IL CONTRIBUTO DELLA GENETICA AL CHIARIMENTO DELLA COMPOSIZIONE AROMATICA DELL UVA

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1 COSTANTINI ET AL., GENETICA E COMPOSIZIONE AROMATICA DELL UVA, PAG. 1 IL CONTRIBUTO DELLA GENETICA AL CHIARIMENTO DELLA COMPOSIZIONE AROMATICA DELL UVA Laura COSTANTINI, Juri BATTILANA, Francesco EMANUELLI, Alberto MADINI, Cinzia SEGALA, Sergio MOSER, Giuseppe VERSINI, Stella GRANDO Istituto Agrario di San Michele all Adige, Via E. Mach 1, 381 San Michele all Adige (TN) Autore di riferimento: laura.costantini@iasma.it Poster presentato ad Enoforum 27, marzo, Piacenza, Italy RIASSUNTO Nonostante i numerosi studi volti a chiarire la struttura, la sintesi, la distribuzione e l evoluzione dei composti responsabili dell aroma, restano ancora in gran parte da definire i meccanismi genetici che lo controllano, così come la loro interazione con le condizioni ambientali e le pratiche colturali. Per stabilire associazioni significative tra la composizione aromatica della bacca e regioni del genoma di vite, il nostro gruppo ha applicato l analisi QTL alle mappe genetiche costruite a partire da due progenie segreganti. I marcatori strettamente associati ai QTL stanno venendo utilizzati per genotipizzare un campione di germoplasma che include la maggior parte della variazione fenotipica, allo scopo di valutarne la capacità predittiva nella progettazione di nuove varietà mediante incrocio. Inoltre per aumentare la risoluzione dei determinanti genetici identificati, fino al punto di attribuire l effetto dei QTL a specifici geni, oltre ai loci anonimi sono stati mappati anche marcatori ottenuti da sequenze geniche espresse scelte come geni candidati. Di grande interesse è la co-localizzazione di alcuni marcatori con i QTL, che rafforza l ipotesi del coinvolgimento dei relativi geni nella regolazione del carattere ed apre la strada alla ricerca di varianti geniche cruciali per la determinazione ottimale dell aroma e all adozione d interventi che favoriscano l espressione dei geni chiave del metabolismo aromatico per aggiungere valore alle tradizionali produzioni. INTRODUZIONE L aroma rappresenta, insieme alla resistenza ai patogeni, uno dei caratteri oggetto di maggior interesse in viticoltura. Il consumatore moderno ricerca, infatti, sia la dotazione aromatica dell uva da tavola che la finezza, la persistenza e la complessità aromatica del vino. In base alla loro origine si possono distinguere aromi varietali (propri cioè della bacca) ed aromi rilasciati durante i processi enologici (pre-fermentativi, fermentativi e post-fermentativi). I componenti dell aroma varietale, che sono comuni a molti vitigni ma presenti in combinazioni e concentrazioni diverse in ciascuno di essi, giocano un ruolo decisivo nella definizione del carattere del vino (Ribérau-Gayon et al., 2). Possono essere suddivisi in composti volatili aromatici (metossipirazine, terpeni odorosi, derivati nor-isoprenoidi e composti solforati) e composti non volatili inodori in forma sia di precursori non specifici (aminoacidi, acidi grassi insaturi a 18 atomi di carbonio, acidi fenolici ed acido cinnamico) che di precursori legati che contribuiscono all aroma solo in seguito ad idrolisi (terpeni glicosilati, C 13 nor-isoprenoidi glicosilati, precursori della cisteina). Il caratteristico aroma Moscato è comunemente attribuito alla presenza nel frutto di composti monoterpenici in forma libera o complessata (idrossilata o glicosilata). I più rilevanti, in base alla concentrazione ed aromaticità, sono il linalolo, nerolo e geraniolo che profumano di rosa, l αterpineolo che conferisce l odore di canfora e, infine, gli ossidi furanici e piranici del linalolo (Ribérau-Gayon et al., 1975; Strauss et al., 1986; Mateo e Jiménez, 2). L interesse della ricerca sui monoterpeni si è rivolto finora soprattutto al chiarimento della loro struttura, biosintesi, distribuzione nella pianta ed evoluzione durante la maturazione. E noto che i monoterpeni derivano dalla condensazione di isopentenil difosfato e del suo isomero dimetilallil difosfato che origina difosfati prenilici (geranil difosfato, farnesil difosfato e geranilgeranil difosfato) da cui si formano gli scheletri di tutti i terpeni (Lichtenthaler 1999). La sintesi di isopentenil difosfato e dimetilallil difosfato avviene attraverso due vie distinte ed indipendenti: una citoplasmatica e l altra plastidiale, che è stata recentemente dimostrata sia nelle foglie che negli acini di vite (Luan e Wüst, 22). Finora sono state clonate e caratterizzate in Vitis vinifera solo due sesquiterpene sintasi (Lücker et al., 24) ed una terpene sintasi che catalizza la ciclizzazione di geranil difosfato ad α-terpineolo (Martin e Bohlmann, 24). Ne deriva che restano ancora in gran parte da chiarire i meccanismi RIVISTA INTERNET DI VITICOLTURA ED ENOLOGIA, 27, N. 6/3

2 COSTANTINI ET AL., GENETICA E COMPOSIZIONE AROMATICA DELL UVA, PAG. 2 molecolari (natura dei geni e degli enzimi coinvolti e loro regolazione) che controllano l aroma Moscato, così come la loro interazione con fattori esterni quali le condizioni ambientali e le pratiche colturali. La spiegazione principale di ciò va cercata nel fatto che l aroma, come molti caratteri d interesse agronomico, ha una base genetica complessa, nel senso che non segue uno schema chiaro di presenza-assenza ma mostra una variazione continua nel fenotipo, fortemente influenzata dall ambiente ed attribuita all azione congiunta di più geni (QTL, Quantitative Trait Loci). L obiettivo del lavoro da noi effettuato è stato duplice: in primo luogo indagare le basi genetiche dell aroma Moscato attraverso l analisi QTL ed il metodo del gene candidato, in secondo luogo sviluppare strumenti molecolari predittivi per assistere la selezione di genotipi superiori nei programmi d incrocio della vite. MATERIALI E METODI L approccio adottato ha previsto l utilizzo di due progenie segreganti per l aroma Moscato, ottenute dall incrocio di varietà con fenotipi distinti: Italia x Big Perlon (163 individui) e Moscato bianco x Vitis riparia (175 individui). L aroma Moscato è stato rilevato come un carattere quantitativo nelle uve campionate da tutti gli individui in 2 (Moscato bianco x Vitis riparia) o 3 (Italia x Big Perlon) stagioni. Nella popolazione Italia x Big Perlon sono stati analizzati i tre monoterpeni linalolo, nerolo e geraniolo in forma libera, mentre nella popolazione Moscato bianco x Vitis riparia - in aggiunta a questi - sono stati valutati altri 18 composti sia in forma libera che legata a zuccheri. Tutti i composti sono stati separati e quantificati mediante un sistema combinato di gas cromatografia e spettrometria di massa. Parallelamente sono state costruite le mappe di associazione seguendo la trasmissione di specifici marcatori del DNA dai genitori di ciascun incrocio alla progenie derivata. Oltre a marcatori anonimi quali i microsatelliti e gli AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), sono stati posizionati anche marcatori derivati da sequenze geniche espresse (EST, Expressed Sequence Tags) scelte come possibili geni candidati alla determinazione del carattere in studio. Tali geni sono stati selezionati in base al loro coinvolgimento nelle vie metaboliche associate all aroma ( geni candidati per funzione, Pflieger et al., 21) consultando il vocabolario organizzato Gene Ontology ( Le corrispondenti sequenze espresse sono state estratte dalla banca dati TIGR ( sfruttando le informazioni di omologia con sequenze già annotate in altri organismi e sono state successivamente posizionate nelle mappe sotto forma di polimorfismi rilevati con diverse tecniche (CAPS, Cleaved Amplified Polymorphic Sequences; SSCP, Single Strand Conformational Polymorphism; minisequenziamento). L analisi di associazione è stata effettuata con il programma JoinMap 3. usando la funzione di Kosambi per la stima delle distanze di mappa, LOD 5 e frequenza di ricombinazione.45 per la determinazione dei gruppi di associazione. I dati fenotipici (contenuto dei monoterpeni) e quelli genotipici (informazioni di mappa) sono stati, infine, combinati per effettuare l analisi QTL alla ricerca delle regioni del genoma responsabili della variazione del carattere in studio. A tale scopo sono stati utilizzati il metodo non-parametrico Kruskall-Wallis e l interval mapping (SIM e CIM) implementati nel programma MapQTL 4.. Il valore soglia di LOD per dichiarare la significatività dei QTL è stato determinato facendo 1. permutazioni dei dati ed accettando un errore del 5 a livello di singolo cromosoma. RISULTATI E DISCUSSIONE In Tabella 1 sono riportati i composti aromatici analizzati nelle due progenie, mentre in Figura 1 è mostrato un esempio di cromatogramma e di distribuzione del contenuto di nerolo nella progenie Italia x Big Perlon. RIVISTA INTERNET DI VITICOLTURA ED ENOLOGIA, 27, N. 6/3

3 COSTANTINI ET AL., GENETICA E COMPOSIZIONE AROMATICA DELL UVA, PAG. 3 Italia x Big Perlon Moscato bianco x Vitis riparia individui 153 individui 154 individui 68 individui 62 individui linalolo linalolo nerolo 8 OH linalolo cis geraniolo 8 OH linalolo trans ossido linalolo A ossido linalolo B ossido linalolo C ossido linalolo D nerolo 7 OH nerolo geraniolo 7 OH geraniolo citronellolo 7 OH citronellolo α-terpineolo OH diolo I OH trienolo OH diolo II acido trans geranico acido benzilico acido β feniletilico metilsalicilato Tabella 1 Elenco dei composti aromatici analizzati nelle progenie Italia x Big Perlon e Moscato bianco x Vitis riparia A TC uva moscato 4settpostinv 6 TC uva moscato 4settpostinv (4.76) 15-JUN-261:43:16 6 TC uva moscato 4settpostinv Sc an EI+ 1 TIC 8.e8 ISTD Geraniol TC uva moscato 4settpost Time TC uva moscato 4settpostinv 15 - JUN :4 3: 16 TC uva moscato 4settpost 6 TC uva moscato 4settpostinv (23.35) 6 TC uva moscato 4settpostinv (56.386) Cm (19139: :1932) Sc an EI e OxA 8OH Linalool trans m/z TC u va mo sc ato 4s ett po stin v 1 5-J 6 TC uva moscato 4settpostinv (28.2) Lin alool B Frequenza Frequence Nerolo Figura 1 A) Esempio di cromatogramma B) Esempio di distribuzione del contenuto di nerolo nella progenie Italia x Big Perlon in tre annate ug/kg RIVISTA INTERNET DI VITICOLTURA ED ENOLOGIA, 27, N. 6/3

4 COSTANTINI ET AL., GENETICA E COMPOSIZIONE AROMATICA DELL UVA, PAG. 4 L analisi di segregazione dei marcatori del DNA ha permesso di ottenere una mappa per ciascun genitore ed una mappa consenso per ciascuna progenie. Nelle mappe, oltre ai microsatelliti ed agli AFLP, sono stati localizzati circa 4 marcatori per geni putativamente coinvolti nella determinazione dell aroma; essi codificano per enzimi implicati nelle due vie di biosintesi dell isopentenil difosfato (precursore di tutti i terpeni), nel metabolismo dei carotenoidi (da cui originano i derivati norisoprenoidi), nel metabolismo degli aminoacidi fenilalanina, tirosina e triptofano e, infine, per proteine indotte da stress e regolatrici dell espressione genica nel cloroplasto. In Figura 2 vengono presentati tre diversi metodi di rilevazione dei polimorfismi nelle sequenze dei geni candidati. Figura 2 Esempio di rilevazione con diverse tecniche di polimorfismi in marcatori derivati da sequenze espresse: A) CAPS B) SSCP C) minisequenziamento A B C IT DHAP-S-p: C/T A/G hk lm BP DHAP-S-p: C/T G hk ll DHAP-S-P: T A/G kk lm DHAP-S-p: C/T A/G hk lm L analisi QTL ha identificato in entrambe le progenie vari loci genetici (QTL) responsabili della variazione dei composti aromatici analizzati, la cui robustezza è stata confermata dalla riproducibilità RIVISTA INTERNET DI VITICOLTURA ED ENOLOGIA, 27, N. 6/3

5 COSTANTINI ET AL., GENETICA E COMPOSIZIONE AROMATICA DELL UVA, PAG. 5 dei risultati in annate e in varietà parentali diverse (stabilita attraverso la presenza di marcatori comuni nelle rispettive mappe). In alcuni casi QTL responsabili del contenuto di composti diversi, sia in forma libera che complessata, sono stati localizzati nelle stesse posizioni sui cromosomi, suggerendo l esistenza di zone calde nel genoma, come mostrato in Figura 3. LG2 LG VVIB1 VVIB23 VMC3B1 VMC6F1 ZAG93 VVIO OxA OxB Linalool OxC OxD a-terpineol HOlinalool-trans VMC6E1 VMC3C7 VMC5E11 4G5 VMC16D4 ZAG79 ZAG47 DXS1 4D9 OxA Linalool OxD Citronel Nerol Geraniol HOtrienolHOdioll HOdiolII HOcitron HOnerol HOlinalool-trans HOlinalool-cis HOgeraniol actransgeranic Figura 3 Co-localizzazione di QTL per diversi composti aromatici legati a zuccheri sui gruppi di associazione 2 e 5 di Moscato bianco Di grande interesse è risultato, infine, il co-posizionamento di alcuni marcatori per geni candidati con i QTL, che rafforza l ipotesi del coinvolgimento dei relativi geni nell espressione e regolazione del carattere in studio. Ad esempio, il marcatore DXS co-localizza con i QTL per il contenuto di vari monoterpeni sul gruppo di associazione 5. Esso corrisponde al gene per la 1-deossi-D-xilulosio-5- fosfato sintasi (Figura 4), il primo enzima della via plastidiale di sintesi dell isopentenil difosfato. Il possibile ruolo di regolazione di tale gene nell accumulo dei terpeni è sostenuto anche da esperimenti di promozione o inibizione della sua espressione in piante transgeniche di Arabidopsis (Estévez et al., 2) e dalla correlazione positiva tra i livelli del suo trascritto e la produzione di specifici terpeni osservata in varie specie di piante (Dubey et al., 23). La validazione dei geni candidati che co-localizzano con i QTL per il contenuto di monoterpeni è ora in corso di svolgimento attraverso due metodi. In primo luogo, stiamo effettuando l analisi di espressione di tali geni a stadi diversi di maturazione delle bacche (e, quindi, anche di evoluzione dei composti aromatici) in varietà con caratteristiche aromatiche diverse (Moscato bianco, Italia, Traminer, un clone aromatico di Chardonnay, uno non aromatico e Pinot come controllo neutro). Lo scopo è quello di verificare se l espressione di tali geni è modulata durante la maturazione e se è correlata al contenuto dei metaboliti aromatici. In secondo luogo, stiamo cercando associazioni statistiche tra i polimorfismi ai geni candidati e la variazione del contenuto di monoterpeni in un insieme di individui non imparentati che concentra il massimo della variabilità per il carattere in studio (core collection). Lo scopo è quello di individuare varianti geniche cruciali per la determinazione ottimale dell aroma. Infine, stiamo utilizzando la sequenza genomica della vite che è stata recentemente resa pubblica dal nostro istituto (NCBI, per identificare nuovi geni candidati per posizione nelle regioni sottese ai QTL nelle mappe genetiche, sfruttando la sequenza nota dei marcatori molecolari anonimi come punto di riferimento. RIVISTA INTERNET DI VITICOLTURA ED ENOLOGIA, 27, N. 6/3

6 COSTANTINI ET AL., GENETICA E COMPOSIZIONE AROMATICA DELL UVA, PAG. 6 LG5 669 PPTS TPP_DXS pyr Transket_C Transket AM bp mctgeatg1 mcateatt14 mcageatg16 DXS******* mctceatg8 mcateatt2 VMC3B9 VVMD27 mctceaag6 VrZAG79 mctgeaag7 mcageatg5 mctgeaag14 mcateatt3 VMC6E1 mccaeaag7 mccaeatg8 mcateatg11 VMC4C6 PPTS = Putative Plastid Target Sequence TPP_DXS = Thiamine pyrophosphate binding domain Transket_pyr = Transketolase pyridine binding domain Transket_C = Transketolase C-terminal domain Figura 4 Esempio di co-localizzazione tra il marcatore DXS ed i QTL per il contenuto di linalolo, nerolo e geraniolo sul gruppo di associazione 5 di Italia. A sinistra, struttura predetta della proteina DXS CONCLUSIONI In questo lavoro abbiamo identificato le regioni genomiche che spiegano la variazione del contenuto dei composti principalmente responsabili dell aroma Moscato in vite. L introduzione nelle mappe molecolari di marcatori per geni candidati ha rappresentato un significativo progresso verso la comprensione del controllo genetico di tale carattere, in quanto ha permesso di associare in alcuni casi l effetto fenotipico non più a generiche regioni nel genoma ma a specifici geni. La selezione di nuove varietà di vite basata sulla presenza delle varianti geniche cruciali per la determinazione ottimale dell aroma, così come l adozione di interventi che favoriscano l espressione dei geni chiave del metabolismo aromatico sono alcune delle prospettive aperte da queste ricerche per aggiungere valore alle tradizionali produzioni. BIBLIOGRAFIA Dubey V. S., Bhalla R., Luthra R. 23. An overview of non-mevalonate pathway for terpenoid biosynthesis in plants. J. Biosci. 28 (5): Estévez J. M., Cantero A., Reindl A., Reichler S., León P Deoxy-d-xylulose-5-phosphate synthase, a limiting enzyme for plastidic isoprenoid biosynthesis in plants. J. Biol. Chem. 276: RIVISTA INTERNET DI VITICOLTURA ED ENOLOGIA, 27, N. 6/3

7 COSTANTINI ET AL., GENETICA E COMPOSIZIONE AROMATICA DELL UVA, PAG. 7 Lichtenthaler H. K The 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 5: Luan F. and Wüst M. 22. Differential incorporation of 1-deoxy-D-xylulose into (3S)-linalool and geraniol in grape berry exocarp and mesocarp. Phytochemistry 6: Lücker J., Bowen P., Bohlmann J. 24. Vitis vinifera terpenoid cyclases: functional identification of two sesquiterpene synthase cdnas encoding (+)-valencene synthase and (-)-germacrene D synthase and expression of mono- and sesquiterpene synthases in grapevine flowers and berries. Phytochemistry 65: Martin D. M. and Bohlmann J. 24. Identification of Vitis vinifera (-)-8-terpineol synthase by in silico screening of full-length cdna ESTs and functional characterization of recombinant terpene synthase. Phytochemistry 65: Mateo J. J. and Jiménez M. 2. Monoterpene in grape juice and wines. J. Chromatogr. A 881: Pflieger S., Lefebvre V., Causse M. 21. The candidate gene approach in plant genetics: a review. Mol. Breed. 7: Ribérau-Gayon P., Boidron J. N., Terrier A Aroma of muscat grape varieties. J. Agric. Food Chem. 23 (6): Ribéreau-Gayon, Glories Y., Maujean A. Dubourdeu D. 2. The Chemistry of wine and stabilization and treatments. Handbook of Enology, Vol. 2 John Wiley and Sons Ltd Strauss C. R., Wilson B., Gooley P. R., Williams P. J Role of monoterpenes in grape and wine flavour. In: Parliament T., Croteau R. (Eds.), Biogeneration of Aromas. Amer. Chemical Soc., Washington DC, RINGRAZIAMENTI Questo lavoro è stato finanziato dalla Provincia Autonoma di Trento (Progetto post-doc QTL-A) RIVISTA INTERNET DI VITICOLTURA ED ENOLOGIA, 27, N. 6/3