Preparazione ed allestimento dei preparati citologici

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1 Preparazione ed allestimento dei preparati citologici Dr.ssa Ilaria Di Candia, DVM La citologia diagnostica (citopatologia) è l esame morfologico delle cellule prelevate da un tessuto. L utilità della citopatologia nella pratica clinica risiede nella rapidità, non invasività, facilità d'esecuzione, relativa economicità, ed ai rischi minimi che corre il paziente durante il prelievo. Il vantaggio rispetto all'istopatologia è riconducibile essenzialmente alla riduzione nei tempi di refertazione. La citologia diagnostica trova applicazione soprattutto nelle masse cutanee, nella ricerca di agenti infettivi microscopici e si rileva particolarmente utile nell individuazione di neoplasie a cellule discrete. I limiti della citologia risiedono nell impossibilità di valutazione dell architettura e dell infiltrazione, nei tessuti adiacenti, di tessuto patologico: per queste indagini si rileva necessaria l indagine istopatologica. Si deve inoltre ricordare che un campione citologico non sempre è rappresentativo della lesione: per esempio con pazienti in sovrappeso è possibile aspirare il tessuto adiposo circostante la lesione, I preparati ottenuti per apposizione o scarificazione di lesioni ulcerate possono contenere solo cellule superficiali ed essere preda di flogosi/infezioni secondarie e, ancora, I linfonodi linfomatosi notevolmente aumentati di volume possono diventare necrotici e quindi fornire campioni non diagnostici. Citologia Istologia Velocità di esecuzione Costi di esecuzione Analisi cellulare Analisi strutturale Capacità diagnostica Tabella1: da Poli, Ciorba: Citologia diagnostica del cane e del gatto, 2007.

2 MATERIALI E METODI MATERIALI AGHI da 25G-27G o AGHI SPINALI (tessuti endocavitari parenchimatosi) e SIRINGA da 5-10ml oppure TAMPONI STERILI o CYTOBRUSH e VETRINI PULITI, SGRASSATI, preferibilmente con un estremità sabbiata su cui scrivere a matita, i dati utili per il riconoscimento dei preparati. PORTAVETRINI POSTALI FONTE DI CALORE (PHON) per l'asciugatura PROVETTE VUOTE e contenenti EDTA per l'analisi dei liquidi. METODI Esistono tecniche di prelievo diverse che trovano indicazione in base a tessuto, regione anatomica o tipo di lesione che si intende campionare. Prima di eseguire il prelievo è importante preparare tutto il materiale necessario per il tipo di campionamento che si intende eseguire. A) AGO-INFISSIONE (Fine Needle Biopsy- FNB) INDICAZIONI: tessuti solidi, masse, linfonodi, organi parenchimatosi. ESECUZIONE: Per le masse cutanee/sottocutanee o i linfonodi è necessario tenere saldamente il tessuto da campionare tra due dita di una mano, mentre con l altra si inserisce l ago (preferibilmente non collegato ad una siringa) all interno del tessuto con un movimento rotatorio o spingendo delicatamente l'ago verso il centro della massa e ritraendolo. Tale operazione va eseguita anche in direzione obliqua. Figura 1 Ottenuto il campione, si collega l'ago ad una siringa vuota in cui si è ritratto lo stantuffo, quindi si esercita una pressione adeguata sullo stantuffo per adagiare il materiale su uno o più vetrini puliti.

3 B) AGO-ASPIRAZIONE (Fine Needle Aspiration-FNA) Utile nel campionamento di tessuti solidi tenaci o di liquidi (versamenti intracavitari, liquido sinoviale). 1. Tessuti: la tecnica è la stessa dell'ago-infissione con la differenza che in questo caso Figura 2 Figura 3 l'ago è collegato alla siringa su cui si esercita o una pressione continua oppure intermittente. 2) Liquidi L'aspirazione è continua, per la raccolta di liquidi presenti in grande quantità si può utilizzare una siringa più capiente collegata ad un ago a farfalla. Il materiale raccolto DEVE essere aliquotato in due provette: una contenente EDTA ed una vuota, senza gel poichè le cellule vi possono aderire determinando una falsa diminuzione del loro numero totale ; è sempre importante preparare subito, con il liquido tal quale almeno un vetrino che va asciugato rapidamente all'aria o mediante una fonte di calore.

4 C) APPOSIZIONE/IMPRONTA Impiegata per la raccolta di materiale da lesioni ulcerate o da prelievi bioptici. Se utilizzata per lesioni ulcerate il campionamento va eseguito prima e dopo pulizia della parte mediante una garza imbevuta di soluzione fisiologica sterile; in questo caso basta appoggiare con una buona pressione la superficie di un vetrino pulito sulla lesione: tale operazione può essere effettuata 2-3 volte per ogni vetrino. Nel caso di asportazione di lesioni solide o prelievi bioptici è necessario sezionare il campione per ottenere una superficie adeguata e quindi allontanare il liquido in eccesso ponendo delicatamente il campione su carta bibula o da filtro. Figura 4 Figura 5 Si poggia quindi il campione ormai asciutto sulla superficie del vetrino, senza farlo strisciare. Figura 6 Figura 7

5 D)TAMPONI Trovano utilizzo nel campionamento delle mucose (orale, nasale, vaginale). Il tampone sterile va inserito sulla superficie della mucosa da campionare operando un'azione rotatoria delicata. La deposizione del materiale sul vetrino va eseguita per rotolamento, srotolando il tampone più volte sulla superficie del vetrino. Figura 8 E) SPAZZOLAMENTO/CYTOBRUSH Metodo più usato in endoscopia, può essere utilizzato anche per prelievi di mucosa orale o congiuntivale. Figura 9 Figura10 Si utilizza uno spazzolino apposito con cui si raccoglie il materiale che viene poi delicatamente depositato sui vetrini. Figura 11

6 TECNICHE DI ALLESTIMENTO DEI VETRINI Come linee generali il materiale per l'esame citologico deve essere posizionato vicino alla banda sabbiata, e mai ad una estremità del vetrino, questo perchè altrimenti non è possibile valutare l'intero campione. Le tecniche di allestimento dei preparati, oltre a quelle già illustrate per I tamponi e lo spazzolamento sono: 1) SQUASH-PREPARATION Si pone il materiale su un vetrino pulito e si utilizza un secondo vetrino posizionato perpendicolarmente al primo da apporre al campione: appena quest'ultimo si espande si fa decorrere velocemente il vetrino incidente lungo il vetrino portaoggetto. Figura 12

7 2) PUSH AND PULL Figura 13 La tecnica è simile alla precedente con la differenza che il vetrino incidente è posizionato parallelamente al portaoggetto; con questa tecnica è possibile utilizzare entrambi I vetrini per l'esame citologico. 3) STAR-FISH Figura 14 Questa tecnica utilizza l'ago con cui si è eseguito il campionamento per strisciare il materiale sul vetrino. L'inconveniente maggiore è rappresentato dal mancato raggiungimento di un monostrato cellulare: in citopatologia gli aggregati di aspetto tridimensionale, con gli elementi cellulari sovrapposti gli uni agli altri non sono valutabili (unica eccezione il tessuto adiposo).

8 CAUSE DI INADEGUATEZZA DEL CAMPIONE CITOLOGICO Le cause di inadeguatezza sono diverse e possono essere ricondotte a scorrette pratiche di campionamento, di allestimento e di conservazione. Campionamento Uso di aghi di grande calibro Può causare inadeguatezza per due ragioni: -Emocontaminazione -Presenza di materiale tissutale ammassato, di aspetto microscopico tridimensionale. Eccessiva forza esercitata durante il prelievo Accade soprattutto quando si attua l'ago-aspirazione, in particolare per tessuti delicati come il tessuto linfonodale oppure esercitando troppa pressione con il cytobrush: la popolazione cellulare può subire danni tali da renderla non valutabile. Prelievo di tessuto extra-lesionale Figura16 Figura17 Le cause più comuni risiedono nel passare tangenzialmente alla lesione oppure nell'oltrepassarla(vedi figure16-17). Allestimento Materiale non strisciato Eccessiva pressione durante l'allestimento del vetrino con conseguente danno cellulare.

9 Conservazione Esposizione ai vapori di formalina. La formalina impedisce il corretto processo di colorazione citologica rendendo I preparati non valutabili. Contenitori inadeguati: I vetrini possono rompersi durante il trasporto se non vengono introdotti in contenitori idonei (portavetrini postali). Bibliografia - A. Poli, A. Ciorba, Citologia del cane e del gatto, 1 a ed R.L. Cowell, R. Tyler, J. Meinkoth, D. DeNicola, Diagnostic Cytology and Hematology of the dog and cat, 3 th edition, R. Raskin, D. Meyer Canine and Feline Cytology, 2 nd edition, E. Villiers, L. Blackwood, Gli Esami di Laboratorio del cane e del gatto, R. Baker, J. Lumdsen, Citologia del cane e del gatto-atlante a colori 1 a ed. italiana, 2001 Iconografia - Figura 1: R. Raskin, D. Meyer Canine and Feline Cytology, 2 nd edition, Figure 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 15, 16, 17: R.L. Cowell, R. Tyler, J. Meinkoth, D. DeNicola, Diagnostic Cytology and Hematology of the dog and cat, 3 th edition, Figure 8, 12: A. Poli, A. Ciorba, Citologia del cane e del gatto, 1 a ed. 2007