PROCEDURE OPERATIVE STANDARD - S.O.P.

Transcript

1 PROCEDURE OPERATIVE STANDARD - S.O.P. Versione 3.0 Trento, 30 gennaio 2012 Responsabile Scientifico Dr. Mattia Barbareschi U.O. di Anatomia e Istologia Patologica Ospedale S. Chiara di Trento

2 INDICE Premessa... 3 Introduzione... 3 SOP Organigramma... 4 SOP Locale Biobanca Accesso al locale biobanca Gestione del locale Biobanca... 6 SOP Trasferimento dei campioni dalla sala operatoria Acquisizione del materiale chirurgico: accettazione, selezione e processamento del pezzo SOP Archiviazione del materiale biologico Tessuti Sangue Siero Registrazione e archiviazione dei materiali raccolti SOP Identificazione dei pazienti Somministrazione e raccolta del consenso informato Registrazione e archiviazione del consenso informato SOP Anonimizzazione dei pazienti nel database biobanca SOP Controlli di qualità Controllo di qualità dei dati Controllo di qualità del materiale Estrazione RNA totale Quantificazione RNA Valutazione del RIN al Bioanalyzer SOP Modalità di cessione di materiale per progetti di ricerca Allegato Allegato Allegato Allegato Allegato Allegato

3 Premessa Il presente documento deriva dalla necessità di delineare le procedure da utilizzare per un corretto e standardizzato comportamento all interno dell azienda sulla raccolta di materiale biologico (sangue, tessuto tumorale umano e corrispondente tessuto normale). La stesura del suddetto documento è stata effettuata sulla base della normativa attualmente disponibile. Le procedure ed i relativi documenti associati rappresentano una scelta che privilegia l atto di donazione a scopo scientifico nel rispetto e nella salvaguardia dei diritti inviolabili della persona garantendo qualità, trasparenza ed eticità della ricerca. Introduzione La ricerca medica compie costantemente grandi passi verso una migliore diagnosi e cura delle malattie, soprattutto grazie alle nuove tecnologie che permettono di analizzare nei dettagli molecolari i processi biologici che le determinano. La possibilità di decodificare il DNA ( il codice della vita) ha permesso di individuare molti di tali dettagli, ma ancora molto deve essere fatto per comprendere appieno e quindi curare le malattie che affliggono l umanità. Per poter eseguire tali ricerche è indispensabile avere a disposizione i materiali biologici dei pazienti affetti da queste malattie; ad esempio, per poter studiare i tumori del polmone è indispensabile analizzare frammenti dei tumori che vengono asportati chirurgicamente. Solo così sarà possibile capire quali sono i meccanismi molecolari e genetici che determinano la loro insorgenza. Una volta identificate le alterazioni molecolari fondamentali che causano i tumori, sarà possibile studiare e predisporre farmaci in grado di interferire con tali alterazioni molecolari per ripristinare le condizioni di normalità e giungere quindi alla cura. In gergo scientifico si parla di terapie mirate (o terapia a bersaglio) per sottolineare come i nuovi farmaci sono studiati per interferire con uno specifico bersaglio molecolare ; tali farmaci oltre ad essere più efficaci rispetto alle terapie convenzionali, sono più selettivi e quindi producono minori effetti collaterali rispetto ai farmaci chemioterapici oggi utilizzati. Attualmente i tumori asportati chirurgicamente nelle strutture dell Azienda Provinciale per i Servizi Sanitari sono analizzati ai fini diagnostici nell Unità Operative di Anatomia Patologica: qui vengono prelevati alcuni frammenti di tumore e di tessuti sani circostanti; questi frammenti sono sottoposti ad analisi al microscopio per classificare i tumori sulla base del loro aspetto (diagnosi istologica) e sulla base delle loro caratteristiche molecolari (diagnosi immunoistochimica, biomolecolare e citofluorimetrica). Il resto dei tessuti asportati chirurgicamente, e non utilizzato ai fini diagnostici, viene smaltito e distrutto come rifiuto speciale. Tali materiali di scarto sono tuttavia una miniera di informazioni per la ricerca medico-scientifica. La Trentino Biobank si propone di raccogliere e conservare questi frammenti di tessuti non utilizzati per la diagnosi, per poterli utilizzare a scopo di ricerca medica ed i corrispondenti sangue e urine. Qui di seguito sono descritte le procedure operative standard utilizzate per la raccolta di sangue, tessuto tumorale umano e corrispondente tessuto normale. 3

4 SOP 1 1. Organigramma La Trentino Biobank è una struttura funzionale dell Unità Operativa di Anatomia Patologica dell Ospedale S. Chiara di Trento. La struttura organizzativa della Trentino Biobank è così composta: 1. Responsabile della Biobanca 2. Responsabile della qualità 3. Responsabile dell archiviazione del materiale A tali figure sono associati un consulente legale e un consulente informatico che interagiscono rispettivamente con il responsabile della biobanca e della qualità per quanto riguarda il consulente legale, e con il responsabile della biobanca e dell archiviazione del materiale per quanto riguarda il consulente informatico. Il personale della biobanca si avvale anche della collaborazione del personale delle chirurgie, delle sale operatorie e del personale dell Anatomia Patologica. Il responsabile della Biobanca ha il compito di coordinare e verificare il corretto andamento della biobanca, provvedere alla gestione del bugdet, supervisionare le attività gestionali. Il responsabile della qualità in associazione con il responsabile della biobanca e con i chirurghi dei reparti deve adempiere ai seguenti compiti: 1. identificare i potenziali donatori di materiale biologico; 2. illustrare ai pazienti le finalità della TBB e raccogliere il consenso informato prima che il materiale biologico sia utilizzato ai fini di ricerca; 3. registrare i consensi informati raccolti nel software biobanca e occuparsi della corretta archiviazione dei consensi in appositi locali ad accesso controllato; 4. pianificare i controlli di qualità del biomateriale archiviato; 5. provvedere al continuo aggiornamento delle procedure operative standard in cooperazione con il responsabile della Biobanca e con il responsabile dell archivio del materiale. Il responsabile dell archivio del materiale biologico deve adempiere ai seguenti compiti : 1. recuperare il materiale operatorio direttamente dalle sale operatorie; 2. consegnare all anatomo-patologo il materiale asportato chirurgicamente; 3. stoccare il materiale in apposite vials e provvedere alla corretta conservazione in appositi congelatori; 4. registrare il materiale ottenuto nel software della biobanca. Il responsabile della Biobanca deve essere un dottore in Medicina Generale con la specializzazione in Anatomia Patologica. Il responsabile della qualità deve essere un laureato in medicina e chirurgia, biologia, biotecnologia, tecnico di laboratorio biomedico con pregressa esperienza in ambito gestionale. 4

5 Il responsabile degli aspetti tecnologici deve essere un laureato in medicina e chirurgia, biologia, biotecnologia, tecnico di laboratorio biomedico con pregresse esperienza in laboratori di ricerca. Responsabile biobanca Comitato scientifico Comitato etico Consulente legale Consulente informatico Responsabile qualità Responsabile materiale biologico Reparti di chirurgia e degenza Personale anatomia patologica Sale operatorie Figura 1. Organigramma di Trentino Biobank Oltre agli organi descritti, a tutela dei pazienti e a garanzia dell efficiente impiego in ambito scientifico dei campioni stoccati, si prevede che: a) un Comitato Scientifico, incaricato ad hoc della biobanca, debba esprimersi sulla validità scientifica dei progetti di ricerca che prevedono l utilizzo del materiale biologico archiviato. b) i progetti di ricerca, che prevedono l utilizzo dei campioni, debbano essere stati approvati da un Comitato Etico. In caso di progetti internazionali, il Comitato Etico di riferimento deve essere Italiano (della Azienda Provinciale per i Servizi Sanitari, ovvero di altra Istituzione italiana partecipante al progetto). 5

6 SOP Locale Biobanca Il locale biobanca è situato presso piano terra corpo C dell Ospedale S.Chiara di Trento e consta di un area di controllo e una di stoccaggio (allegato 1). Lo stoccaggio può essere effettuato in congelatori a -80 C e in tanks di azoto liquido. Data la tossicità dell azoto liquido, il locale è dotato di sistemi di allarmi che vengono azionati in caso di saturazione dell ambiente. La valutazione dei rischi e le conseguenti misure preventive sono descritte nel documento di valutazione dei rischi redatto dall ufficio di prevenzione e protezione dell Ospedale S.Chiara di Trento (allegato 2) Accesso al locale biobanca Il locale è dotato di un sistema di controllo degli accessi (solo il personale autorizzato dal Responsabile della biobanca ha la possibilità di accedere al locale tramite tessera magnetica) e di un sistema di allarme antintrusione sui serramenti esterni (porte e finestre). La Procedura di accesso, in caso di corretto funzionamento di tutti gli impianti, è la seguente: 1. avvicinare la tessera magnetica al dispositivo di apertura porta. Tale dispositivo permette la registrazione in un software degli accessi effettuati e i rispettivi orari di entrata; 2. digitare sul display dell allarme antintrusione il codice segreto e premere l icona con lucchetto aperto ( disattivazione allarme) entro 30 secondi dall ingresso ( il tempo di ritardo è modificabile); 3. il locale di controllo e quello di stoccaggio sono separati da una porta allarmata che, se rimane aperta per più di 10 secondi, attiva il segnalatore acustico pertanto, nell accesso al locale di stoccaggio, è necessario che venga chiusa; 4. per l uscita del locale è necessario digitare sul display dell allarme antintrusione il codice segreto e premere l icona con lucchetto chiuso ( attivazione allarme). 5. aprire la porta con il pulsante apri-porta entro ed uscire entro 30 secondi dall attivazione dell allarme ( è possibile impostare un altro lasso di tempo). 2.2 Gestione del locale Biobanca Gli impianti antintrusione, elettrici e rilevazione ossigeno nel locale sono gestiti come segue: Sistema antintrusione (in corso la formalizzazione del contratto di manutenzione a Ditta esterna) I serramenti esterni (porte e finestre) sono dotati di contatto antintrusione. La loro apertura dà una segnalazione cumulativa sul pannello operatore a bordo quadro elettrico situato nel locale controllo e su sistema di supervisione in officina elettrica. Procedura da seguire in caso di allarme antintrusione Il sistema d allarme è inserito tutti i giorni feriali dalle 18,00 alle 8,00 e tutti i giorni festivi. 6

7 In caso di allarme si attiva il combinatore telefonico (n. tel. 0461/903099) e comunica alla portineria il seguente messaggio preregistrato: ALLARME ANTINTRUSIONE BIOBANCA. Il portiere di turno, ricevuto l allarme, avvisa l elettricista di turno e si reca sul posto per visionare semplicemente dall esterno dei locali se vi è stato o no uno scasso. In caso di scasso chiama le forze dell ordine (112 Carabinieri o 113 Polizia) e avvisa il Reperibile di turno delle UU. OO. L elettricista di turno, rientrata l emergenza, provvederà a tacitare l allarme ed a ripristinarlo. Per disattivare l antifurto si dovrà digitare sulla tastiera il seguente codice: 3333 seguito dal tasto lucchetto aperto (per gli operatori di Anatomia Patologica); 4444 seguito dal tasto lucchetto aperto (per gli operatori del Centro Trasfusionale) Per inserire l antifurto si dovrà digitare sulla tastiera il codice innanzi seguito dal tasto lucchetto chiuso Anomalie impianti Anomalie impianti (competenza gestione sistema: Servizio Immobili e servizi tecnici SIST) Le anomalie relative all impiantistica elettrica (intervento interruttore cumulativo FM e CA) sono registrate dal pannello operatore su quadro locale controllo ed inviate al sistema di supervisione dell officina elettrica (intervento interruttori FM e CA). Nel caso di intervento da parte degli elettricisti le UU. OO. vengono avvisate. Allarmi Freezer e Tank (competenza gestione: Servizio Ingegneria Clinica di seguito SIC.) Questi allarmi sono gestiti dal sistema SIRIUS che monitora in remoto le temperature dei frigo e dei tank. Si segnala che in caso di mancanza di alimentazione elettrica e/o di guasto la temperatura dei freezer aumenta di circa 10 C ogni ora. Vengono individuate due soglie di allarme: per i freezer >= -60 C e <= -90 C per i contenitori criobiologici da definire con SIAD Il percorso di segnalazione dell allarme sarà il seguente: SIRIUS CENTRALINO OSPEDALE REPERIBILE SIC per Biobanca ed Emodialisi. Il reperibile SIC valuterà, sentendo se ritenuto necessario anche l elettricista di turno (per controllo visivo), se è necessario contattare il Reperibile di turno delle UU. OO Allarme Ossigeno (in corso la formalizzazione del contratto di manutenzione a Ditta esterna) La concentrazione in volume di Ossigeno è rilevata nel locale Conservazione da quattro sensori collegati a due centraline distinte di rivelazione della percentuale di ossigeno, collocate nel locale Controllo in apposito quadro, aventi ciascuna un display sul quale è possibile leggere in tempo reale la percentuale di ossigeno presente all interno del locale conservazione. Le due centraline sono impostate per segnalare: 7

8 - segnale visivo ed acustico (suono intermittente), la diminuzione della concentrazione di ossigeno al di sotto del 19,5% (PRE-ALLARME) nel locale conservazione; - segnale visivo ed acustico (suono continuo), la diminuzione della concentrazione di ossigeno al di sotto del 18,5% (ALLARME). L impianto di allarme rileva la percentuale ossigeno e i relativi ventilatori sono dati in manutenzione a ditta esterna che provvederà alla stessa secondo i manuali d uso e manutenzione delle Ditte Costruttrici. Gestione degli allarmi La diminuzione di ossigeno al di sotto della prima soglia di allarme (stabilita al 19,5% in volume) determina: - segnale di allarme ossigeno sul pannello operatore a bordo quadro e sul display della centralina che interviene per prima; - allarme ottico e acustico interno ai due locali e sopra la porta di ingresso lato corridoio Crosina; - attivazione automatica dei due ventilatori di emergenza che estraggono aria dal locale conservazione in posizione bassa (zona saturata da Azoto) con una portata di 3600 mc/h. Sia i ventilatori di emergenza, che gli allarmi ottici-acustici sono attivabili anche manualmente attraverso i pulsanti allarme Ossigeno presenti nei due locali in posizione segnalata. Procedura di accesso al locale Conservazione Quando la % di ossigeno rilevata risulta superiore al 19,5% in volume, sul quadro si accende una spia verde ed è consentito l accesso al locale dando il consenso elettrico di apertura della porta tramite un interruttore. Quando la % di ossigeno rilevata risulta inferiore al 18,5% in volume, sul quadro si accende una spia rossa e viene disabilitato l ingresso al locale. In tal caso, l accesso al locale non è consentito fintanto che i livelli di ossigeno non saranno tornati nei range (ossigeno > 19,5%) sopradescritti. Procedura da seguire in caso di allarme per la carenza di ossigeno Nel caso venga attivato il pre-allarme (Percentuale di ossigeno rilevata è inferiore a 19,5% ma superiore a 18,5%), l operatore che si trova nel locale Conservazione dovrà verificarne le cause: se riconducibili all attività di interazione con il tank di azoto (apertura coperchio) oppure se, al contrario, non siano correlate e/o non siano visibilmente verificabili (possibile guasto). Nel primo caso, l operatore può continuare il processo di inserimento dei prodotti nel tank di azoto mentre nel secondo caso deve abbandonare i locali. Nel caso venga attivato l allarme (Percentuale 0 2 rilevata < 18,5% in volume), l operatore che si trova nel locale Conservazione deve abbandonare immediatamente il locale conservazione, utilizzando l uscita di sicurezza che porta direttamente all esterno del locale. In caso di malore dell operatore nel locale Conservazione, il secondo operatore chiama con il telefono presente nel locale Controllo il Medico Reperibile dell U.O. di Anestesia e Rianimazione (tel ) ed apre la porta che dà sul corridoio Crosina. 8

9 Verifica, leggendo sul display, la percentuale di ossigeno presente nel locale Conservazione. Se la percentuale 0 2 rilevata è superiore al 19,5% in volume l operatore entra nel locale ed attiva le misure di primo soccorso (verifica lo stato di coscienza, respiro, polso). Altrimenti, se inferiore al 19,5% in volume il secondo operatore accede al locale conservazione ed apre immediatamente la porta dell uscita di emergenza che dà direttamente all esterno dell edificio. Tuttavia qualora la percentuale 0 2 rilevata sia inferiore al 18,5%, la porta dovrà essere aperta con la chiave presente nel box rosso in alto, a destra della porta Tacitazione allarme ottico-acustico per mancanza ossigeno L allarme ottico-acustico per fuoriuscita Azoto di cui ai punti 1.3, attivabile in modo automatico (sistemi di rilevazione) o in modo manuale (pulsanti allarme Ossigeno). E tacitato mediante un pulsante collocato nel quadro elettrico del locale controllo Disattivazione ventilatori di estrazione in emergenza I due ventilatori di estrazione in emergenza per fuoriuscita Azoto di cui al punto 1.3 si attivano, come già descritto, in modo manuale (pulsante allarme Ossigeno) o in modo automatico attraverso la rilevazione ossigeno. Nel primo caso (pulsante manuale) i ventilatori si arrestano resettando il pulsante di emergenza attivato (ripristinandone la posizione normale). Nel secondo caso (attivazione automatica) i ventilatori si fermano solo quando il sistema di rilevazione misura una percentuale di ossigeno al di sopra della soglia di allarme (19,5% in volume). 9

10 SOP Trasferimento dei campioni dalla sala operatoria Questa procedura operativa standard definisce il protocollo da seguire per il trasferimento dei campioni dalla sala operatoria all U.O. di Anatomia Patologica. Tutti i pezzi asportati chirurgicamente di routine vengono inviati all U.O. di Anatomia Patologica affinché venga effettuata una diagnosi, tuttavia qualora esista la possibilità che il tessuto residuo possa essere riservato alla biobanca è molto importante che il tessuto venga trasferito rapidamente e a fresco, non fissato. La standardizzazione dei metodi di acquisizione e di trasferimento del tessuto è essenziale per assicurare la qualità dei campioni. Il campione prelevato può essere inviato all U.O. di Anatomia Patologica con 2 modalità: - direttamente dal personale della sala operatoria - dal personale della TBB che viene contattato al momento dell exeresi; 3.2 Acquisizione del materiale chirurgico: accettazione, selezione e processamento del pezzo. Nel momento in cui il tessuto arriva nell U.O. di Anatomia Patologica viene accettato ( ovvero inserito in Armonia, programma di gestione dell Anatomia Patologica) e gli viene assegnato un numero progressivo secondo le normali procedure utilizzate presso l U.O. di Anatomia Patologica. I biomateriali saranno raccolti dopo che il patologo avrà espletato le manovre diagnostiche necessarie; il patologo responsabile del campionamento fornirà i frammenti tessutali ritenuti non utili ai fini diagnostici (left-over tissues) al personale della biobanca per la loro conservazione Congelamento del campione di tessuto Questa procedura operativa standard definisce il protocollo da seguire per il congelamento del materiale chirurgico residuo da destinare alla TBB. I tessuti congelati possono essere utilizzati dai ricercatori in un ampia varietà di tecniche sperimentali, quindi per assicurare e ottenere risultati attendibili e riproducibili deve necessariamente esserci uniformità nella metodica di congelamento del tessuto ed in particolare una rigorosa aderenza/rispetto dei limiti di tempo per il congelamento rapido. I tessuti devono essere congelati il prima possibile, l ideale sarebbe entro 30 minuti dall escissione; è per questo motivo che è importante registrare l ora in cui è avvenuta la rimozione del campione dal paziente e il tempo trascorso fino al congelamento. I campioni, debitamente identificati mediante un codice a barre, verranno congelati utilizzando due sostanziali metodiche, una che prevede l utilizzo di cryovials e una che prevede l utilizzo di cryomolds e di liquido conservante OCT, mediante immersione in un mezzo altamente criogenico che ne permette il congelamento rapido Congelamento in cryovials I campioni di tessuto vengono raccolti in cryovials con tappo a contrassegnate con un codice a barre sul fondo. Le cryovials vengono quindi chiuse e poste nel contenitore contenente isopentano. Il congelamento sarà effettuato dal personale di TBB responsabile dei materiali biologici. Successivamente i campioni saranno stoccati nei sistemi di criopreservazione (freezer a 80 C) nelle scatole dedicate e contrassegnate con il numero del freezer e un numero progressivo. 10

11 3.2.3 Congelamento di cryomolds I tessuti da raccogliere vengono posti in cryomolds contrassegnate con codice a barre (su etichetta) in presenza di una sostanza criosolidificabile, quale l OCT (Optimal Cutting Temperature compound), e poi vengono congelati per immersione in isopentano. Successivamente i campioni saranno stoccati nei sistemi di criopreservazione (freezer a 80 C) nelle scatole dedicate e contrassegnate con il numero del freezer e un numero progressivo. 11

12 SOP 4 4.Archiviazione del materiale biologico 4.1 Tessuti Tutti i tessuti devono essere manipolati come se fossero potenzialmente infetti. Il materiale biologico prelevato dalle sale operatorie è tempestivamente portato in Anatomia Patologica dove viene accettato dal personale addetto all accettazione come materiale a fresco. In seguito all accettazione il materiale viene portato dal responsabile degli aspetti tecnologici in distinta e da qui segue il seguente percorso: 1. valutazione del materiale asportato da parte dell anatomo-patologo di turno. Se l anatomo-patologo ritiene che il materiale è sufficiente per la diagnosi e quindi che una parte di esso può essere archiviato in biobanca, ne preleva dei frammenti di tessuto patologico e di tessuto sano; 2. inserimento del biomateriale nelle apposite criovials dotate di codice a barre (max 2 frammenti di circa 0.3 cm per ciascuna criovial); 3. se il materiale è sufficiente, inserimento del biomateriale nelle apposite cryomold dotate di codice a barre applicato manualmente; 4.2 Sangue Mantenere il campione a 4 C: temperature che favorisce la stabilità (buon compromesso tra il mantenimento della vitalità, che è migliore a T ambiente, e la degradazione enzimatica). Invertire la provetta contenente anticoagulante subito dopo il prelievo per mescolare il sangue all anticoagulante. Il sangue nella provetta che separa il siero deve essere lasciato a coagulare a T ambiente minuti prima di essere centrifugato a 2500g per 10 a 4 C. Eseguire il prelievo ematico su soggetto a digiuno dalla mezzanotte e in assenza di terapie infuse Prima del prelievo preparare 1 provetta con tappo rosso (senza alcun additivo), 2 provette da emocromo con EDTA ( tappo lavanda) e 2 provette da coagulazione con citrato di sodio (tappo azzurro ) opportunamente etichettate con un codice identificativo Riempire le provette fino alla tacca seguendo l ordine: provetta senza additivi ( tappo rosso) provetta per la coagulazione ( tappo azzurro) provetta per emocromo ( tappo viola) Immediatamente dopo il prelievo, capovolgere 7-8 volte le provette per emocromo e per coagulazione al fine di miscelare l anticoagulante con il sangue Siero Lasciare coagulare il sangue nella provetta da siero per 1-2 ore a T ambiente Centrifugare il sangue coagulato per 10 a 2000 rpm Trasferire aliquote da 500 µl di siero in provette criogeniche con tappo a vite. Il siero non deve essere emolizzato; 12

13 Le aliquote di siero sono trasferite immediatamente a 80 C ; 4.3 Registrazione e archiviazione dei materiali raccolti 1. Apertura del database ( con login e password (solo il personale della biobanca ha accesso al database con una propria login e password) 2. inserimento del paziente con nome e cognome, se è stato possibile ritirare il consenso informato prima dell intervento chirurgico, il paziente risulta già inserito nel database e pertanto lo si richiama da ricerca inserendo cognome e nome; 3. se in APSS è presente più di una persona con lo stesso nome, è necessario selezionare il paziente corrispondente verificandone la data di nascita; 4. se il paziente non è in APSS è necessario inserire nell apposita schermata i dati anagrafici e registrarlo; 5. dopo aver inserito il paziente, cliccare su nuovo pezzo operatorio e compilare tutti i campi vuoti specificando la tipologia di tessuto, il tipo di intervento, data e ora del prelievo, ora del congelamento. Il database prevede due campi contatori per monitorare il tempo che intercorre tra escissione e arrivo in Anatomia e il tempo tra arrivo e congelamento. Ciò consente di poter individuare eventuali ritardi e intervenire per migliorare. 13

14 6. per ciascun campione compilare i campi vuoti specificando la modalità di conservazione, il numero della scatola in cui vengono posti i campioni e il numero di codice a barre letto con la penna ottica. 14

15 7. immergere i campioni (criovials e cryomold) nel contenitore con isopentano preraffreddato a -80 C e conservato nel congelatore a -80 C; 8. dopo circa 2h dalla conservazione in isopentano o comunque in giornata, trasferire le vials e le cryomold nelle apposite scatole e conservarle a -80 C. I congelatori a -80 C devono essere opportunamente chiusi a chiave e solo il personale della biobanca può accedere al biomateriale. Le chiavi sono custodite in un locale ad accesso controllato. Per garantire che i campioni presenti in freezer -80 C vengano preservati a temperatura costante e non avvengano variazioni termiche tali da compromettere l integrità, ogni freezer è dotato di un data logger e controllo remoto della temperatura gestiti dal sistema certificato SIRIUS. In caso di malfunzionamento dei congelatori il personale viene tempestivamente avvisato telefonicamente dall azienda e deve recarsi nei locali per provvedere al trasferimento del biomateriale archiviato. 15

16 SOP Identificazione dei pazienti Per alcuni tipi di patologia (polmonare, mammaria), grazie alla collaborazione del personale infermieristico delle chirurgie, è possibile contattare il paziente nel momento in cui esso si reca in reparto per il prelievo pre-operatorio. Il responsabile della raccolta del consenso informato, a seguito della segnalazione dell infermiera, se reca nel reparto di chirurgia, illustra al paziente il progetto TBB e propone la partecipazione. In questa sede è possibile somministrare il consenso ed eventualmente raccogliere anche il campione di sangue, qualora il paziente abbia acconsentito/dichiarato l adesione. È compito dell infermiera segnalare sulla scheda del paziente/lista operatoria la volontà dello stesso di partecipare al progetto TBB: in questo modo il personale della sala operatoria è preventivamente messo al corrente e, al momento dell exeresi, può chiamare prontamente il responsabile del materiale biologico. Nel caso in cui non sia possibile contattare il paziente prima dell intervento, è grazie alla compliance dei chirurghi e di tutto il personale delle sale operatorie che il paziente viene identificato al personale di TBB tramite l invio del pezzo a fresco. 5.2 Somministrazione e raccolta del consenso informato I pazienti che non sono stati contattati prima dell intervento, possono essere contattati anche successivamente, in tal caso è necessario avere notizie dello stato di salute del paziente dagli infermieri di reparto. Nel caso in cui il paziente risulta dimesso, il responsabile della qualità ha il compito di contattare il paziente quando quest ultimo si reca per le visite di controllo, in tale caso è necessario contattare la segreteria di reparto. Qualora non sia possibile in alcun modo contattare il paziente ma ne è stato archiviato il materiale biologico, il paziente deve essere reso anonimo secondo la procedura SOP 4. È necessario che il paziente sia adeguatamente informato sull utilizzo per scopi di ricerca del materiale che gli viene asportato chirurgicamente. Ogni materiale biologico deve essere accompagnato dal relativo consenso informato (allegato 1) anche se il paziente ha già sottoscritto lo stesso consenso per precedenti interventi. Al paziente viene illustrato il progetto Trentino Biobank con le sue finalità fornendo un depliant descrittivo (allegato 2) del progetto e viene illustrato il consenso informato in tutti i suoi punti. Qualora il paziente decide di accettare la donazione del materiale biologico che gli viene asportato chirurgicamente, il consenso viene fatto sottoscrivere in duplice copia di cui una rilasciata a lui stesso. Il materiale può essere utilizzato per scopi ricerca solo se accompagnato dal relativo consenso informato; pertanto quest ultimo può essere ritirato anche successivamente all intervento chirurgico e alla archiviazione del materiale asportato. Il consenso informato raccolto viene opportunamente archiviato in un locale accessibile solo al personale addetto alla biobanca. 16

17 5.3. Registrazione e archiviazione del consenso informato Il consenso informato raccolto deve essere registrato nel database secondo la seguente procedura: 1. apertura del database mediante inserimento di username e password: solo il personale della biobanca ha l autorizzazione all accesso; 2. inserire cognome e nome del paziente; 17

18 3. importare in biobanca il paziente corrispondente, se il paziente non appartiene all APSS, è necessario registrarlo compilando la schermata relativa alla scheda anagrafica; 4. dopo aver importato il paziente, cliccare su nuovo pezzo operatorio e compilare i campi relativi al consenso informato. L avvenuta registrazione del consenso è visualizzata da un icona sulla schermata relativa al paziente 5. archiviare una copia del consenso nel locale accessibile solo al personale addetto alla biobanca. 18

19 SOP 6 6. Anonimizzazione dei pazienti nel database biobanca La procedura di anonimizzazione del paziente di cui è stato archiviato il biomateriale permette di eliminare tutti i dati anagrafici dei pazienti eccetto la loro data di nascita e il numero istologico di riferimento del biomateriale di cui si è prelevata un aliquota. Entrambi i dati non permettono di risalire all identità del paziente fatto salvo per coloro che sono autorizzati all accesso di gestione dei dati clinici dei pazienti dell APSS (sistema Armonia). In ogni caso il personale di TBB ha l obbligo di non fornire alcun riferimento dei pazienti che sono stati anonimizzati nel database di TBB. La procedura di anonimizzazione del paziente è tale che sia il personale di TBB che il sistema di gestione centralizzato del database non possono in alcun modo ripristinare l anagrafica dei pazienti, pertanto prima di effettuarla è necessario assicurarsi del paziente da anonimizzare. I casi in cui è necessario ricorrere all anonimizzazione del biomateriale sono: a. impossibilità di contattare il paziente per il ritiro del consenso informato (decesso, trasferimento in altra città, interventi effettuati in altri ospedali e di cui risulta di oggettiva difficoltà rintracciare il paziente) b. ritiro da parte del paziente del consenso precedentemente rilasciato; 19

20 1. selezione del tasto modifica ; 20

21 2. selezione del tasto anonimizza. 21

22 SOP 7 7. Controlli di qualità Ogni anno verranno effettuati controlli di qualità su: - tessuti congelati - tessuti fissati - documentazione associata ai casi (database) Periodicamente questi controlli verranno estesi anche a: - strumentazione - protocolli (revisione) 7.1 Controllo di qualità dei dati La qualità del materiale archiviato dipende anche dalla completezza e dalla correttezza del pacchetto di dati che lo accompagnano. La qualità dei dati viene valutata scegliendo casualmente TOT pazienti inseriti nel data base di TBB ogni ca. 6 mesi e verificando la completezza e la pertinenza di tutti i campi (organo, intervento,diagnosi) perché non sempre il data base comunica correttamente con Armonia e OncoSis. È possibile isolare dal data base i casi con campi vuoti (attraverso il personale di MTTPRO) e procedere al completamento ( es. istologici senza diagnosi, istologici senza intervento). Per monitorare costantemente la correttezza e la pertinenza dei dati è stato creato grazie al personale di MTTpro un report mensile dei pazienti inseriti in TBB con la relativa diagnosi, tipo di intervento e organo. Questo elenco è presente, all interno nel data base, nella sezione servizi e precisamente: In Trentino biobanca ( Servizi Statistiche - Ricerche base: /tipo intervento/organo per anno e mese) eseguire mensilmente la ricerca secondo i criteri desiderati (ultimo mese) 22

23 All apertura della schermata verificare la completezza dei dati importati da armonia (data del prelievo, diagnosi, tipo di intervento e organo interessato al prelievo) Se vi sono dati mancanti chiedere al gestore del Database (Mttpro s.r.l.) il nominativo paziente e completare il campo estraendo i dati manualmente da Armonia 7.2 Controllo di qualità del materiale Tutto il materiale archiviato necessita di opportune valutazioni periodiche di qualità. I controlli di qualità devono essere effettuati su materiale archiviato opportunamente. Attualmente il parametro indicativo più attendibile per la valutazione dello stato di archiviazione del biomateriale criopreservato è RNA. I campioni di TBB archiviati a -80 C vengono selezionati random annualmente nella quantità di 1% evitando tuttavia di utilizzare, per questi controlli, i pezzi corrispondenti a campioni e/o tipi tumorali rari e in ogni caso mai portando ad esaurimento il campione. L RNA è estratto dal pezzo fresco congelato per mezzo di un kit dedicato. La qualità di RNA estratto viene valutata secondo il RIN. Sulla base dei risultati ottenuti, il personale di TBB provvede ad adottare delle modifiche nelle procedure qualora questi siano non adeguati all utilizzo del biomateriale per studi di ricerca. I dosaggi effettuati sul materiale da controllo vengono opportunamente archiviati nel locale biobanca per eventuali ripetizione. 23

24 7.2.1 Estrazione RNA totale L RNA può essere estratto mediante tecniche convenzionali che utilizzano Trizol o mediante appositi kits con purificazione su colonnina. Per la disgregazione ci si avvalale di pestelli in plastica autoclavati o di Estrazione RNA totale con TRIzol - Tagliare al criostato 2-4 sezioni di tessuto e porle in una provetta da 2 ml sterile; - Aggiungere 1-1,5ml di TRIzol a seconda delle dimensioni delle sezioni di tessuto; - Vortexare vigorosamente e pipettare fino a quando il tessuto non risulta essere omogenato; - Lasciare 5 minuti a temperatura ambiente per consentire la completa dissociazione dei complessi nucleoproteici; - Centrifugare per 10 minuti a rpm a 4 C; - Prelevare il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta da 2ml; - Aggiungere 0,2 ml di cloroformio per 1 ml di TRIzol; - Vortexare/agitare vigorosamente la provetta per 15 secondi; - Incubare 5 minuti a temperatura ambiente; - Centrifugare per 15 minuti a rpm a 4 C; - Prelevare la fase acquosa superiore (circa 700 µl) e trasferirla in una nuova provetta da 2ml N.B. fare attenzione a non prelevare l interfase; - Precipitare l RNA aggiungendo un ugual volume (circa 700 µl) di isopropanolo; - Incubare 15 minuti a temperatura ambiente; - Centrifugare per 15 minuti a rpm a 4 C; - Rimuovere il surnatante; - Lavare il pellet una volta con 800 µl di etanolo 75%; - Miscelare con il vortex; - Centrifugare per 10 minuti a rpm a 4 C; - Rimuovere il surnatante; - Lasciare evaporare l etanolo rimasto, stando attenti a non far seccare il pellet di RNA; - Risospendere il pellet in µl H 2 O RNasi-free; Estrazione RNA totale con kit Rneasy Si utilizza il RiboPure RNA Isolation della ditta Applied Biosystem (cod. AM 1924) seguendo il protocollo stilato dal fornitore. Procurarsi: - etanolo 100%; - cloroformio; Preparare la soluzione di lavaggio: aggiungere 48mL di etanolo 100% alla wash solution concentrata ( scrivere la data ed utilizzare entro un mese); Estrazione: 24

25 1) pestellare/ disgregare il pezzo nel TRI reagent aggiungendo aliquote successive del reagente fino ad 1 ml; 2) trasferire l omogenato in una nuova provetta; 3) aggiungere 200 µl di cloroformio; 4) tappare e vorterxare al massimo per 15 secondi; 5) lasciare incubare per 5 minuti; 6) centrifugare a g a 4 per 10 minuti ( si separano le tre fasi: acquosa dove c è l RNA, l interfase e la fase organica dove si separano DNA e proteine); 7) prelevare tutta la fase acquosa facendo molta attenzione a non prelevare anche materiale dall interfase e trasferirla in una nuova provetta; Purificazione: aggiungere 200 µl di etanolo freddo; 8) Vortexare al massimo per 5 secondi; 10)Breve centrifugata; 11) prendere una provetta con il filtro e trasferirvi il campione; 12) centrifugare a g per 30 secondi ( aggiungere altro tempo se c è ancora del liquido sul filtro); 13) vuotare il contenuto della provetta e riposizionare il filtro (RNA è trattenuto nel filtro); 14) aggiungere 500 µl di soluzione di lavaggio; 15) centrifugare fino a che tutto il liquido ha attraversato il filtro; 16) vuotare il contenuto della provetta, riposizionare il filtro, ripetere il lavaggio (punto ). 17) centrifugare a secco; Eluizione: 18) trasferire il filtro in una nuova provetta; 19) aggiungere 100 µl di acqua; 20) incubare 2 minuti; 21) centrifugare a g per 30 secondi; 22) buttare il filtro, conservare a -20; Quantificazione RNA La quantificazione dell RNA viene fatta al Nanodrop (2000 ThermoFisher). Questo strumento offre anche indicazioni circa la purezza dell RNA estratto attraverso il rapporto tra assorbanze (A260/A280 ) e deve presentare un rapporto compreso tra Valutazione del RIN al Bioanalyzer Per valutare l integrità dell RNA totale con l Agilent 2100 Bioanalyzer si utilizza l RNA 6000 Nano LabChip che permette di analizzare l RNA in un range di ng/µl. L esito dell analisi viene fornito sottoforma di RIN (RNA Integrity Number), generato dal Agilent 2100 expert Bioanalyzer software. In questo modo l integrità del campione non viene più determinata calcolando il rapporto tra le bande degli RNA ribosomali (28S e 18S), ma analizzando l intera traccia elettroforetica del campione, includendo così nel calcolo anche la presenza/assenza di prodotti di degradazione. Il valore di RIN varia in un range da 25

26 10 (RNA integro) a 0 (RNA completamente degradato); si considera di buona qualità un valore di RIN >6. Preparazione del Ladder Il ladder (35 microliti) contenuto nel kit va denaturato per due minuti a 70 C,successivamente passato in ghiaccio, quindi aliquotato in RNase-free vial ( 2 microliti per ciascuna vials). Stoccare le aliquote a -70. I reattivi sono conservati in frigo e si utilizzano dopo 30 minuti a temperatura ambiente protetti dalla luce. Preparazione del bioanalyzer: l apparecchio è collegato e si accende con il tasto sul retro ( luce verde) Il programma dedicato è 2100 expert. Si deve eseguire la pulizia degli elettrodi: 1- chip con 350 microliti di RNaseZAP per 1 minuto e un chip con la stessa quantità di acqua DNAasi free per 30 secondi. Dopo ogni inserimento i chip si vuotano su carta assorbente e vengono utilizzati alla fine di ogni esperimento. Preparazione del gel Prelevare dalla provetta di gel (tappo rosso) 550 microliti e pipettare sul filtro contenuto nella vial. Centrifugare per 10 minuti a 1500g (4000 rpm nella centrifuga della biobanca) quindi aliquotare 65 microliti di gel filtrato nelle vials contenute nel kit e stoccare a 4 C. ( utilizzare entro un mese dalla data di preparazione). Vortexare e centrifugare per 10 secondi la vial tappo blù ( colorante) aggiungere 1 microlito di tale soluzione ad una vial contenente i 65 microliti di gel filtrato, tappare vortexare e centrifugare 10 minuti a 13000g ( rpm).utilizzare in giornata. Preparazione del chip La corretta posizione della stazione di priming è nel livello C e lo stantuffo deve essere posizionato a 1 ml. Posizionare il chip nuovo nella posizione di priming. Pipettare 9 microliti di gel nell apposito pozzetto contrassegnato dalla lettera G e chiudere la base con il relativo coperchio, spingere lo stantuffo verso il basso in modo che venga bloccato dall apposito gancio. Lasciare in questa posizione per 30 secondi. Quindi sganciare la siringa e aspettare un minuto. Riaprire la stazione e aggiungere altri 9 microliti di gel nei pozzetti indicati con G. Successivamente aggiungere 5 microliti della soluzione marker nell apposito pozzetto (indicato con la scaletta) e successivamente in ciascuno degli altri 12 pozzetti. Prelevare i campioni dal freezer tenendoli nel ghiaccio, denaturare nel blocco riscaldante a 70 C per 2 minuti. Nel frattempo mettere 1 microlito di ladder nel pozzetto indicato con la scaletta. Aggiungere 1 microlito di campione in ciascun pozzetto (tutte le posizioni devono essere occupate, si possono ripetere gli stessi campioni). Posizionare il chip nell apposito vortex a massima velocità per 1 minuto. Inserire immediatamente il chip nel bioanalyzer e premere start. La lettura avviene in 20 minuti. Ciò che viene prodotto è un documento 26

27 Fig. 2 Risultato di un controllo di qualità al Bioanalyzer. 27

28 SOP Modalità di cessione di materiale per progetti di ricerca La cessione del materiale archiviato in biobanca potrà avvenire a seguito dell approvazione del progetto di ricerca in questione da parte del comitato scientifico e della stipula del contratto tra biobanca e ricercatori. I documenti che compongono questo contratto ( che prende il mone di MATERIAL TRASFER AGREEMENT) sono tre: Contratto: diritti e doveri dei ricercatori ( allegato 4); Regolamento interno della Trentino Biobank ( allegato 5); Modulo di richiesta del materiale (allegato 6); 28

29 Allegato 1 29

30 Allegato 2 30

31 Allegato 3 Locale BIOBANCA 31

32 Allegato 4 32

33 Allegato 5 33

34 Allegato 6 34