AUXANOGRAMMA COLORIMETRICO PER L'IDENTIFICAZIONE DEI PRINCIPALI LIEVITI DI INTERESSE MEDICO

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1 AUXACOLOR TM tests AUXANOGRAMMA COLORIMETRICO PER L'IDENTIFICAZIONE DEI PRINCIPALI LIEVITI DI INTERESSE MEDICO IVD

2 1- INTERESSE CLINICO La frequenza delle infezioni fungine e in particolare quelle derivate dai lieviti è notevolmente aumentata negli ultimi vent'anni e il profilo di tali infezioni, legato all'evoluzione delle malattie opportuniste, è cambiato considerevolmente. La variabilità delle localizzazioni di tali infezioni e la diversificazione delle specie riscontrate hanno reso necessaria la ricerca di lieviti nei prodotti patologici superficiali o profondi. D'altro canto, vista la recrudescenza di queste infezioni e l'utilizzo più frequente degli antimicotici, si assiste a una emergenza di ceppi patogeni resistenti. Per questa ragione diventa indispensabile identificare con precisione le specie di lieviti in oggetto. AUXACOLOR 2 risponde a questa esigenza permettendo di identificare le specie riscontrate con maggiore frequenza in campo clinico. Agevole nel funzionamento e semplice da interpretare, può integrarsi senza problemi in tutti i laboratori. 2- PRINCIPIO DEL TEST Il sistema AUXACOLOR 2 è un metodo di identificazione basato sul principio dell'assimilazione degli zuccheri. La crescita dei lieviti è visualizzata dal viraggio di un indicatore di ph. Il sistema comporta anche 3 test enzimatici di cui uno relativo all'individuazione dell'attività fenolossidasica del Cryptococcus neoformans. 3- NATURA DEI TEST UTILIZZATI Il sistema comprende: un indicatore negativo che facilita la lettura dei risultati dell'assimilazione (pozzetto di colore blu) 13 test di assimilazione con i seguenti zuccheri: - glucosio (GLU.) : indicatore positivo - maltosio (MAL.) - cellobioso (CEL.) - saccarosio (SAC.) - trealosio (TRE.) - galactosio (GAL.) - adonitolo (ADO.) - lattosio (LAC.) - melezitosio (MEL.) - raffinosio (RAF.) - xilosio (XYL.) - inositolo (INO.) - arabinosio (ARA.) 64

3 Ciascuno di questi zuccheri è disidratato in presenza di un terreno di base e di un indicatore di ph: il violetto di bromocresolo. La crescita di un lievito si traduce in un viraggio dell'indicatore dal blu al giallo e in un intorbidimento nel pozzetto. 1 test enzimatico per il rilevamento dell'attività N-acetil-galattosaminidasi (esosaminidasi: HEX). Una reazione positiva è indicata da una colorazione gialla del pozzetto, mentre un test negative rimane incolore 1 test fenolo ossidasi (POX) per il rilevamento dell'attività fenolossidasica del Cryptococcus neoformans associato a un test di rilevamento dell'attività prolina arilamidasi (PRO). - una colorazione marrone del pozzetto indica un'attività fenolossidasica (POX) positiva. - una colorazione gialla indica un'attività prolina arilamidasi (PRO) positiva. - un'assenza di colorazione o una colorazione grigia corrisponde ad una reazione negativa per questi due test. La coesistenza dei test POX e PRO nello stesso pozzetto si giustifica con il fatto che questi due test non sono mai positivi contemporaneamente. I soli profili possibili sono: POX negativo / PRO negativo; POX positivo / PRO negativo; POX negativo / PRO positivo. Questo consente l'interpretazione colorimetrica descritta in precedenza. SCHEMA DELLA MICROPIASTRA AUXACOLOR TM 2 C.Neg GLU. MAL. SAC. GAL. LAC. RAF. INO. CEL. TRE. ADO. MEL. XYL. ARA. HEX. POX./PRO. REF LOT BIO-RAD 65

4 4- COMPOSIZIONE DEL KIT Il Kit da 20 test, codice 56513, contiene: 20XR1 micropiastre da 16 pozzi confezionate singolarmente 20XR2 mezzo di sospensione pronto per l'uso 20 film adesivi 1 blocchetto di fogli per i risultati 1 foglietto illustrativo 5- AVVERTENZA E PRECAUZIONI PER L'USO Non utilizzare la confezione dopo la data di scadenza. Manipolare tutti i campioni come se fossero potenzialmente infettivi e effettuare le colture attenendosi a tecniche di laboratorio asettiche. Gettare il materiale contaminato in un recipiente idoneo allo smaltimento di rifiuti di laboratorio. 6- CONSERVAZIONE DEI REAGENTI I reagenti vanno conservati a una temperatura di 2-8 C, nel loro imballo singolo. In tali condizioni, i reagenti si mantengono stabili fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta. Una volta aperto l'imballo singolo, il sistema può essere conservato a temperatura ambiente per 10 ore senza perdere le sue caratteristiche. 7- PROCEDURA Materiale fornito Vedere la sezione Composizione del Kit Materiale necessario, ma non fornito Kit indicatore di opacità codice Anse per il prelievo delle colonie. Pipette per la misurazione ed erogazione di 100 µl. Vasca disinfettante o sacco autoclavabile per lo smaltimento del materiale contaminato. Eventualmente, un densitometro. 66

5 Fasi Portare i reagenti a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. 1. Inoculo della micropiastra - Preparare l'inoculo a partire da una coltura di h realizzata su terreno di Sabouraud (+/- antibiotici) o su un mezzo cromogeno (CandiSelect TM 4 codice 63746). In condizioni sterili, inoculare il mezzo di sospensione (R2) con colonie di ceppo puro (esenti da batteri e da associazioni con altri lieviti) in quantità sufficiente (da 1 a 5 colonie identiche) ad ottenere un'opacità equivalente all'indicatore di opacità fornito nel kit con il codice (opacità pari a 1,5 McFarland). È necessario rispettare l'opacità dell'inoculo per garantire la qualità dei risultati. - Omogeneizzare la sospensione con un vortex Mezzo di sospensione (R2) C.Neg GLU. MAL. SAC. GAL. LAC. RAF. INO. CEL. TRE. ADO. MEL. XYL. ARA. HEX. POX./PRO. - Prelevare e distribuire con una pipetta 100 µl di inoculo in ciascun pozzetto della micropiastra (R1). - Ricoprire la micropiastra (R1) con l'adesivo assicurandosi di ottenere un'adesione perfettamente uniforme. Incubare per 48 h (72 h se necessario) a 30 C (± 2 C) 2. Lettura dei risultati La lettura definitiva deve essere effettuata dopo 48 h. Anche se una prima lettura a 24 h può già dare un codice corretto e consentire l'identificazione di alcuni lieviti, raccomandiamo di effettuare l'interpretazione definitiva dopo 48 h. In caso di sospetto d'infezione da criptococco, la lettura definitiva si effettuerà a 72 h, data la crescita lenta di questi microrganismi. 100 µl 67

6 Per facilitare la lettura, è possibile guardare sul rovescio della micropiastra o staccare l'adesivo, rispettando le norme di sterilità d'uso e qualora fosse necessario ripetere l'incubazione. In tal caso, riattaccare con cura l'adesivo, annotare i risultati facendo riferimento alla tabella della pagina 71 e riportarli sul form previsto a questo scopo. 3. Interpretazione dei risultati a) Guida per l interpretazione delle reazioni colorate Pozzetto Test Colore/Interpretazione Indicatore negativo C. Neg Controllo negativo Blu Test di assimilazione degli zuccheri Test enzimatici GLU MAL SAC GAL LAC RAF INO CEL TRE ADO MEL XYL ARA HEX POX/PRO Glucosio (Indicatore positivo) Maltosio Saccarosio Galactosio Lattosio Raffinosio Inositolo Cellobioso Trealosio Adonitolo Melezitosio Xilosio Arabinosio Rilevamento dell'attività N-acetil-galattosaminidasi (esosaminidasi). Rilevamento dell'attività fenolossidasica del Cryptococcus neoformans (POX) Rilevamento dell'attività prolina arilamidasi (PRO) Negativo Blu (a) o Verde Incolore Incolore o Grigio (c) Positivo Giallo (b) o Incolore Giallo Marrone Giallo (b) 68

7 (a) Blu-Grigio e Blu-Verde sono considerati come negativi. (b) Giallo pallido e giallo verde sono considerati come positivi. (c) Alcuni ceppi di Geotrichum capitatum, Geotrichum candidum, Trichosporon spp e Cryptococcus laurentii possono determinare una colorazione grigio-marrone del pozzetto. In questo caso, la reazione è negativa e durante la codifica va attribuito il valore «zero» a questi pozzetti. b) metodologia per la codifica Per l'identificazione vengono utilizzati i 16 caratteri biochimici, distribuiti in 15 pozzi (i test POX e PRO sono associati in uno stesso pozzo). Combinando per 3 i valori dei 15 test seguenti, si ottiene un profilo numerico a 5 cifre: 1a cifra Glucosio Maltosio Saccarosio 2a cifra Galacttosio Lacttosio Raffinosio 3a cifra Inositolo Cellobiosio Trealosio 4a cifra Adonitolo Melezitosio Xilosio 5a cifra Arabinosio Esosaminidasi Fenolo ossidasi Ad ogni reazione negativa viene attribuito il valore zero e ad ogni reazione positiva un valore in relazione con la posizione all'interno della tripletta: 1 per la posizione 1 2 per la posizione 2 4 per la posizione 3 nella tripletta La somma di questi tre valori dà una cifra che consente di ottenere un profilo numerico a 5 cifre : Es.: Glucosio + Maltosio + Saccarosio = la prima cifra è 7. L'attività prolina arilamidasi (PRO: pozzo POX/PRO) verrà annotata con + o - secondo il colore osservato: - pozzetto giallo (i colori giallo pallido e giallo-verde sono considerati come positivi): test PRO positivo. 69

8 - pozzetto incolore o grigio (una colorazione grigio-marrone è considerata come negativa): test PRO negativo. Due cifre supplementari sono calcolate secondo la metodologia sopra descritta e completano il codice. Rappresentano i caratteri seguenti: Pigmentazione (PI.) Artrospore (AR.) Capsula (CA.) Micelio/pseudo-micelio (MY. PS-MY.) Clamidospore (CHL.) Crescita a 37 C L'identificazione finale si basa sull'associazione dei test biochimici con i caratteri complementari (morfologici e metabolici) determinati nelle abituali condizioni. Esempi: CEPPO GLU. MAL. SAC. GAL. LAC. RAF. INO. CEL. TRE. ADO. MEL. XYL. ARA. HEX.POX./PRO. PI. AR. CA. MY./PS-MY. CHL. 37 C Ceppo N Ceppo N Ceppo N Calcolo dei profili numerici corrispondenti e identificazione: Ceppo Test biochimici Profilo numerico Test PRO Caratteri complementari Identificazione Ceppo N C. albicans Ceppo N C. glabrata Ceppo N Cryptococcus neoformans Dopo aver determinato il profilo numerico, quest'ultimo va ricercato nel database che appare nella pagina 15. Nel caso in cui si ottenga un profilo numerico non catalogato (profilo raro), rifarsi alla tabella di interpretazione (pagina 71). 70

9 Tabella di interpretazione GLU. MAL. SAC. GAL. LAC. RAF. INO. CEL. TRE. ADO. MEL. XYL. ARA. HEX. POX./PRO. PI. AR. CA. MY. CHL. 37 C SPECIE PS -MY. C. ALBICANS (-) V V + (-) V + (-) (-) + C. ALBICANS 2 (1) V V - V V (-) + C. CIFERRII (-) + V V C. DUBLINIENSIS V + (-) - (+) (-) C. FAMATA V (-) V V - - V V C. GLABRATA (+) C. GUILLIERMONDII (-) (-) + (-) + (-) C. INCONSPICUA (+) V C. KEFYR (-) + - V - (+) - (+) - V V (-) - + C. KRUSEI (+) C. LIPOLYTICA (+) (+) - - (+) (-) V C. LUSITANIAE (-) - (+) V + + (-) V - - V (-) - + C. NORVEGENSIS (-) (+) C. PARAPSILOSIS (-) V + (-) + (-) V C. RUGOSA (-) V - V - (+) - - V C. SAKE V V + V + V - + (-) - V C. TROPICALIS (-) V + + (-) (+) C. ZEYLANOIDES (+) (+) + (-) V (+) - + (-) (+) C. ALBIDUS V V V V + V V + + V - - V V C. LAURENTII C. NEOFORMANS V + V V V + (-) V V - + (-) C. UNIGUTTULATUS V - V + - V V + + (-) V - - V G. CANDIDUM (-) V (+) - (+) (+) G. CAPITATUM V K. APICULATA R. GLUTINIS V - V - V + V + V V V V R. MUCILAGINOSA (RUBRA) + V + V V V V V V V V V S. CEREVISIAE + + (-) + V - + (-) - - V - V (+) - V T. ASAHII + + V V + V V V V V + (-) T. INKIN V (-) + + (-) V + (-) T. MUCOIDES (-) V T. SPP (-) + (-) + V V + + (-) V V + (-) + (-) V - - (+) V P. WICKERHAMII (2) (-) V

10 LEGENDA (1) C. albicans 2: corrisponde ai ceppi classificati precedentemente sotto la specie C. stellatoidea, riscontrati di rado. (2) P. wickerhamii: si tratta di un'alga unicellulare patogena, che cresce facilmente nei mezzi di isolamento dei lieviti e presenta un aspetto macroscopico simile a questi. All'esame microscopico, si osservano cellule rotonde che si dividono creando una compartimentazione interna. + : Test positivo per almeno il 99% dei ceppi - : Test negativo per almeno il 99% dei ceppi V : Test variabile +(-) : Test positivo per almeno il 95% dei ceppi o test a espressione lenta (48 h o 72 h) -(+) : Test negativo per almeno il 95% dei ceppi PI. : Pigmentazione AR. : Artrospore CA. : Capsula MY. : Micelio (ambiente P.C.B.) PS-MY. : Pseudomicelio (ambiente P.C.B.) CHL. : Clamidospore 37 C : Crescita a 37 C 72

11 c) Note 1- L'identificazione dei lieviti si basa sia sui caratteri biochimici determinati tramite la micropiastra AUXACOLOR 2 sia sui caratteri morfologici determinati preferibilmente in ambiente PCB o eventualmente in ambiente RAT. Per effettuare un'identificazione completa, è indispensabile disporre della totalità di questi dati. D'altro canto, per l'interpretazione dei risultati si dovranno prendere in considerazione l'origine dei prelievi e il contesto clinico. 2- Le specie Rhodotorula glutinis e Rhodotorula mucilaginosa sono indicate nella tabella di interpretazione dei risultati benché non ne siano precisati i profili numerici, data la variabilità di molti caratteri. Queste due specie sono caratterizzate da una pigmentazione rosa, rosa-salmone delle colonie, che spesso compare solo dopo 48 h di coltura. 3- Il lieviti del genere Cryptococcus formano una capsula che può presentarsi molto discreta. 4- Il lievito Kloeckera apiculata presenta una morfologia caratteristica che consente di distinguerla dalle specie con lo stesso codice: lievito dalla forma allungata e molto stretta, a gemmazione bipolare (simile a un limone). 5- Può rivelarsi utile fare ricorso a test supplementari per confermare l'identificazione di talune specie di lieviti o per distinguere specie con codici comuni: - il test di assimilazione del nitrato di potassio consente di distinguere lieviti come il Cryptococcus albidus (test +) e il Cryptococcus laurentii (test -) oppure la Rhodotorula mucilaginosa (test -) e la Rhodotorula glutinis (test +). - la ricerca di ureasi in ambiente indolo urea permette di confermare l'identificazione del genere Cryptococcus. Questo test è positivo in 4 h per il Cryptococcus neoformans e in 24 h per le altre specie. - la riduzione del tetrazolio consente di distinguere le specie Candida tropicalis (reazione positiva) e Candida lusitaniae (reazione negativa). 73

12 8- CARATTERISTICHE DEL TEST Il sistema AUXACOLOR 2 consente di identificare 31 specie di lieviti e una specie di alga unicellulare, la Prototheca wickerhamii. In confronto a AUXACOLOR mediante questo sistema sono identificate 7 nuove specie di lieviti: Candida ciferrii, Candida dubliniensis, Candida sake, Kloeckera apiculata, Trichosporon asahii, Trichosporon inkin, Trichosporon mucoides. Uno studio clinico prospettico e uno studio retrospettivo condotto su 120 ceppi rappresentativi delle specie identificate sul sistema AUXACOLOR 2 hanno dimostrato che: - Il 92,5% dei ceppi testati sono identificati in 48 h (il 59,2% in 24 h). Tale risultato si spiega con l'utilizzo di nuovi test nel sistema (test esosaminidasi e prolina arilamidasi) ma anche in virtù dell'arricchimento dell'elenco dei profili numerici per le specie riportate nel foglio illustrativo. - Il sistema AUXACOLOR 2 consente di distinguere la totalità dei ceppi di Candida dubliniensis (5 ceppi testati) e di Candida albicans (15 ceppi). - L'associazione del test prolina arilamidasi con il test fenolo ossidasi arricchisce la micropiastra di un test complementare utile all'identificazione dei ceppi di Candida glabrata (9 ceppi che si differenziano dalla Candida zeylanoides) o per distinguere le specie Candida krusei (6 ceppi) e Candida lipolytica (4 ceppi). - Il test POX ha consentito di rilevare l'attività fenolossidasica del Cryptococcus neoformans per i 4 ceppi testati. 9- LIMITI DEL TEST 1- Il sistema AUXACOLOR 2 consente di identificare le sole specie di lieviti indicate nella tabella di interpretazione. 2- Per le specie riportate, il database include solo i profili numerici riscontrati con maggiore frequenza. Un profilo numerico non indicato può corrispondere a un profilo raro di una specie catalogata o a una specie non catalogata. Fare riferimento alla tabella di interpretazione per completare le informazioni contenute nel database. 3- In via eccezionale, è possibile che specie rare, non catalogate nel foglio illustrativo, abbiano un profilo numerico identico a quello di specie catalogate. 74

13 4- La micropiastra AUXACOLOR 2 deve essere utilizzata solo con ceppi puri. Le associazioni di lieviti sono rilevate nel 16% dei prelievi. La coltura su CandiSelect 4 o PCB effettuata parallelamente al test su AUXACOLOR 2 permette di visualizzare le associazioni di lieviti. 5- In qualche caso, il mezzo di isolamento utilizzato può influenzare il viraggio di taluni test nelle 24 ore (xilosio, esosaminidasi) senza per questo mettere in discussione l'identificazione dei lieviti nelle 48 ore. 6- Test fenolo ossidasi / prolina arilamidasi : - ceppi rari di Cryptococcus neoformans possono non esprimere il carattere fenolo ossidasi. - alcuni ceppi di Geotrichum capitatum, Geotrichum candidum, Trichosporon spp e Cryptococcus laurentii possono produrre una colorazione grigio-marrone del pozzetto. In questo caso, la reazione è negativa e al momento della codifica, a questi pozzetti va attribuito il valore «zero». - Alcuni ceppi di Prototheca wickerhamii possono esprimere il carattere prolina arilamidasi. 7- I passaggi dal «positivo» verso il «negativo», cioè il cambiamento di colore di un pozzetto inizialmente interpretato «positivo» in «negativo» non devono essere presi in considerazione. Ad esempio, un pozzetto giallo dopo 24 o 48h che diventa verde o blu dopo 48 o 72h sarà considerato come positivo. 8- Viceversa, qualsiasi passaggio dal «negativo» verso il «positivo» nel corso delle prime 72h deve essere preso in considerazione: il pozzetto in questione deve essere considerato come positivo. Ad esempio, un pozzetto blu-grigio o bleu-verde dopo 24 o 48h che diventa giallo dopo 48 o 72h sarà considerato come positivo. 10- CONTROLLO DI QUALITÀ Le micropiastre AUXACOLOR 2 (R1) sono sottoposte a un controllo della qualità effettuato tramite un pannello di ceppi puri di cui sono noti i caratteri biochimici. 75

14 È d'altronde possibile effettuare un controllo dell'attività in laboratorio utilizzando i ceppi catalogati come segue: CEPPI NEG. GLU. MAL. SAC. GAL. LAC. RAF. INO. CEL. TRE. ADO. MEL. XYL. ARA. HEX. POX./PRO. C. NEOFORMANS ATCC V V - V V V T. MUCOIDES BCCM/IHEM C. LIPOLYTICA IP Caratteri osservati dopo 48 ore di incubazione di alcuni ceppi coltivati in terreno di Sabouraud. ATCC: American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA. BCCM / IHEM: Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms / IHEM Culture Collection, Scientific Institute of Public Health - Louis Pasteur, Mycology Section, Rue J. Wytsmanstraat 14, B-1050 Brussels. IP: Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, Paris cedex 15, France. 11- CONTROLLO QUALITÀ DEL FABBRICANTE Tutti i prodotti fabbricati e commercializzati dalla società Bio-Rad sono posti sotto un sistema di garanzia della qualità dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione dei prodotti finiti. Ogni lotto di prodotto finito è sottoposto a controllo qualità ed è commercializzato esclusivamente se è conforme ai criteri di accettazione. La documentazione relativa alla produzione e al controllo di ciascun lotto è conservata dalla nostra società. 1 V 76

15 Code (+) 05 Candida krusei Geotrichum capitatum (-) 01 Candida zeylanoides (-) 05 Candida lipolytica Candida norvegensis v 04 Candida inconspicua (-) 01 Candida zeylanoides (-) 05 Candida lipolytica (+) 21 Geotrichum candidum Kloeckera apiculata Candida norvegensis (-) 05 Candida lipolytica Candida norvegensis Candida glabrata (-) 01 Candida zeylanoides (-) 01 Candida zeylanoides (-) 01 Candida zeylanoides (-) 01 Candida zeylanoides (-) 01 Candida zeylanoides Geotrichum capitatum (-) 05 Candida lipolytica v 05 Candida rugosa v 05 Candida rugosa (-) 05 Candida lipolytica v 05 Candida rugosa v 05 Candida rugosa (+) 21 Geotrichum candidum v 05 Candida rugosa v 05 Candida rugosa (+) 21 Geotrichum candidum Prototheca wickerhamii (-) 01 Candida zeylanoides (-) 01 Candida zeylanoides (-) 01 Candida zeylanoides (-) 01 Candida zeylanoides Candida glabrata Prototheca wickerhamii Candida albicans Candida albicans 2 Code Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr 15

16 Code Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr Candida kefyr v 40 Cryptococcus uniguttulatus v 40 Cryptococcus uniguttulatus v 40 Cryptococcus uniguttulatus v 40 Cryptococcus uniguttulatus Saccharomyces cerevisiae v 01 Candida sake v 40 Cryptococcus uniguttulatus v 40 Cryptococcus uniguttulatus v 40 Cryptococcus uniguttulatus v 40 Cryptococcus uniguttulatus v 05 Candida lusitaniae v 40 Cryptococcus albidus v 40 Cryptococcus albidus v 01 Candida sake v 05 Candida lusitaniae v 40 Cryptococcus albidus v 40 Cryptococcus albidus Candida dubliniensis Candida dubliniensis Candida dubliniensis v 05 Candida parapsilosis v 05 Candida parapsilosis Candida albicans Candida albicans v 05 Candida parapsilosis v 05 Candida parapsilosis Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Code Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Saccharomyces cerevisiae Candida dubliniensis Candida dubliniensis v 05 Candida parapsilosis Candida dubliniensis Saccharomyces cerevisiae v 05 Candida parapsilosis v 01 Candida sake Candida dubliniensis v 05 Candida parapsilosis v 01 Candida sake Candida dubliniensis Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans v 05 Candida parapsilosis Candida albicans Candida albicans (+) 05 Candida tropicalis v 05 Candida parapsilosis v 01 Candida sake Candida albicans (+) 05 Candida tropicalis v 05 Candida parapsilosis v 01 Candida sake Candida albicans Candida albicans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Candida ciferrii v 40 Cryptococcus uniguttulatus v 40 Cryptococcus uniguttulatus Cryptococcus neoformans 16

17 Code Cryptococcus neoformans v 40 Cryptococcus uniguttulatus v 40 Cryptococcus uniguttulatus Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans v 05 Candida lusitaniae v 40 Cryptococcus albidus v 05 Candida lusitaniae (+) 05 Candida tropicalis v 05 Candida lusitaniae v 05 Candida lusitaniae v 01 Candida sake (+) 05 Candida tropicalis v 05 Candida lusitaniae v 40 Cryptococcus albidus Candida guilliermondii v 05 Candida lusitaniae v 01 Candida sake Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Trichosporon inkin Trichosporon inkin Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii Trichosporon asahii (+) 21 Trichosporon spp (+) 25 Trichosporon spp Trichosporon asahii (+) 21 Trichosporon spp Code (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp (+) 25 Trichosporon spp Trichosporon asahii v 05 Candida lusitaniae (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp Trichosporon asahii Trichosporon asahii (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp (+) 25 Trichosporon spp (+) 25 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae v 40 Cryptococcus albidus v 40 Cryptococcus albidus Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae v 40 Cryptococcus uniguttulatus v 40 Cryptococcus uniguttulatus v 40 Cryptococcus uniguttulatus v 40 Cryptococcus uniguttulatus v 40 Cryptococcus albidus v 40 Cryptococcus albidus v 40 Cryptococcus albidus v 40 Cryptococcus albidus v 40 Cryptococcus albidus Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans 17

18 Code Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans v 40 Cryptococcus albidus v 40 Cryptococcus albidus Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Candida ciferrii Candida ciferrii v 40 Cryptococcus uniguttulatus v 40 Cryptococcus uniguttulatus Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans v 40 Cryptococcus uniguttulatus v 40 Cryptococcus uniguttulatus Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans v 00 Candida famata Candida guilliermondii v 00 Candida famata v 00 Candida famata v 00 Candida famata Candida guilliermondii v 00 Candida famata Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Candida ciferrii Candida ciferrii v 40 Cryptococcus albidus Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans v 40 Cryptococcus albidus Code Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans v 40 Cryptococcus albidus v 40 Cryptococcus albidus v 40 Cryptococcus albidus v 40 Cryptococcus albidus v 40 Cryptococcus albidus v 40 Cryptococcus albidus v 00 Candida famata v 00 Candida famata v 00 Candida famata v 00 Candida famata (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp v 00 Candida famata (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp v 00 Candida famata (+) 21 Trichosporon spp v 00 Candida famata (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp (+) 21 Trichosporon spp v 40 Cryptococcus albidus Trichosporon mucoides Trichosporon mucoides Cryptococcus laurentii v 40 Cryptococcus albidus (+) 21 Trichosporon spp Trichosporon mucoides 18

19 12- BIBLIOGRAPHY 1. C.P. KURTZMAN, J.W. FELL The Yeasts. A taxonomic study, Fourth Revised and Enlarged Edition. Editions Elsevier BH COOPER, M. SILVA-HUNTER Yeasts of medical importance. Manual of clinical microbiology. Fourth edition. 1985, p H. KOENIG Guide de mycologie médicale. Editions Ellipses 1995, p H. FRICKER-HIDALGO, B. LEBEAU, P. KERVROEDAN, O. FAURE, P. AMBROISE-THOMAS, R. GRILLOT AUXACOLOR TM, a new commercial system for yeast identification: evaluation of 182 strains comparatively with ID 32C. Ann. Biol. Clin. (Paris). 1995; 53(4): H. FRICKER, D. MONGET, B. LEBEAU, M. BABOLAT, P. AMBROISE- THOMAS, R. GRILLOT Rapid identification of Candida albicans: evaluation of Rapidec albicans". Study of 444 yeast strains. Ann. Biol. Clin. (Paris). 1992; 50(2): D. SULLIVAN, D. COLEMAN Candida dubliniensis : characteristics and identification. J. Clin. Microbiol ; 36(2) : H.S.WANG, R.T. ZEIMIS, G.D. ROBERTS Evaluation of a caffeic acid-ferric citrate test for rapid identification of Cryptococcus neoformans. J. Clin. Microbiol. 1977; 6(5):

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