Prodotti Elucigene Male Factor Infertility Istruzioni per l'uso

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1 Prodotti Elucigene Male Factor Infertility Istruzioni per l'uso Prodotto Quantità Codice catalogo Elucigene Male Factor Infertility 25 test AZFXYB1 Elucigene MFI-Yplus 10 test AZFPLBX Per uso diagnostico in vitro Prodotto da: Elucigene Diagnostics Citylabs Nelson Street Manchester M13 9NQ Vendita, assistenza clienti e assistenza tecnica: Tel.: +44 (0) Fax: +44 (0) enquiries@elucigene.com techsupport@elucigene.com Elucigene Diagnostics è il nome commerciale di Delta Diagnostics (UK) Limited., una società iscritta in Inghilterra e in Galles al numero di registrazione ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 1 di 42

2 Elucigene Male Factor Infertility La gamma di prodotti Elucigene Male Factor Infertility comprende test multiplex del DNA per la rapida determinazione dello stato di aneuploidia per i cromosomi sessuali e l'identificazione e la caratterizzazione delle tre classi più comuni della microdelezione del cromosoma Y associate all'infertilità maschile. I kit di Elucigene Male Factor Infertility sono disponibili nei formati elencati di seguito. Per maggiori informazioni sui kit della gamma Male Factor Infertility, visitare il sito: Uso previsto Male Factor Infertility Per la diagnosi routinaria quantitativa in-vitro delle aneuploidie cromosomiche sessuali più comuni (ad es. sindrome di Klinefelter) e le microdelezioni del cromosoma Y (AZFa, AZFb e AZFc) comunemente associate al fattore maschile di infertilità. L'analisi comprende marker STR di cromosomi sessuali XHPRT e DXYS218 e marker non STR AMEL, TAF9L e SRY per l'individuazione dello stato di aneuploidia dei cromosomi sessuali. Il kit contiene anche i marker specifici del cromosoma Y sy84, sy86, sy127, sy134, sy254 e sy255 per la determinazione dello stato delle microdelezioni del cromosoma Y dei loci AZFa, AZFb e AZFc. La metodica impiegata dal kit Elucigene Male Factor Infertility è la tecnica QF-PCR (reazione a catena della polimerasi quantitativa in fluorescenza). I dispositivi sono destinati all'uso su DNA estratto da sangue intero (EDTA) e non sono previsti per l'uso con altre matrici di test. La popolazione target di interesse è costituita da pazienti maschi con sospetta infertilità che potrebbero presentare caratteristiche correlate, quali uno scarso numero di spermatozoi. Il dispositivo è destinato all'uso congiuntamente ad altre procedure diagnostiche al fine di supportare o scartare la diagnosi clinica proposta. Il dispositivo è destinato esclusivamente all uso professionale in ambiente di laboratorio citogenetico o molecolare. Male Factor Infertility-Yplus (MFI-Yplus) Kit supplementare contenente marker aggiuntivi di cromosomi Y, da utilizzare unitamente al Male Factor Infertility per la diagnosi routinaria in vitro delle tre microdelezioni più comuni del cromosoma Y associate all'infertilità maschile. Questo kit è disponibile per l'analisi estesa e la caratterizzazione delle microdelezioni del cromosoma Y identificate con l'uso del kit Male Factor Infertility. La metodica impiegata dal kit Elucigene MFI-Yplus è la tecnica QF-PCR (reazione a catena della polimerasi quantitativa in fluorescenza). I dispositivi sono destinati all'uso su DNA estratto da sangue intero (EDTA) e non sono previsti per l'uso con altre matrici di test. La popolazione target di interesse è costituita da pazienti maschi con sospetta infertilità e che sono risultati positivi ad una microdelezione del cromosoma Y. Il dispositivo è destinato all'uso congiuntamente ad altre procedure diagnostiche al fine di supportare o scartare la diagnosi clinica proposta. Il dispositivo è destinato esclusivamente all uso professionale in ambiente di laboratorio citogenetico o molecolare. ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 2 di 42

3 Riepilogo e spiegazione Statisticamente, il 10-15% delle coppie sperimentano difficoltà di concepimento, con fattori correlati al sesso maschile, ad es. scarso numero di spermatozoi, ritenuti essere alla base di quasi il 50% dei casi. Bensì nella maggior parte le cause dell'infertilità maschile sono sconosciute, alcuni studi hanno dimostrato che l'aneuploidia del cromosoma sessuale e le microdelezioni di specifiche regioni del cromosoma Y possono essere i responsabili del problema (1). La sindrome di Klinefelter è l'aneuploidia del cromosoma sessuale associata all'infertilità maschile più comune. Questa sindrome ha un'incidenza di nati vivi tra 1:500 e 1:650 di maschi e la causa più comune è una copia aggiuntiva del cromosoma X (47, XXY caritipo), questa alterazione è il difetto genetico più frequente osservato nell'infertilità maschile. Le microdelezioni del cromosoma Y sono le seconde cause genetiche più comuni dell'infertilità maschile (2), con microdelezioni che si verificano in tre regioni (AZFa, AZFb, AZFc) identificate in fino al 7% dei casi di oligospermia (scarsa quantità di spermatozoi) e il 13% di azoospermia non ostruttiva (assenza di spermatozoi) (1). Dette microdelezioni si verificano a causa della ricombinazione omologa di sequenze ripetitive in tali regioni e sono stati evidenziati i meccanismi molecolari esatti ed eventi di ricombinazione alla base di queste alterazioni. Queste regioni sono ubicate sul cromosoma Yq11 e bensì la regione di microdelezione AZFa sia differente, è presente un livello significativo di sovrapposizione tra le regioni interessate dalla microdelezione della regione AZFb e AZFc (Figura 1). Braccio lungo Corto AZFc AZFb AZFa Figura. 1: Ubicazione dei cromosomi delle regioni di microdelezione AZFa, AZFb e AZFc sul cromosoma Y (Poongothai et al., 2009). L'identificazione delle cause genetiche dell'infertilità maschile può risultare in una gestione clinica più efficace dei pazienti. Ad esempio, i pazienti con microdelezione che interessa la regione AZFc (la più comune) presentano un fenotipo variabile (spesso dovuto al background genetico). Tuttavia, in generale questi pazienti mostrano livelli residui di spermatogenesi e vi è un 50% di possibilità di recuperare gli spermatozoi tramite TESE (estrazione testicolare di spermatozoi). Le coppie affette da microdelezioni della regione AZFc potrebbero essere in grado di concepire con l'aiuto di tecniche di fertilità assistita quali l'icsi (iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo). Ciò contrasta con i pazienti con microdelezioni totali nelle regioni AZFa, AZFb e AZFc da cui il recupero con successo di spermatozoi funzionali è improbabile (2), anche se la probabilità aumenta se la delezione non è totale (vedere Figura 2). ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 3 di 42

4 Principi della procedura La metodica impiegata dalla gamma di prodotti Elucigene Male Factor Infertility per produrre un test multiplex che individua l'aneuploidia dei cromosomi X e Y (Male Factor Infertility) nonché le microdelezioni del cromosoma Y (Male Factor Infertility e MFI-Yplus) è la tecnica QF-PCR (reazione a catena della polimerasi quantitativa in fluorescenza)(3-7). (i) Rilevazione dell'aneuploidia dei cromosomi sessuali Utilizzando l amplificazione mediante PCR, i primer marcati con un colorante fluorescente sono diretti a individuare le regioni altamente polimorfiche delle sequenze di DNA denominate ripetizioni in tandem brevi (short tandem repeat, STR) che sono localizzate sui cromosomi di interesse. Ogni marker STR individuato è specifico per il cromosoma su cui si trova, pertanto il numero di copie del marker STR può essere indicativo del numero di copie del cromosoma. Sono stati selezionati marker STR informativi che mostrano un elevata eterogeneità, in modo tale da determinare facilmente il numero di copie, pertanto i due alleli diun STR specifico per un cromosoma vengono determinati dalla tecnica QF-PCR come due picchi in rapporto 1:1. L osservazione di un allele STR in più come profilo a tre picchi in rapporto 1:1:1 o come profilo a due picchi in rapporto 2:1 o 1:2 è indicativo della presenza di una sequenza aggiuntiva che a sua volta rappresenta un cromosoma aggiuntivo, come nel caso di una trisomia. (ii) Rilevamento della microdelezione del cromosoma Y Nel 2004, la European Academy of Andrology (EAA) e l' European Molecular Genetics Quality Network (EMQN) hanno suggerito una serie di migliori pratiche per testare la microdelezione del cromosoma Y, valutando 2 marker mediante sito a sequenza etichettata (STS) tramite tecnica PCR per ciascuna regione di delezione: AZFa- sy84 e sy86, AZFb- sy127 e sy134 e AZFc- sy254 e sy255 (8). Nel 2014, queste linee guida sono state emendate al fine di includere l'analisi di estensione che ha fornito ulteriore caratterizzazione e dimensionamento della microdelezione della regione AZF rilevata, utilizzando un set separato di marker definiti: AZFa sy82, sy1182, sy83 ed sy88, AZFb sy105, sy121, sy143 ed sy153, AZFc (gr/gr sottotipo) sy1191 ed sy1291 (2). Un'ulteriore caratterizzazione/dimensionamento delle microdelezioni della regione AZF è utile per la maggiore probabilità di ottenere spermatozoi funzionali in pazienti con microdelezioni parziali che presentano una delezione completa di una o più di queste regioni. Ad esempio, la microdelezione gr/gr che costituisce una subdelezione della regione AZFc è tipicamente associata a un fenotipo più blando rispetto alle delezioni complete. Infatti, la rilevanza clinica di questa subdelezione varia in base al background genetico, essendo considerata la causa di un fenotipo di subfertilità in alcune popolazioni ed è persino considerata "fissa" in alcuni aplotipi del cromosoma Y, comuni nella popolazione giapponese senza alcun effetto sulla quantità di spermatozoi. I primer marcati con colorante fluorescente specifici per la sequenza che affiancano tali marker amplificano la sequenza wild-type mentre la perdita del picco diagnostico wild-type indica una microdelezione che copre questo marker STS. I prodotti amplificati ottenuti con la tecnica QF-PCR vengono analizzati in modo quantitativo con un analizzatore genetico mediante elettroforesi capillare per determinare il numero di copie dei marker STS analizzati. ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 4 di 42

5 Delezione di sy84, sy86 Delezione di sy127, sy134 Delezione di sy254, sy255 Analisi di estensione Confine prossimale: sy82 (+): sy83/sy1064 (-) Confine distale: sy1065/sy118 (-):sy88 (+) Analisi di estensione Confine prossimale: sy105 (+): sy121/sy1224 (-) Confine distale: sy143/sy1192 (-):sy153(+) Verifica del marker di eterocromatina sy160 Marker non compatibili con la delezione completa Delezione completa della regione AZFa di AZFb Delezione completa della regione AZFc B2/b4 o terminale [sy160 (-)] Fenotipo testicolare seminale variabile Possibilità di TESE virtualmente zero Possibilità di TESE all'incirca 50% (delezione b2/b4) Rapporto contenente consigli per consulenza genetica, screening in parenti maschi Rapporto contenente consigli per consulenza genetica Rapporto contenente consigli per consulenza genetica, Cariotipo (possibilità 45, mosaicismo X), screeninf in parenti maschi Figura 2: Diagramma di flusso riportante le conseguenze cliniche della scoperta di ciascun tipo di microdelezione del cromosoma Y comune (Krausz et al., 2014). ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 5 di 42

6 Avvertenze e precauzioni 1. Il DNA di controllo fornito con il kit è stato testato indipendentemente ed è risultato negativo per il virus dell'epatite B (HBV), dell'epatite C (HCV) e per il virus dell immunodeficienza umana 1 e 2 (HIV). 2. Si consiglia di maneggiare con cautela il materiale di origine umana. Tutti i campioni devono essere considerati potenzialmente infettivi. Nessun metodo di analisi può offrire la certezza assolutadell assenza dei virus HBV, HCV e HIV o di altri agenti infettivi. 3. La manipolazione dei campioni e dei componenti del test, il loro utilizzo, la conservazione e lo smaltimento devono avvenire in conformità con le procedure definite dalle rispettive linee guida o regolamenti nazionali in materia di sicurezza in ambito biologico. 4. In osservanza delle buone pratiche di laboratorio correnti, i laboratori devono analizzare i propri campioni di controllo di qualità interni contenenti un genotipo noto in ciascuna analisi, in modo da poter valutare la validità della procedura. 5. Se la scatola del kit è danneggiata, anche il contenuto potrebbe essere danneggiato; non utilizzare il kit e contattare l assistenza clienti. ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 6 di 42

7 Simboli usati sulle etichette I simboli utilizzati su tutte le etichette e confezioni sono conformi allo standard armonizzato ISO Produttore Quantità di test Vedere le istruzioni per l'uso X C Conservare al di sotto della temperatura indicata Utilizzare prima della data indicata Codice catalogo Numero di lotto o partita Dispositivo medico-diagnostico in vitro ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 7 di 42

8 Materiali forniti Kit Elucigene Male Factor Infertility Ogni kit contiene: Elucigene Male Factor Infertility (TA) (Cod. art ): 1 x 250µl (25 test), miscela master contenente primer per amplificare la STR (ripetizione in tandem breve) specifica di X e Y e marker non-str nonché marker della microdelezione del cromosoma Y. Per i dettagli dei marker in ogni kit, vedere l'appendice 2. La miscela Master contiene anche DNA polimerasi e trifosfati deossinucleotidi trifosfati in soluzione tampone. DNA Control (DC) (Cod. art ): 1 x 50µl fiala di DNA Control, normale sia per i marker di rilevamento dell'aneuploidia cromosomica sessuale sia per i marker di delezione del cromosoma Y nel test Elucigene Male Factor Infertility. Elucigene MFI-Yplus Kit Ogni kit contiene: Elucigene MFI-Yplus (TA) (Cod. art ) : 1 x 100 µl (10 test) di miscela master, contenente primer per amplificare i marker del cromosoma Y. Per i dettagli dei marker in ogni kit, vedere l'appendice 2. La miscela master contiene anche DNA polimerasi e trifosfati deossinucleotidi trifosfati in soluzione tampone. DNA Control (DC) (Cod.art ): 1 x 50µl fiala DNA Control, normale per i marker di delezione del cromosoma Y nel test Elucigene MFI-Yplus. Preparazione e conservazione del kit All'apertura del kit si consiglia che la miscela master venga dispensata in fiale da 0.2ml PCR in volumi da 10µle e congelata a -20 C. Accertarsi che il contenuto delle fiale sia accuratamente scongelato e miscelato prima di essere dispensato. Control DNA deve essere congelato a -20 C. ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 8 di 42

9 Materiali necessari ma non forniti In generale Materiale di consumo di laboratorio: guanti, provette per microcentrifuga con tappo a vite, fiale per PCR da 0.2ml PCR o piastre di microtitolazione consigliate dal produttore del termociclatore utilizzato, puntali per pipette. Apparecchiature di laboratorio: pipette di precisione (2 set: 1 per la pre-amplificazione e 1 per la manipolazione post-amplificazione), indumenti di protezione, agitatore vortex, microcentrifuga, centrifuga con piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Amplificazione mediante PCR Termociclatore adatto a contenere piastre per microtitolazione da 96 pozzetti o fiale da 0,2 ml, con accuratezza di temperatura minima di +/-1 C tra 33 C e 100 C e uniformità di temperatura statica di +/-1 C. Male Factor Infertility e MFI-Yplus sono stati convalidati e hanno mostrato di soddisfare le specifiche sulle seguenti piatteforme termociclatore consigliate: Life Technologies GeneAmp 9700 Life Technologies Veriti Dx (analisi in modalità standard) Life Technologies Veriti Dx (analisi in modalità di simulazione 9700) Life Technologies Proflex (analisi in modalità standard) Life Technologies Proflex (analisi in modalità di simulazione 9700) Elettroforesi capillare Elettroforesi capillare POP-7 Polimero (ABI Cat. N ), 10x analizzatore genetico in tampone (ABI Cat. N ) e formamide Hi-Di (ABI Cat N ), GeneScan 600v2 LIZ size standard (ABI Cat. N ) e matrix standard DS-33 (set colori G5) (ABI Cat. N ). Biosistemi applicati ABI 3130 e 3500 Analizzatori Genetici (con software GeneMapper), array di capillari di 36cm (array di capillari di 50cm per 3500 Analizzatore genetico), piastre ottiche a 96 pozzetti, setti per 96 pozzetti, cassette per 96 pozzetti. Dati delle analisi È richiesto uno dei seguenti pacchetti software di analisi dati: GeneMapper 3.7 (Applied Biosystems Inc.) o superiore o GeneMarker 1.65 (SoftGenetics LLC) o superiore. Documentazione supplementare sul prodotto Elucigene Male Factor Infertility Le presenti Istruzioni per l'uso comprendono una sezione base sull'interpretazione dei risultati ottenuti. Una guida supplementare dei prodotti Elucigene Male Factor Infertility all'interpretazione con esempi e glossario e una Guida al software di analisi sono disponibili sul sito Elucigene: ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 9 di 42

10 Prelievo e conservazione dei campioni Campioni di sangue intero (in EDTA) sono stati giudicati compatibili con questo test. È stato segnalato che talvolta i dispositivi di prelievo dei campioni hanno influito in modo negativo sull integrità di determinati analiti e che potrebbero interferire con alcune tecnologie metodologiche (9). Si raccomanda a ciascun operatore di assicurarsi che il dispositivo selezionato sia usato secondo le istruzioni della ditta produttrice e che i dispositivi di prelievo dei campioni siano compatibili con questo test. I campioni di sangue devono essere conservati a -20 C prima della preparazione del DNA. Evitare di congelare e scongelare ripetutamente il campione. Preparazione di DNA da campioni di sangue intero (trattato con EDTA) Si ottengono sempre risultati con DNA estratto con kit di sangue per DNA da 96 QIAamp (o il minikit per DNA QIAamp con Proteinasi K) seguendo il protocollo descritto nel manuale QIAamp partendo con 200 l di sangue intero liquido e procedendo all eluizione in 200 l di acqua per biologia molecolare. Concentrazione del DNA In condizioni ottimali e con l utilizzo delle configurazioni raccomandate per l iniezione dei campioni impostate nei moduli di analisi per la colonna capillare (vedere la nota nella sezione Elettroforesi capillare), si ottengono sistematicamente risultati accettabili con un quantitativo di DNA di input di 15 ng. Tuttavia, risultati interpretabili si ottengono con un range di DNA di input da 5ng a 30ng. La quantificazione del DNA è molto importante: per garantire risultati ottimali, è necessario misurare la concentrazione di ogni campione di DNA da analizzare. Sono accettabili tecniche quali la fluorescenza PicoGreen o l assorbenza UV. Data la varietà di tecniche per la quantificazione del DNA, l operatore dovrebbe adottare i seguenti accorgimenti: Quantitativi molto elevati di DNA di input aumenteranno la probabilità che i picchi di fondo vengano marcati dal software di analisi. Per ridurre la probabilità che i picchi di fondo vengano marcati, è possibile seguire la procedura riportata di seguito. Diluire il campione di DNA e ripetere l amplificazione. Ridurre il tempo di iniezione (vedere la sezione Elettroforesi capillare). Aumentare la soglia di ampiezza minima dei picchi (vedere la Guida al software di analisi Elucigene CF-EU2v1). Bassi quantitativi di DNA di input aumenteranno la probabilità di ottenere picchi diagnostici deboli che non vengono marcati dal software di analisi. Per aumentare il segnale, è possibile seguire la procedura riportata di seguito. Aumentare il tempo di iniezione (vedere la sezione Elettroforesi capillare). Estrarre nuovamente il campione ed eluirlo in un volume di acqua ridotto (50 l). ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 10 di 42

11 Protocollo del test Procedura di amplificazione Nota: per ridurre al minimo il rischio di contaminazione, i passaggi 3-5 devono essere eseguiti in un'area priva di DNA È inoltre necessario prendere provvedimenti per evitare la contaminazione con il prodotto PCR 1. Programmare il termociclatore per un singolo passaggio per attivare la DNA polimerasi a 94 C per 20 minuti collegata ad un programma ciclico di amplificazione di 1 minuto a 94 C (denaturazione), 2 minuti a 58 C (annealing) e 1 minuto a 72 C (estensione) per 30 cicli. Questo procedimento deve essere collegato ad un file di ritardo di 20 minuti a 72 C (estensione) sul ciclo finale. 2. Ciascun ciclo di PCR deve includere un controllo negativo (acqua). Potrebbe essere opportuno includere anche altri controlli, ad es. il controllo maschile normale positivo (DNA control fornito) e un controllo femminile normale (DNA non fornito). 3. Scongelare sufficienti fiale di miscela master pre-frazionata di prodotto Male Factor Infertility (Male Factor Infertility o MFI-Yplus) per il numero di campioni e controlli da analizzare (vedere nota in Materiali forniti) e centrifugare le fiale a 12,000g per 10 secondi. 4. Con punte di pipette separate, aggiungere 2.5µl di DNA di test a una fiala di campione contenente 10µl di miscela master e miscelare pompando su e giù. Eseguire questa procedura per tutti i campioni da testare. 5. Non aggiungere DNA alla fiala di PCR per il controllo negativo; sostituire con 2,5 μl di acqua sterile deionizzata. 6. Centrifugare brevemente le fiale fino a quando tutto il liquido si trova in fondo ad ogni fiala. 7. Posizionare le fiale nel blocco del termociclatore in modo che siano stabili. Avviare il programma di attivazione a 94 C seguito dal programma di amplificazione (vedere passaggio 1). 8. Al termine del programma ciclico di amplificazione, i campioni possono essere conservati a temperatura ambiente per tutta la notte oppure a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C per un massimo di 7 giorni prima dell analisi con elettroforesi capillare. ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 11 di 42

12 Elettroforesi capillare Si raccomanda a ciascun operatore di assicurarsi che l apparecchiatura per elettroforesi capillare selezionata venga usata secondo le istruzioni del produttore e che sia compatibile con questo test. In questo contesto, i parametri chiave sono il polimero e l array di capillari. È possibile ottenere risultati ottimali utilizzando le seguenti condizioni di elettroforesi capillare su un Analizzatore genetico ABI3130 o ABI Combinare 6,8 μl di GS600v2 LIZ size standard con 250 μl di formamide Hi-Di e miscelare accuratamente (miscela sufficiente per 16 pozzetti). Dispensare 15 μl di miscela nel numero richiesto di pozzetti di una piastra ottica da 96 pozzetti*. 2. Aggiungere 3 μl di prodotto di PCR del campione di test alla miscela size standard (ottenuta con il passaggio 1) già dispensata nella piastra e miscelare con la pipetta. Sigillare la piastra. 3. Denaturare il prodotto di PCR dispensato nella piastra ottica su un termociclatore utilizzando i seguenti parametri: 94 C per 3 minuti seguiti da 4 C per 30 secondi. 4. Centrifugare la piastra a 1,000g per 10 secondi per eliminare eventuali bolle presenti nei pozzetti, e caricare sull analizzatore genetico. *Nota: È fondamentale che i pozzetti inutilizzati (cioè i pozzetti in cui non è caricato alcun campione di DNA) siano ancora caricati con formamide Hi-Di per garantire che i capillari non si secchino. È possibile modificare le impostazioni di iniezione dei campioni in funzione della quantità di ampliconi prodotti durante la PCR, che può variare a seconda della quantità di DNA di input genomico aggiunto. Riducendo il tempo o la tensione di iniezione è possibile applicare una minore quantità di ampliconi alla colonna di analisi. Aumentando invece il tempo o la tensione di iniezione èpossibile applicare una maggiore quantità di ampliconi alla colonna di analisi. I campioni precedentemente amplificati possono essere reiniettati più volte per ripetere le analisi. Dati di analisi Post-PCR ABI3130 ANALIZZATORE GENETICO La gamma di prodotti Male Factor Infertility è stata concepita per essere compatibile con il prodotto Elucigene CFEU2v1. Come tale, i prodotti Male Factor Infertility possono essere analizzati con i Moduli e le impostazioni CFEU2v1 di analisi esistenti. In alternativa, l'operatore può creare un modulo Male Factor Infertility (MFI) separato come segue. Creare una scheda del campione utilizzando il software di acquisizione dati 3130 con le seguenti impostazioni: Nome del campione: deve essere lo stesso nome o numero specifico del campione. Titolare dell'analisi: selezionare il titolare predefinito per lab. Protocollo dell'analisi: MFI (contiene il modulo di analisi MFI 3130)*. *Nota: È necessario creare un modulo di analisi che specifichi le impostazioni dello strumento e successivamente assegnarlo a un Protocollo di analisi in cui è stato selezionato set colori G5. Per maggiori informazioni sulla creazione di moduli dianalisi, consultare il Manuale dell'operatore dello strumento. ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 12 di 42

13 MODULO DI ANALISI 3130 PER POLIMERO POP7 Modulo per capillare da 36cm: MFI Creare il modulo di analisi MFI nel Module Manager (Editor dei moduli) del software di acquisizione dati Assicurarsi che siano selezionate le seguenti voci: Type (tipo): Regolare Template (Modello): FragmentAnalysis36_POP7 Immettere le impostazioni illustrate in dettaglio nella tabella seguente: # Nome del parametro Valore Intervallo 1 Temperatura forno 60 int C 2 Volume riempimento poly passaggi 3 Stabilità corrente 5,0 int uamp 4 Tensione pre-analisi kvolt 5 Tempo pre-analisi sec. 6 Tensione iniezione 3, kvolt 7 Durata iniezione sec. 8 Tensione numero di passaggi nk 9 Intervallo passaggio tensione sec. 10 Tempo di ritardo dati sec. 11 Tensione analisi kvolt 12 Tempo di analisi sec. *Nota: Il "tempo di analisi" necessario varia a seconda della temperatura ambiente del luogo in cui è stato installato l analizzatore genetico. Per maggiori informazioni sulla creazione di moduli dianalisi, consultare il Manuale d'uso dell'analizzatore genetico Applied Biosystems Creare il protocollo MFI nel Protocol Manager (Editor dei protocolli) e assicurarsi che siano selezionate le seguenti voci: Type (Tipo): Regolare Run Module (Modulo di analisi): MFI (vedere modulo di analisi sopra) Dye Set (Set colori): G5 Per analizzare i campioni, creare una scheda campioni utilizzando il Plate Manager (editor della piastra);assicurarsi che sia stato selezionato il protocollo adatto al protocollo dello strumento (vedere sopra). Nota: Per maggiori informazioni sulla configurazione, sul funzionamento e sulla risoluzione dei problemidello strumento, consultare il Manuale dell operatore dell analizzatore genetico Applied Biosystems3130. ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 13 di 42

14 ABI3500 GENETIC ANALYZER (ANALIZZATORE GENETICO) È necessario creare un Instrument Protocol (Protocollo dello strumento) MFI che può essere utilizzato successivamente per ciascuna analisi di prodotto Male Factor Infertility. Creare l'instrument Protocol (protocollo dello strumento) mediante la libreria dei protocolli dello strumento Assicurarsi che siano selezionate le seguenti voci: Run Module (Modulo di analisi): FragmentAnalysis50_POP7 Immettere le impostazioni illustrate in dettaglio nella figura seguente: Per analizzare i campioni, creare una piastra campione facendo click su Create Plate from Template (crea piastra da modello) nel Dashboard ; assicurarsi che sia stato assegnato il protocollo dello strumento corretto per MFI (vedere sopra). ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 14 di 42

15 Scheda campione impostata per GeneMarker: Il software GeneMarker consente il confronto diretto tra i dati A e B dello stesso individuo. Per facilitare questo confronto è importante che la denominazione del file di output dei dati non elaborati (FSA) sia coerente per tutti i campioni e le miscele. La scheda campione deve contenere il nome del campioneunivoco per ogni campione analizzato seguito dal suffisso _A o _B a seconda delle miscela che sarà analizzata. Se nel nome FSA si deve includere l ID piastra occorre usare ogni volta un formato fisso, ad esempio MFI GGMMAAAA. Sullo strumento 3130 occorre configurare i parametri per "Results Destination" (destinazione risultati) in modo che il nome del file FSA includa il nome del campione, ad esempio MFI GGMMAAAA_1234,5_A_A01. Sullo strumento 3500 occorre impostare la convenzione del nome file in modo che il nome del file FSAcomprenda il nome del campione, ad esempio MFI GGMMAAAA_1234,5_A_A01. ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 15 di 42

16 Analisi e interpretazione dei risultati Interpretazione generale dei risultati I prodotti di PCR vengono osservati in un sistema marcato con 5 coloranti utilizzando il set di filtri G5. Il set di filtri G5 permette di rilevare i frammenti marcati con 6-FAM (blu), VIC (verde), NED (giallo) e PET (rosso) più il marker size standard marcato con LIZ (arancione) su un elettroferogramma con il programma GeneMapper o GeneMarker. Nota importante: Le diverse combinazioni di strumenti, polimeri e size standard possono causare lievi variazioni nell assegnazione delle dimensioni. Durante la convalida del kit, gli operatori devono controllare che le impostazioni del bin di default siano etichettature di picco precise e qualora necessario, regolarle. In caso di difficoltà, contattare l'assistenza tecnica (techsupport@elucigene.com). ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 16 di 42

17 Linee guida generali di analisi per tutti i prodotti Male Factor Infertility 1. Il controllo negativo non deve mostrare picchi alti e stretti nell intervallo di valori compreso tra 100 bp e 550 bp. 2. Il controllo positivo deve mostrare i risultati attesi e tutti i picchi devono soddisfare i criteri riportati di seguito. 3. Per l analisi di aneuploidia dei campioni di DNA si deve osservare almeno 1 picco per ogni marker analizzato. L intervallo accettabile per i picchi dei marker analizzati con l analizzatore genetico 3130 è compreso tra 50 e 6000 unità di fluorescenza relativa (rfu) sia per l'analisi di aneuploidia sia di microdelezione, mentre per i marker analizzati con gli analizzatori genetici 3500 è compreso tra 175 e rfu. Le altezze dei picchi che cadono al di fuori di questo intervallo non devono essere analizzate. 4. Gli elettroferogrammi di scarsa qualità dovuta ad eccessivo spargimento (bleedthrough) tra i coloranti (fenomeno noto anche col termine di "pull-up") o "spikes elettroforetici" (picchi alti e stretti presenti in più di un colorante) non devono essere interpretati. I prodotti di PCR devono essere reiniettati e rianalizzati. 5. L analisi di aneuploidia viene eseguita valutando il rapporto tra i picchi (A1/A2), dove A1 è l area del picco del frammento più corto e A2 è l area del picco del frammento più lungo Il rapporto che ne deriva è indicativo del numero di copie dei loci. Per le disomie cromosomiche, i marker eterozigoti devono mostrare due picchi con altezze simili. Un analisi completa dello stato del numero di copie dei cromosomi viene effettuata tramite confronto dei rapportidelle aree di picchi. 6. I marker eterozigoti diallelici (cioè due alleli) devono cadere in un intervallo di rapporti compreso tra 0,8 e 1,4. Tuttavia, per due alleli le cui dimensioni si discostano di più di 24 bp, è accettabile un rapporto non superiore a 1,5. Qualunque valore che cade all interno di questo intervallo viene considerato rientrante nel rapporto 1:1. Se il bilanciamento dei rapporti cade al di fuori di questo intervallo, la causa potrebbe essere attribuita a vari fattori, tra cui: Trisomia cromosomica completa (cromosoma sessuale) Trisomia cromosomica parziale (incluse le duplicazioni submicroscopiche) Mosaicismo Contaminazione secondo genotipo "Stutter" (artefatti costituiti da picchi più piccoli rispetto al picco principale) che causano "skewing" (deviazioni significative del rapporto 1:1); Amplificazione preferenziale di un allele che causa "skewing"; Polimorfismo in corrispondenza dei siti di legame dei primer Mutazioni somatiche nelle regioni microsatelliti La Guida all'interpretazione dei prodotti Elucigene Male Factor Infertility disponibile sul sito web di Elucigene contiene degli esempi di profilitipici per molti di questi casi. I marker omozigoti non forniscono informazioni utili in quanto non è possibile determinare un rapporto. ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 17 di 42

18 Analisi di marcatori del cromosoma sessuale AMEL, TAF9, XHPRT, DXYS218 e SRY (Test di Male Factor Infertility): Per interpretare un risultato come anomalo è necessario individuare almeno due marker informativi coerenti con il genotipo a tre alleli mentre tutti gli altri marker possono risultare non informativi. Non è consigliabile interpretare un risultato come anomalo basandosi sulle informazioni ottenute da un unico marker. 1. Il marker AMEL amplifica le sequenze non polimorfiche sui cromosomi X (104 bp) e Y (110 bp), può essere utilizzato per determinare la presenza o l assenza di un cromosomay e rappresenta la quantità di sequenze X rispetto alle sequenze Y. In rare occasioni è stato segnalato che l amplificazione non avviene a causa di una mutazione nella sequenza AMEL- Y. 2. TAF9L è un marker paralogo invariabile con sequenze sui cromosomi 3 e X. Il picco specifico per il cromosoma 3 (116 bp, che rappresenta 2 copie del cromosoma 3) puòessere quindi usato come picco di riferimento per determinare il numero di cromosomi X presenti (picco da 121 bp). Analizzato in combinazione con l amelogenina e con gli altrimarker dei cromosomi sessuali, è particolarmente utile nella diagnosi dell aneuploidia dei cromosomi sessuali. In un individuo normale di sesso femminile i marker devono cadere nell intervallo di rapporti compreso tra 0,8 e 1,4. In un individuo normale di sesso maschile i marker devono fornire un rapporto maggiore o uguale a 1,8. Maggiori dettagli sull'interpretazione del marker TAF9L sono disponibili nella Guida all'interpretazione dei prodotti Elucigene Male Factor Infertility. 3. I marker STR polimorfici DXYS267 e DXYS218 sono presenti su entrambi i cromosomi X e Y e rappresentano il numero totale di cromosomi sessuali Per i risultati informativi riferiti a individui maschi non è possibile stabilire quale allele rappresenti il cromosoma Xo il cromosoma Y. 4. Il marker informativo XHPRT specifico dell'x rappresenta il numero di cromosomi X. 5. Il marker specifico per il cromosoma Y, SRY, fornirà un singolo picco negli individui normali di sesso maschile e non verrà amplificato negli individui normali di sessofemminile. Analisi di marker di microdelezione del cromosoma Y (Male Factor Infertility e MFI-Yplus): 1. Tutti i marker di microdelezione del cromosoma Y sono rappresentati da un picco singolo. La perdita di un picco corrisponde a una microdelezione di quella regione. 2. Il marker ZFX/ZFY rappresenta sequenze sia sul cromosoma X che su quello Y. Dato che l'amplicone generato da entrambe le sequenze non può essere distinto per dimensione, questo marker fornirà un picco singolo indipendentemente dal sesso del campione. Questo marker non è previsto per l'uso diagnostico, ma serve come controllo dell'amplificazione. ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 18 di 42

19 GeneMapper Guida all'analisi Importazione e analisi dei file del prodotto Male Factor Infertility 1. Aprire il file del programma GeneMapper 2. Fare clic sul pulsante per aggiungere file di dati a un nuovo progetto. Cercare il luogo in cui sono salvati i file di dati grezzi.fsa, evidenziare i file di dati appropriati e fare clic sul pulsante "Add to List>>" (Aggiungi alla lista). 3. Apparirà la cartella di analisi nella finestra "Samples to Add" (Campioni da aggiungere). Facendo due volte clic sull'icona della cartella di analisi, in questa finestra sarà visualizzato ogni file.fsa da importare. Si aggiungono poi i campioni facendo clic su in fondo allo schermo. I file di dati appariranno ora all'interno dello schermo principale di GeneMapper (figura 2) Figura 2: Campioni pronti per essere aggiunti al progetto ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 19 di 42

20 Importazione delle impostazioni di analisi del prodotto Male Factor Infertility nel GeneMapper Manager È necessario importare le impostazioni di Male Factor Infertility per GeneMapper. Questo processo viene controllato tramite l'interfaccia "GeneMapper Manager". Le impostazioni del prodotto Male Factor Infertility GeneMapper sono disponibili sul sito web di Elucigene: 1. Avviare il programma "GeneMapper Manager", facendo clic sull'icona. 2. Selezionare la scheda "Analysis Methods" (Metodiche di analisi) e fare clic sul pulsante di importazione 3. Cercare i file delle impostazioni dell'analisi del prodotto Male Factor Infertility necessari (Male Factor Infertility o MFI-Yplus (3130 o 3500)) e importarli. 4. Ripetere il processo selezionando la scheda corretta e importando i rispettivi file per: Table Settings (Impostazioni tabelle) Plot Settings (Impostazioni grafico) Size standards (Size standard) Nota: Cluster Plot Settings (Impostazioni grafico cluster), Matrices (Matrici), SNP Sets (Set SNP) e Report Settings (Impostazioni rapporti) non richiedono l importazione di file. Nota*: Se i test Male Factor Infertility o MFI-Yplus vengono effettuati insieme al test Elucigene CFEU2 (fibrosi cistica), può essere utilizzata l'impostazione size standard CFEU2. Importazione delle impostazioni Male Factor Infertility Product in Panel Manager (Gestione pannelli) È necessario importare le impostazioni del file bin e dei pannelli Male Factor Infertility e MFI Y-plus per GeneMapper. Questo processo viene controllato tramite l'interfaccia "Panel Manager". Le impostazioni dei file bin e dei pannelli del prodotto Male Factor Infertility GeneMapper sono disponibili sul sito web di Elucigene: 1. Aprire il programma Panel Manager facendo clic sull'icona. 2. Fare clic su "Panel Manager" (Gestione pannelli) nella finestra di navigazione sinistra. Panel Manager appare ora evidenziato in celeste. 3. Selezionare "File/Import Panels" (File/importa pannelli). Cercare il file dei pannelli GeneMapper Male Factor Infertility_Panels.txt e importarlo (Figura 4). In alternativa, per MFI-Yplus selezionare MFI Y-plus_Panels.txt. 4. Il file dei pannelli verrà ora visualizzato nella finestra di navigazione sinistra. Fare clic sul file dei pannelli per accertarsi che sia evidenziato in celeste. 5. Selezionare "File/Import Bin Set" (File/Importa set bin). Cercare il file bin GeneMapper "Male Factor Infertility_Male Factor Infertility_ bins.txt" e importarlo (Figura 5). In alternativa, per MFI-Yplus selezionare MFI Y-plus_ MFI Y-plus_bins.txt. 6. Fare clic su "Apply" (Applica) e poi su "OK". ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 20 di 42

21 Figura 4: Importazione del File dei pannellitest di Male Factor Infertility Figura 5: Importazione del File bin Test Male Factor Infertility ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 21 di 42

22 Modifica del file dei parametri di analisi Potrebbe essere necessario modificare la voce predefinita "Analysis Ranges" (Intervalli di analisi) nelle impostazioni di analisi QST*R in previsione delle variazioni a livello locale delle condizioni di analisi. L intervallo minimo di analisi dipenderà dal capillare e dal polimero utilizzati durante l acquisizione dei dati. Per visualizzare le attuali impostazioni di analisi: 1. Aprire "GeneMapper Manager" facendo clic sull'icona. 2. Selezionare la scheda "Analysis Methods" (Metodiche di analisi). Il file importato del prodotto Male Factor Infertility sarà elencato come "Male Factor Infertility Analysis Settings" (Impostazioni analisi Male Factor Infertility) per Male Factor Infertility o "Male Factor Infertility Y-plus" per MFI-Yplus. 3. Fare clic su "Male Infertility Panel" (Panello Male Fertility) per Male Factor Infertility o Male Factor Infertility Y-plus per MFI-Yplus. La riga appare ora evidenziata. 4. Fare click sul pulsante "Open" (Apri) e selezionare la scheda "Peak Detector" (Rivelatore picco) (Figura 6) Figura 6: Intervalli di analisi. ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 22 di 42

23 Per individuare il corretto intervallo di analisi per il proprio laboratorio: 1. Nella finestra principale di GeneMapper, fare doppio clic sulla cartella di analisi importata per visualizzare un elenco dei file.fsa in essa contenuti. 2. Selezionare un file.fsa. 3. Facendo click sulla scheda "Raw data" (Dati grezzi) viene visualizzato un elettroferogramma dei dati grezzi. 4. Utilizzando come guida il primo picco del size standard (ad es., 60 bp di GS600LIZv2), selezionare un punto di dati di circa 100 punti più largo (Figura 7). In questo modo si determina il punto più basso nell intervallo analizzabile. 5. Assicurarsi che l intervallo massimo di analisi comprenda il picco più largo del size standard (600bp per GS600LIZv2). 6. Inserire i nuovi valori nel file di analisi QST*R (per accedervi procedere come indicato sopra). Figura 7: Individuazione dell intervallo minimo utilizzando i dati grezzi dei campioni ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 23 di 42

24 Analisi dei file di pannello del prodotto Male Factor Infertility importati 1. Nella finestra principale di GeneMapper selezionare GeneMapper, selezionare "Male Factor Infertility Table Settings" (Impostazioni tabella Male Factor Infertility) (Figura 8) Figura 8 Impostazione impostazioni tabella 2. In "Analysis Method" (Metodiche di analisi) selezionare "Male Factor Infertility Analysis Settings" Impostazioni Male Factor Analysis) o "Male Factor Infertility Y-plus" per Male Factor Infertiity o MFI-Yplus rispettivamente. Riempire ciascuna colonna premendo i tasti "Ctrl+D". Ripetere questo processo selezionando "Male Factor Infertility" o "MFI Y-plus" sotto l'intestazione del "Panel" (Pannello) e "Male Factor Infertility Size Standard" sotto l'intestazione "Size Standard". Ogni volta ricordarsi di riempire premendo "Ctrl+D" per accertarsi che ogni impostazione sia applicata alla lista intera di campioni. 3. Fare clic su per avviare l'analisi dei campioni. Assegnare un nome al progetto quando viene richiesto. Esame dei dati del prodotto Male Factor Infertility 1. Selezionare il campione da analizzare (evidenziare la riga del campione). 2. Fare clic su per "Display Plots" (Visualizzare i grafici). 3. Selezionare "Male Factor Infertility Plot Settings" (Impostazioni del grafico MaleFactor Infertility) (Figura 9) o "MFI Y-plus" secondo il quale il test viene analizzato. Figura 9: Impostazioni del grafico Male Factor Infertility, menu a discesa. 4. Nella finestra del grafico viene visualizzato il profilo del campione con i dati tabellari (Figura 10). GeneMarker assegna automaticamente le etichette a non più di due picchi per ciascun marker. Se per un marker sono presenti tre alleli, il terzo picco non etichettato dovrà essere etichettato manualmente (vedere: Manual Editing of Profiles (Modifica manuale dei profili, sotto). Note: Gli intervalli dell entità di ciascun marker si basano sui dati precedentemente osservati. Gli alleli rari potrebbero cadere al di fuori di un dato intervallo dell entità del marker e potrebbe essere necessario regolare il set bin di conseguenza. ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 24 di 42

25 5. Si consiglia di attivare l opzione "Single click editing" (Modifica con singolo clic). A tal fine selezionare "Alleles/set click editing" (Alleli/imposta modifica con clic) assicurarsi che questa opzione sia selezionata. Figura 10: Finestra dei grafici dei campioni in cui sono visualizzati i dati dei tracciati etichettati e la relativa tabella dei genotip Modifica manuale dei profili AVVERTENZA! GeneMapper assegnerà le etichette solo a non più di 2 picchi per marker. Pertanto, potrebbe essere necessario modificare i profili manualmente, ossia quando occorre assegnare le etichette ai terzi picchi (se presenti) o quando occorre rimuovere le etichette dai picchi "stutter". Per aggiungere l etichetta a un picco, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul picco non etichettato. Viene visualizzata l opzione che consente di aggiungere un commento ad un allele. Fare click su "OK". Il picco viene ora etichettato con le informazioni relative alle dimensioni, espresse in paia di basi, e all area del picco. Il picco appena etichettato verrà incorporato automaticamente nella tabella. Per rimuovere l etichetta da un picco, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sull etichetta del picco. Viene visualizzata l opzione che consente di eliminare il commento relativo ad un allele. Fare click su "OK". L'etichetta del picco viene ora rimossa. I dati eliminati relativi al picco verranno automaticamente rimossi dalla tabella. Copia dei dati tabellari 1. Evidenziare tutte le righe della tabella in basso nella finestra dei grafici. 2. Copiare le righe selezionate premendo i tasti "Ctrl+C". ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 25 di 42

26 Guida all'analisi GeneMarker Aggiunta di file dei campioni a GeneMarker Aprire il file del programma GeneMarker e selezionare "Open Data" (Apri dati) quando richiesto. Viene visualizzata la finestra Open Data Files (Apri file di dati). Fare click sul pulsante "Add"(Aggiungi). Viene visualizzata la finestra di dialogo Open (Apri). Cercare la directory contenente i file di dati grezzi; 1. Selezionare tutti i file premendo i tasti CTRL+A o utilizzare i tasti CTRL e/o MAIUSC per selezionare singoli campioni. 2. Fare clic sul pulsante "Open" (Apri) nella finestra di dialogo Open (Apri). I file selezionati verranno visualizzati nel campo Data File List (Elenco file di dati) (Figura 11). Figura 11: Campioni aggiunti all elenco dei file di dati. 3. Fare click sul pulsante "OK" nella finestra Open Data Files (Apri file di dati) e i campioni saranno caricati in GeneMarker. Il software apre quindi automaticamente la finestra Raw Data Analysis (Analisi dati grezzi) (Figura 12). ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 26 di 42

27 Figura 12: Finestra Raw Data Analysis (Analisi dati grezzi) ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 27 di 42

28 Importazione delle impostazioni dei pannelli del prodotto Male Factor Infertility È necessario importare le impostazioni dei pannelli per il prodotto Male Factor Infertility per GeneMarker. Questo processo viene controllato tramite l interfaccia "Panel Editor" (Editor Pannelli). Le impostazioni dei pannelli del prodotto Male Factor Infertility GeneMarker sono disponibili sul sito web di Elucigene: 1. Aprire "Panel Editor" (Editor pannelli) dal menu a discesa "Tools" (Strumenti) (Figura 13). Figura 13: Selezione di Panel Editor 2. Selezionare "Import Panels" (Importa pannelli) dal menu a discesa "File" (figura 14) Figura 14: Importazione dei pannelli 3. Cercare, ad esempio, il pannello GeneMarker MFI.xml o GeneMarker Y-plus e importarlo. 4. Ripetere il processo come indicato per gli altri rispettivi file dei pannelli. ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 28 di 42

29 Elaborazione dei dati Dopo il caricamento in GeneMarker, i file di dati grezzi sono pronti per essere elaborati. La fase di elaborazione include l applicazione di un size standard, l applicazione di filtri ai picchi che generano interferenze e, volendo, il confronto con un pannello di alleli noto. GeneMarker combina tutte queste fasi in un unico, semplice strumento denominato "Run Wizard" (Procedura guidata di analisi) (Figura 15). Per accedere alla procedura guidata di analisi basta fare clic sull icona "Run Project" (Progetto di analisi) nella barra degli strumenti principale. Run Wizard (procedura guidata di analisi) - Creazione di un modello di analisi necessario creare un modello di analisi al primo utilizzo del software per analizzare il prodotto Male Factor Infertility. Tale operazione viene eseguita tramite la Run Wizard (procedura guidata di analisi). 1. Per accedere alla Run Wizard, basta fare clic sull'icona "Run Project" (Progetto di analisi) nella barra degli strumenti principale. 2. Assegnare un nome al modello, ad es. QSTR. 3. Selezionare il Panel (pannello), il Size Standard, il Standard Colour (colore dello standard) e il Analysis Type (tipo di analisi) come illustrato sotto nella figura Fare click su "Save" (Salva) per memorizzare il modello da utilizzare nelle analisi future. 5. Fare click su "Next" (Avanti) per continuare. Figura 15: Run Wizard Finestra Template Selection (selezione del modello) ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 29 di 42

30 Run Wizard (procedura guidata di analisi) - Data Process (Elaborazione dati) La finestra Data Process (Elaborazione dati) della Run Wizard (procedura guidata di analisi) consente all'operatore di selezionare i parametri dei filtri da applicare ai picchi. 1. Selezionare le impostazioni di analisi appropriate nella finestra Data Process (Elaborazione dati) come illustrato nella figura sotto (Figura 16). 2. Fare click su "Next" (Avanti) per continuare. Nota: L impostazione dell intervallo di analisi nella finestra di analisi dei dati grezzi varia in base al polimero utilizzato durante la raccolta dei dati. L operatore deve selezionare un valore di partenza del punto di dati che includa il picco del size standard di 60bp. Figura 16: Run Wizard (procedura guidata di analisi) - Finestra Data Process (Elaborazione dati) Nota: Per 3500 dati, aumentare l'intensità minima a 150 ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 30 di 42

31 Run Wizard (procedura guidata di analisi) Additional Settings (Altre impostazioni) Non sono necessarie altre impostazioni (Figura 17). 1. Fare clic su "OK" per continuare. Figura 17: Run Wizard (procedura guidata di analisi) Additional Settings (Altre impostazioni) Finestra Data Processing (Elaborazione dei dati) Dopo aver fatto clic su "OK" nella finestra Run Wizard Additional Settings (Procedura guidata di analisi - Altre impostazioni), viene visualizzata la finestra Data Processing (Elaborazione dei dati) (Figura 18). I dati grezzi vengono elaborati e calibrati, quindi vengono applicati i parametri dei filtri e il pannello selezionato. 1. Fare click su "OK" nella finestra Data Processing (Elaborazione dei dati) quando l'analisi è completata. Figura 18: Finestra Data Processing (Elaborazione dei dati) ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 31 di 42

32 Finestra di analisi principale La finestra di analisi principale (Figura 19) di GeneMarker presenta un formato facile da usare. Questo formato include: elenco dei file dei campioni - visualizzato a sinistra nella finestra; immagine gel sintetica - visualizzata nella parte superiore della finestra; elettroferogrammi dei dati - sotto l immagine gel; tabella dei rapporti - visualizzata sul lato destro della finestra. In questa finestra è importante verificare che tutti i picchi appropriati in ciascun profilo siano stati assegnati correttamente. 1. Fare doppio clic su ciascun campione in sequenza nell elenco dei file dei campioni sul lato sinistro della schermata. Fare clic con il pulsante destro del mouse su qualsiasi picco in questione e scegliere tra le opzioni nella finestra di dialogo, ad esempio modificare o eliminare alleli, confermare o meno come pertinente. 2. Nella finestra di analisi principale selezionare l opzione del menu a discesa "Applications" (Applicazioni) nella parte superiore della schermata. Selezionare "Trisomy Analysis" (Analisi trisomia). Verrà visualizzata la finestra Trisomy Analysis Settings (Impostazioni analisi trisomia) (Figura 20). Figura 19: Finestra Main Analysis (Analisi principale) Figura 20: Finestra Trisomy Analysis Settings (Impostazioni analisi trisomia) Nota: Per 3500 dati, aumentare l intensità minima a 150 ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 32 di 42

33 Trisomy Analysis Settings (impostazioni per l analisi della trisomia) Nella finestra Trisomy Analysis Settings (Impostazioni analisi trisomia) sono disponibili due schede: 1. Scheda Analysis (Analisi). 2. Scheda Statistics Plot (Grafico statistico) Scheda Analysis (Analisi) La scheda Analysis (Analisi) fornisce le opzioni di impostazione soglia per l analisi della trisomia. Assicurarsi che nella finestra di analisi sia selezionato "BPG" e che siano visualizzate le seguenti impostazioni: Peak Height (Altezza picco) 50: altezza minima di 50 per l'assegnazione dei picchi (150 se si utilizzano 3500 dati) Height Ratio (Rapporto altezze) 30%: massima percentuale del picco principale che il secondo picco deve raggiungere affinché possano essere identificati due alleli. Quantification by Peak Area (Quantificazione per Area picco). Casella di controllo Lunghezza minore/maggiore selezionata. Valori soglia del Trisomy Ratio (rapporto della trisomia) compresi tra 0,80 e 1,40. Casella di controllo Apply Linear Correction (Applica correzione lineare) deselezionata. Fare clic su "OK" Finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia) La finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia) (Figura 21) permette all operatore di esaminare i dati dei campioni di aneuploidia e di visualizzare il rapporto dei picchi per ciascun marker, nonché di accedere al rapporto di GeneMarker. Nella finestra vengono visualizzate numerose funzioni che assistono l operatore nell analisi dei dati: Esse sono: Sample List (Elenco dei campioni) Electropherogram (Elettroferogramma) Ratio Plot (Grafico intervalli) Report Table (Tabella rapporti) Si fa notare che l'analisi di Trisomia non è necessaria per i dati di microdelezione del cromosoma Y. Figura 21: Finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia) Per informazioni più dettagliate sulle funzioni di analisi della trisomia e sul loro utilizzo, consultare il GeneMarker Manual (Manuale GeneMarker). ANXYAZFIT 001 Giugno 2015 Pagina 33 di 42