binding to the enzyme at a site different from the active site. There is no necessary connection between allosteric effects and co-operative effects, though they often occur together in real systems." da Recommendations on Biochemical & Organic Nomenclature della International Union of Biochemistry (198

28 regolazione fine dell espressione genica, controllo integrato (postivo e negativo) per l'operone lac

29 adattamento enzimatico dei batteri curva di crescita di E. coli in terreno contenente glucosio e lattosio preferenza per il glucosio viene chiamata repressione da glucosio (o da cataboliti)

30 operoni una strategia utilizzata dai batteri è quella di riunire gruppi di geni funzionalmente collegati in modo che essi possano ricevere regolazione coerente dalle stesse sequenze regolatorie un esempio classico: LacZ operon 3 geni in un messagero policistronico gli elementi regolatori corrispondenti in 5' (a monte)

31 locus lac CAP P/O operone lac gruppo di geni che codificano gli enzimi coinvolti nel metabolismo del lattosio lattosio b-galattoside permeasi lac Z = codifica b-galattosidasi lac Y = codifica galattoside permeasi lac A = codifica galattoside transacetilasi b-galattosidasi transacetilasi lac I = codifica il repressore NON fa parte dell operone è un gene regolatore mutazioni

32 Sommario

33 regolazione negativa operone lac la trascrizione del repressore è costitutiva

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38 l'operatore lac è un palindromo, viene contattata da DUE "TESTE" del repressore in due giri consecutivi nel solco maggiore del DNA, ogni testa si lega a mezzo sito solo 26 paia di basi sono contattate "direttamente un piccolo numero di contatti specifici essenziali all'interazione proteina DNA (come per RNA polimerasi)

39 l operatore di Lac è un palindromo lega DUE repressori

40 principio universale: i fattori di trascrizione molto raramente agiscono come singola molecola quasi sempre agiscono in coppia, come tetramero etc. questo si riflette nella struttura del loro consensus sul DNA.

41 Asse di simmetria ciascun monomero stabilisce contatti quasi identici aumentando l'affinità di legame, in generale: raddoppiare i contatti 2x G costante di affinità al quadrato

42 l operone lac possiede tre sequenze operatore la repressione si manifesta quando un TETRAMERO di repressore si lega al DNA prendendo contatto con due siti operatore stabilità del legame aumentata dalle quattro interazioni legame cooperativo

43 COOPERATIVITA NEI FATTORI DI TRASCRIZIONE le interazioni molecolari deboli sono alla base della regolazione dei sistemi biologici; regolazione =reversibilita, come un semaforo; tanto piu fine e la frequenza on-off, tanto piu fine sara la regolazione Le molecole che lavorano assieme si contattano e si staccano continuamente. Nelle molecole la interazione fisica (formazione complesso) e dettata da 1) affinita reciproca (valore termodinamico); 2) dalla loro concentrazione Tipicamente I fattori di trascrizione non agiscono da soli ma come dimero, tetramero, ottamero etc Perche?? ==> COOPERATIVITA, legame cooperativo. Due ligandi si legano fra loro in modo tale che il legame al DNA di uno di questi ligandi aiuti il legame al DNA dell altro. La cooperativita puo' anche essere percepita come aumento di affinita di una molecola al DNA se ce ne un altra gia legata. C e piu ordine=maggiore G. Per es. Questo vale non solo nel caso del legame a sequenze palindrome di due teste del lac repressor ma anche per il contato di diversi operatori nel tetramero. Se il repressore di lac e legato al suo operatore canonico, si potra legare con maggiore efficienza (cioe con migliore forza) ad un operatore piu prossimale (5 ). NB la relazione tra energia di legame ed equilibrio chimico e di tipo esponenziale (2x energia di legame = 10x di affinita ) L idea della cooperativita puo essere intuitivamente spiegata ance come un aumento di concentrazione locale. Una molecola trattiene quell altra in vivinanza, aumentanto le probabilita di incontrare il target.

44 PERCHE LA COOPERATIVITA E IMPORTANTE Permette ad una proteina di legarsi meglio di quanto la sua affinita le permetterebbe. Un fattore di tx, per essere funzionale, non solo deve legare il suo sito target (consensus) sul DNA al alta affinita ma deve anche avere la una affinita piu bassa possibile per il resto del DNA ( un reagente che e enormemente piu concentrato ). In altre parole e il rapporto di affinita specifico/non specifico che conta!. Se si aumenta la affinita (rendendo la proteina piu grande e sofisticata), si potrebbe aumentarla anche per I falsi bersagli==> inutile!! perche il ns fattore di Tx rimarrebbe troppo tempo legato a siti non corretti. LA COOPERATIVITA RISOLVE IL PROBLEMA: e una strategia che si e evoluta per aumentare l affinita senza pagarne I rischi. Legandosi a due siti adiacenti in modo cooperativo, una proteina aumenta drasticamente la propria affinita senza aumentare quella per gli altri siti aspecifici. Sono dei multimeri: e praticamente impossibile che due molecole della stessa proteina si leghino a due siti sbagliati, per caso, nello stesso momento. La cooperativita scatta sono nei loro siti consensus giusti.

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46 con questo meccanismo l operone lac è represso

47 quando è necessaria la trascrizione dell operone la repressione viene eliminata

48 induzione operone lac le molecole di induttore interagiscono con il tetramero ne causano una modifica conformazionale che riduce drammaticamente l'affinità delle teste del repressore per il DNA. il repressore è una proteina allosterica

49 il paradosso dell induzione induttore = allolattosio prodotto da b-galattosidasi come può entrare il lattosio e come si produce allolattosio se l operone è represso? la repressione non è mai totale, trascrizione basale: presenza di poche molecole di permeasi e di b-galattosidasi

50 10 molecole di repressore tetramerico per cellula nella cellula batterica non c è mai repressore lac libero

51 LA SCOPERTA DELL'OPERONE LA FORZA DELLA GENETICA: gli esperimenti di Jacob e Monod i batteri sono aploidi (una sola copia ci ciascun gene) Jacob e Monod hanno realizzato dei batteri parzialmente diploidi (merodiploidi) per l operone del lattosio (lacz, lacy e laca) e le sequenze vicine (laci) (locus lac) e osservato come cambiava il fenotipo quando i merodiploidi contenevano una copia mutata e una wild type mutanti di tipo diverso

52 concetto di mutazioni CIS e TRANS: Mutare il repressore o il sito operatore avrà lo stesso effetto? derepressione e trascrizione costitutiva dei geni lac ma c'e' una differenza: una mutazione nella sequenza dell'operatore non potrà che agire in cis sullo stesso filamento di DNA (mutazione cis-agente) al contrario, LacI codifica una proteina, cioè un prodotto solubile diffusibile e quindi avrà effetti anche su una molecola di DNA separata (mutazione trans-agente)

53 mutazioni costitutive cis agenti mutazioni nell operatore (O c ) causano l espressione costitutiva dei geni strutturali il repressore non si può legare agiscono in cis interferendo solo sui geni che si trovano contigui ad esse, sullo stesso tratto di DNA mutazioni nel promotore (che impediscono il legame della RNA pol) operone mai inducibile mutazioni dominanti

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55 LA MUTAZIONE nell operatore di lac, NON viene complementata da una copia aggiuntiva del locus lac wild-type. L espressione rimane costitutiva nel cromosoma mutante. Le mutazioni nell'operatore sono Cis-dominanti preché l operatore è inseparabile dai geni che controlla

56 mutazioni trans-agenti mutazioni del repressore laci - impediscono la sintesi del repressore o producono un repressore non funzionante i geni strutturali sono sempre espressi laci -d il repressore non è in grado di legare l operatore i geni strutturali sono sempre espressi laci s il repressore non è in grado di legare o rispondere all induttore i geni strutturali sono sempre repressi recessive dominanti negative

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58 LA MUTAZIONE in laci VIENE complementata da una copia aggiuntiva del locus lac wild-type. Il repressore wild type diffonde e lega l operatore del cromosoma mutante e della copia aggiuntiva questa mutazione trans è recessiva

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60 TRANS-DOMINANZA e DOMINANZA NEGATIVA

61 Ovvero diversi domini funzionali

62 controllo POSITIVO dell'operone lac

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64 CAP si chiama anche CRP: camp Receptor Protein

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66 operone LacZ: ATTIVAZIONE

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69 CRP provoca il ripiegamento del DNA CRP

70 Le modalità di azione di attivatori diversi o dello stesso attivatore su promotori diversi possono essere varie Nota come possano agire anche a distanza

71 CONTROLLO INTEGRATO una visione d'insieme

72 NO camp NO camp YES camp

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