HDL-Cholesterol plus 3rd generation Colesterolo HDL plus, 3 a generazione
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1 HDL-Cholesterol plus 3rd generation Colesterolo HDL plus, 3 a generazione Informazioni per ordini COBAS 200 test Art. n Indica gli analizzatori su cui il cobas c pack può essere impiegato HDL-Cholesterol plus 3rd generation N. d ident Calibrator f.a.s. Lipids 3 1 ml Art. n COBAS Calibrator f.a.s. Lipids 3 1 ml Art. n (per gli USA) N. d ident Precinorm L 4 3 ml Art. n N. d ident Precipath HDL/LDL-C 4 3 ml Art. n N. d ident NaCl Diluent 9% 6 22 ml Art. n N. d ident /400 plus COBAS 700 COBAS 800 Informazioni relative al sistema COBAS HDL-Cholesterol plus 3rd generation (). Test : ID test sui sistemi COBAS 400/400 plus; ID test sui sistemi COBAS 700/800. Finalità d uso Test in vitro per la determinazione quantitativa della concentrazione di colesterolo HDL nel siero e nel plasma sui sistemi COBAS. Sommario Le HDL (High Density Lipoproteins) sono lipoproteine ad alta densità addette al trasporto inverso del colesterolo dalle cellule periferiche al fegato, dove esso viene trasformato in acidi biliari, i quali, a loro volta, vengono espulsi nell intestino attraverso le vie biliari. Il monitoraggio del colesterolo HDL nel siero è importante dal punto di vista clinico, dato che tra la concentrazione di colesterolo HDL ed il rischio di malattie aterosclerotiche sussiste una correlazione inversa. Concentrazioni elevate di colesterolo HDL hanno un effetto protettivo contro le cardiopatie coronariche, mentre la diminuzione della concentrazione di colesterolo HDL, soprattutto in associazione ad un aumento dei trigliceridi, comporta un aumento del rischio di malattie cardiovascolari. 1 Si sono sviluppate delle strategie per il trattamento delle malattie cardiovascolari aumentando i livelli di colesterolo HDL. 2,3 Sono disponibili vari metodi per la determinazione del colesterolo HDL, quali l ultracentrifugazione, l elettroforesi, l HPLC, i metodi a precipitazione ed i metodi diretti; quest ultimi vengono impiegati nella routine. Sono stati proposti vari metodi di determinazione diretta del colesterolo HDL nel siero, quali l impiego di particelle reattive magnetiche come le combinazioni polianioni/metallo, o l impiego di polietilenglicole (PEG) con anticorpi anti-apoproteina B e anti-apoproteina CIII. Il presente metodo automatizzato per la determinazione diretta del colesterolo HDL nel siero e nel plasma utilizza enzimi modificati con PEG e solfato di destrano. La colesterolo esterasi e la colesterolo ossidasi modificate dal PEG risultano possedere attività catalitiche selettive rispetto alle frazioni lipoproteiche, con una reattività crescente nella seguente sequenza: LDL < VLDL chilomicroni < HDL. 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 I risultati dei campioni prelevati non a digiuno sono leggermente inferiori a quelli dei campioni prelevati a digiuno. Risultati paragonabili, ottenuti con campioni prelevati non a digiuno, sono stati osservati impiegando il metodo di beta-quantificazione. 17,18,19 La determinazione diretta del colesterolo HDL di Roche è conforme agli obiettivi, stabiliti nel 1998 dal National Institute of Health (NIH) e dal National Cholesterol Education Program (NCEP), per una performance accettabile. 20 I risultati di questo metodo sono in buona correlazione con quelli ottenuti con i metodi a precipitazione e anche con l analisi impiegando l ultracentrifugazione. La cassetta COBAS HDL-Cholesterol plus 3rd generation è stata realizzata per la determinazione diretta e specifica del colesterolo HDL in presenza di LDL, VLDL e chilomicroni. Non occorre pretrattare i campioni. Principio del test 4,5 Test enzimatico colorimetrico omogeneo. In presenza di ioni di magnesio e di solfato di destrano vengono formati complessi idrosolubili con LDL, VLDL e chilomicroni, resistenti agli enzimi modificati con PEG. La concentrazione di colesterolo HDL viene determinata enzimaticamente con la colesterolo esterasi e la colesterolo ossidasi associate a PEG negli aminogruppi (ca. 40%). Gli esteri del colesterolo vengono separati quantitativamente mediante l azione della colesterolo esterasi in colesterolo libero e acidi grassi. In presenza di ossigeno, il colesterolo viene ossidato dalla colesterolo ossidasi a Δ4-colestenone e perossido d idrogeno. Esteri del colesterolo HDL + H 2 O PEG-colesterolo esterasi colesterolo HDL + RCOOH PEG-colesterolo ossidasi Colesterolo HDL + O 2 Δ4-colestenone + H 2 O 2 2 H 2 O amminoantipirina + HSDA a + H + + H 2 O perossidasi a) Sodio N-(2-idrossi-3-solfopropil)-3,5-dimetossianilina pigmento blu-violetto + 5 H 2 O , V 3 IT 1 / 5
2 Substrati L intensità di colore del colorante blu chinonimmina formatosi è direttamente proporzionale alla concentrazione di colesterolo HDL. Viene determinata misurando l aumento dell assorbanza a 583 nm. Reattivi soluzioni pronte all uso Componenti Concentrazioni R1 R2 (SR) Test HEPES b 10,07 10,07 9,61 mmol/l CHES c 96,95 69,40 mmol/l Solfato di destrano 1,5 1,07 g/l Nitrato di magnesio 6 H 2 O 11,7 8,4 mmol/l HSDA 0,96 0,69 mmol/l AOD (ricombinante) µkat/l POD (rafano) 16, µkat/l CE (microbica) 3,33 0,8 µkat/l CHOD (microbica) µkat/l 4-Amminoantipirina 2,46 0,59 mmol/l ph 7,4 7,0 7,4 b) acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazina-etansolfonico c) acido 2-(N-cicloesilamino)-etansolfonico Entrambi i reagenti contengono stabilizzatori e un conservante. Precauzioni e avvertenze Leggere attentamente tutte le precauzioni e avvertenze elencate in questa Raccolta metodiche, nel Capitolo 1, Introduzione. Utilizzo dei reattivi Pronti all uso. La colorazione rosa del reattivo di colesterolo non interferisce con il test. Conservazione e stabilità Stabilità a 2 8 C Vedere la data di scadenza indicata sull etichetta del contenitore portareagenti cobas c pack. Sistemi COBAS 400/400 plus in uso sullo strumento a C 12 settimane Sistemi COBAS 700/800 in uso sullo strumento a 8 C 12 settimane Prelievo e preparazione dei campioni Per il prelievo e la preparazione dei campioni impiegare solo provette o contenitori da raccolta adatti. Solo i tipi di campione elencati di seguito sono stati testati e risultano accettabili. Siero. Plasma: plasma con K 3 -EDTA, litio/nh + 4 /sodio eparina. Il plasma con EDTA provoca risultati diminuiti. 21 (Vedere la nota contenuta nella sezione relativa alle linee guida dell NCEP.) Si possono utilizzare campioni prelevati da soggetti a digiuno e non a digiuno. 18 I tipi di campione elencati sono stati testati impiegando una selezione di provette per il prelievo di campioni disponibili in commercio al momento dell analisi; non sono, quindi, state testate tutte le provette disponibili di tutte le case produttrici. Alcuni sistemi per il prelievo di campioni di vari produttori possono contenere diversi materiali e in alcuni casi possono interferire sui risultati del test. Quando si trattano i campioni in provette primarie (sistemi per il prelievo di campioni), seguire le istruzioni del produttore delle provette. Stabilità: 19 7 giorni a 2 8 C 30 giorni a 70 C È stato riportato che l EDTA stabilizza le lipoproteine. 22 I campioni contenenti precipitati devono essere centrifugati prima dell esecuzione del test. Materiali a disposizione Per i reattivi, vedere la sezione Reattivi soluzioni pronte all uso. Materiali necessari (ma non forniti) NaCl al 9% (soluzione salina isotonica concentrata 10 volte) per la postdiluizione automatica del campione. Utilizzare l NaCl Diluent 9%, Art. n , N. d ident , o preparare la soluzione di NaCl al 9% con compresse di cloruro di sodio o soluzioni saline concentrate disponibili in commercio. La soluzione di NaCl viene collocata nella sua posizione predefinita sul rack ed è stabile per 28 giorni a bordo degli analizzatori COBAS 400/400 plus/700/800. Esecuzione Per una performance ottimale del test, attenersi alle indicazioni riportate nel presente documento per l analizzatore in questione. Per le istruzioni specifiche dell analizzatore relative all esecuzione del test, consultare il manuale d uso dello strumento. Applicazione per il siero ed il plasma Definizione del test per COBAS 400/400 plus Modo di misura Assorbanza Modo di calcolo delle ass. Punto finale Modo di reazione R1-S-SR Andamento della reazione Incremento Lunghezza d onda A/B 583/659 nm Calc. primo/ultimo 33/69 Unità di misura mmol/l Parametri di pipettamento Diluente (H 2 O) R1 150 µl Campione 2,5 µl 7,0 µl SR 50 µl Volume totale 209,5 µl Definizione del test per COBAS 700/800 Modo di misura Assorbanza Modo di calcolo delle ass. Punto finale Modo di reazione R1-S-SR Andamento della reazione Incremento Lunghezza d onda A/B 583/659 nm Calc. primo/ultimo 44/98 Unità di misura mmol/l Parametri di pipettamento Diluente (H 2 O) R1 150 µl Campione 2,5 µl 7,0 µl SR 50 µl Volume totale 209,5 µl 2 / , V 3 IT
3 Substrati Calibrazione Calibratore Tipo di calibrazione Replicato di calibrazione Intervallo di calibrazione C.f.a.s. Lipids Utilizzare acqua deionizzata come calibratore zero. Regressione lineare Raccomandato in duplicato Ogni lotto e se richiesto dai procedimenti del controllo di qualità Tracciabilità: 19 Questo metodo è stato standardizzato contro il metodo di riferimento CDC designato (metodo di confronto definito). 20 Tale standardizzazione è conforme ai requisiti del HDL Cholesterol Method Evaluation Protocol for Manufacturers del US National Reference System for Cholesterol, CRMLN (Cholesterol Reference Method Laboratory Network), stabiliti nel novembre Controllo di qualità Intervallo di riferimento Intervallo patologico Intervallo di controllo Sequenza di controllo Controllo dopo calibrazione Precinorm L Precipath HDL/LDL-C Raccomandato ogni 24 ore Definita dall utente Raccomandato Per il controllo di qualità, impiegare i materiali di controllo indicati nella sezione Informazioni per ordini. In aggiunta, è possibile utilizzare altro materiale di controllo appropriato. Gli intervalli e limiti di controllo dovranno essere conformi alle esigenze individuali di ogni laboratorio. I valori ottenuti devono rientrare nei limiti definiti. Ogni laboratorio deve definire delle misure correttive da attuare nel caso che alcuni valori siano al di fuori dei limiti. I materiali per il controllo di qualità devono essere usati solo per monitorare l accuratezza e la precisione. Il Laboratory Standardization Panel (LSP Panel di standardizzazione di laboratorio) del National Cholesterol Education Program negli Stati Uniti raccomanda due livelli di controlli, uno compreso nell intervallo normale (0,9 1,7 mmol/l oppure mg/dl) e uno prossimo alla concentrazione stabilita per l operatività (<0,9 mmol/l oppure <35 mg/dl). Calcolo Gli analizzatori COBAS effettuano il calcolo automatico della concentrazione dell analita di ogni campione. Per ulteriori informazioni, consultare il Capitolo 7, Analisi dei dati, Manuale d uso (analizzatore COBAS 700), o l Analisi dei dati nell Aiuto in linea (analizzatori COBAS 400/400 plus/800). Fattori di conversione: mmol/l x 38,66 = mg/dl mg/dl x 0,0259 = mmol/l Limiti del metodo interferenze 19,23,24 Valutazione: recupero entro ±10% del valore iniziale. Siero, plasma Ittero Emolisi Lipemia (Intralipid) Farmaci Altro Nessuna interferenza significativa fino ad un indice I di 47 per bilirubina coniugata d e di 60 per bilirubina non coniugata e (concentrazione di bilirubina coniugata: ca. 47 mg/dl oppure 804 µmol/l; concentrazione di bilirubina non coniugata: ca. 60 mg/dl oppure 1026 µmol/l). Queste indicazioni sono basate sul modello di Glick. Si prega di fare riferimento agli ulteriori commenti riportati di seguito (relativi alla funzionalità patologica del fegato). Nessuna interferenza significativa fino ad un indice H di 1200 f (concentrazione di emoglobina: ca mg/dl, 12 g/l oppure 745 µmol/l). Nessuna interferenza significativa fino ad un indice L di g Nessuna interferenza significativa da trigliceridi nativi fino a 1200 mg/dl (13,7 mmol/l). Non esiste una buona correlazione tra l indice L (corrisponde alla torbidità) e la concentrazione di trigliceridi. L indicazione relativa all interferenza da lipemia è basata sul modello di Glick, 23 che impiega Intralipid come substrato artificiale. Finora non è a disposizione alcun modello che imiti un interferenza da trigliceridi, poiché i livelli dei trigliceridi mostrano, nei campioni prelevati dai pazienti, un comportamento imprevedibile, a seconda della natura degli acidi grassi esterificati presenti nei campioni. I campioni prelevati dai pazienti con valori di trigliceridi elevati sono molto spesso lipemici. Gli utilizzatori non possono quindi verificare le interferenze da trigliceridi nei campioni prelevati dai pazienti. Non si è osservata alcuna interferenza a concentrazioni terapeutiche impiegando le più comuni famiglie di farmaci. 25,26 Concentrazioni elevate di acidi grassi liberi e di proteine denaturate possono provocare risultati di colesterolo HDL falsamente elevati. L acido ascorbico fino a 50 mg/dl (2,84 mmol/l) non interferisce nel test. In casi molto rari, la gammapatia, particolarmente di tipo IgM (macroglobulinemia di Waldenström), può provocare risultati inaffidabili. Una funzionalità patologica del fegato influisce sul metabolismo lipidico; di conseguenza, i risultati di HDL e di LDL hanno un valore diagnostico ridotto. In alcuni pazienti con una funzionalità patologica del fegato, i risultati del test HDL-C plus 3rd generation possono presentare una deviazione significativa rispetto a quelli ottenuti con metodi di riferimento riconosciuti quali l ultracentrifugazione o il DCM (designated comparison method metodo di confronto definito). d) Misurato a concentrazioni di HDL-C fino a 1,09 mmol/l (42,1 mg/dl). e) Misurato a concentrazioni di HDL-C fino a 1,14 mmol/l (44,1 mg/dl). f) Misurato a concentrazioni di HDL-C fino a 1,42 mmol/l (54,9 mg/dl). g) Misurato a concentrazioni di HDL-C fino a 0,90 mmol/l (34,8 mg/dl) , V 3 IT 3 / 5
4 Substrati Necessità di specifiche fasi di lavaggio È necessario effettuare specifiche fasi di lavaggio se certe combinazioni di test vengono eseguite insieme sugli analizzatori COBAS. Per informazioni relative alle combinazioni di test che richiedono cicli di lavaggio extra, consultare questa Raccolta metodiche, Introduzione, Cicli di lavaggio extra. Ai fini diagnostici, i risultati devono sempre essere valutati congiuntamente con la storia clinica del paziente, con gli esami clinici e con altre evidenze cliniche. Intervallo di misura 0,08 3,10 mmol/l (3 120 mg/dl) Determinare i campioni con concentrazioni più alte mediante la funzione rerun. La diluizione dei campioni mediante la funzione rerun avviene nel rapporto 1:4. I risultati ottenuti con i campioni diluiti mediante la funzione rerun vengono automaticamente moltiplicati per il fattore 4*. * Non è permesso l uso di un fattore di diluizione inferiore a 4. Limite di sensibilità inferiore 0,08 mmol/l (3 mg/dl) Il limite di sensibilità inferiore rappresenta la minima concentrazione misurabile dell analita che può essere distinta dallo zero. Viene calcolato come il valore che si trova 3 deviazioni standard al di sopra di quello del campione zero (campione zero + 3 DS, precisione nella serie, n = 21). Valori di riferimento Uomini 27,28,29 Nessun rischio Rischio moderato Alto rischio mg/dl > <35 mmol/l >1,45 0,90 1,45 <0,90 Donne 27,28,29 mg/dl > <45 mmol/l >1,68 1,15 1,68 <1,15 Dati specifici sulla performance del test Qui di seguito sono riportati i dati rappresentativi delle prestazioni sugli analizzatori COBAS. I risultati dei singoli laboratori possono differire da questi. Questo procedimento è stato certificato dal Cholesterol Reference Method Laboratory Network. Precisione La riproducibilità è stata determinata usando campioni umani e controlli, eseguiti in base ad un protocollo interno (nella serie: n = 21, fra le serie: n = 21), con i seguenti risultati: Livello 1 Livello 2 Media 0,90 mmol/l 2,8 mmol/l (34,8 mg/dl) (108 mg/dl) CV nella serie 1,13% 0,44% Media 0,80 mmol/l 1,6 mmol/l (30,9 mg/dl) (61,9 mg/dl) CV fra le serie 1,0% 0,7% Confronto tra metodi I valori di colesterolo HDL ottenuti per campioni di siero e di plasma umani su un analizzatore COBAS 800 con il reagente COBAS HDL-Cholesterol plus 3rd generation sono stati confrontati con quelli determinati con lo stesso reagente su un analizzatore Roche/Hitachi 917. Analizzatore Roche/Hitachi 917 Dim. (n) del campione = 55 Passing/Bablok 31 Regressione lineare y = 0,9836x 0,0475 mmol/l y = 0,9859x 0,0463 mmol/l τ = 0,9710 r = 0,9985 DS (md 95) = 0,038 Sy.x = 0,019 I valori erano compresi tra 0,19 e 2,48 mmol/l (tra 7,35 e 95,9 mg/dl). Linee guida del National Cholesterol Education Program (NCEP) 30 <40 mg/dl (1,04 mmol/l): colesterolo HDL basso (fattore di rischio principale per CHD) 60 mg/dl (1,55 mmol/l): colesterolo HDL alto (fattore di rischio negativo per CHD) Il colesterolo HDL viene influenzato da vari fattori, ad es. fumo, esercizio fisico, ormoni, sesso ed età. Ogni laboratorio deve controllare l applicabilità dei valori di riferimento alla propria popolazione di pazienti e, se necessario, determinare intervalli di riferimento propri. Le linee guida del National Cholesterol Education Program (NCEP, Programma nazionale per l educazione al colesterolo) si basano sui valori nel siero; per classificare i pazienti si devono impiegare i valori nel siero o valori equivalenti. Perciò l NCEP raccomanda un fattore di 1,03 per convertire i valori ottenuti nel plasma con EDTA in valori sierici. Tuttavia, le nostre ricerche hanno rivelato che per il reagente COBAS HDL-C plus 3rd generation occorre impiegare un fattore di 1,06. Per adeguarsi all obiettivo dell NCEP, stabilito nel 1998, di una deviazione inferiore al 5%, si raccomanda che ogni laboratorio validi questo fattore di conversione e lo introduca nei parametri test-specifici per il test HDL-C plus 3rd generation. 4 / , V 3 IT
5 Substrati Letteratura 1. Dominiczak M, McNamara J. The system of Cardiovascular prevention ; Nauk M, Wiebe D, Warnick G. Measurement of High-Density-Lipoprotein Cholesterol In: Handbook of Lipoprotein Testing (eds. Rifai, Warnick and Dominiczak), 2 a edizione. 2. Linsel-Nitschke P et al. HDL as a target in the treatment of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature Reviews 2005;4: Ng DS. Treating low HDL From bench to bedside. Clinical Biochemistry 2004;37: Sugiuchi H, Uji Y, Okabe H, Irie T et al. Direct Measurement of High-Density Lipoprotein Cholesterol in Serum with Polyethylene Glycol-Modified Enzymes and Sulfated α-cyclodextrin. Clin Chem 1995;41: Matsuzaki Y, Kawaguchi E, Morita Y et al. Evaluation of Two Kinds of Reagents for Direct Determination of HDL-Cholesterol. J Anal Bio-Sc 1996;19: Nauck M, März W, Jarausch J et al. Multicenter evaluation of a homogeneous assay for HDL-cholesterol without sample pretreatment. Clin Chem 1997;43: Zawta B, Klüber J. Fascicolo Wissenswertes zu Apolipoproteinen. Fragen/Antworten (Boehringer Mannheim 1991). 8. AVP Fettstoffwechselstörungen, Therapieempfehlungen 1, 1 a ed. 1996: Hatch FT, Lees RS. Practical methods for plasma lipoprotein analysis. Adv Lipid Res 1968;6: Narayan KA, Kummerow FA. Disk electrophoresis of human serum lipoprotein. Nature 1965;205: Okazaki M, Shiraishi K, Ohno Y et al. Heterogeneity of human high density lipoproteins on high performance liquid chromatography. J Biochem 1982;92: Burstein M, Scholnick HR, Morfix R. Rapid method for the isolation of lipoproteins from human serum by precipitation with polyanions. J Lipid Res 1970;11: Musto J, Lawlor JF. HDL-cholesterol: online separation and analysis utilizing an automated chemistry analyzer [Abstract]. Clin Chem 1993;39: Kakuyama T, Kimura S, Hashiguchi Y. Fully automated determination of HDL-cholesterol from human serum with Hitachi 911 [Abstract]. Clin Chem 1994;40: Harris N, Galpchian V, Rifai N. Three routine methods for measuring high-density lipoprotein cholesterol compared with the Reference method. Clin Chem 1996; 42: Sugiuchi H. History of development and technical details of the homogeneous assay for HDL and LDL cholesterol. The Fats of Life 2005;IX No. 1: Cohn JS, McNamara JR, Schaefer EJ. Lipoprotein Cholesterol Concentrations in the Plasma of Human Subjects as Measured in the Fed and Fasted States. Clin Chem 1988;34: Pisani T, Gebski CP, Leary ET et al. Accurate Direct Determination of Low-Density Lipopotein Cholesterol Using an Immunoseparation Reagent and Enzymatic Cholesterol Assay. Arch Pathol Lab Med 1995;119: Documentazione Roche Diagnostics. 20. Kimberly M, Leary E, Cole T, Waymack P. Selection, Validation, Standardization and Performance of a Designated Comparison Method for HDL-Cholesterol for Use in the Cholesterol Reference Method Laboratory Network. Clin Chem 1999;45: Tietz. Textbook of Clinical Chemistry, 3 a edizione 1999; Cooper GR, Myers GL, Smith SJ, Sampson EJ. Standardization of Lipid, Lipoprotein, and Apolipoprotein Measurements. Clin Chem 1988; 34/8B:B Glick MR, Ryder KW, Jackson SA. Graphical Comparisons of Interferences in Clinical Chemistry Instrumentation. Clin Chem 1986;32: Kadri N, Douville P, Lachance P. Letter to editor. Clin Chem 2002;48: Report on the Symposium Drug effects in clinical chemistry methods, Breuer J, Eur J Clin Chem Clin Biochem 1996;34: Sonntag O, Scholer A. Drug interference in clinical chemistry: recommendation of drugs and their concentrations to be used in drug interference studies. Ann Clin Biochem 2001;38: Thomas L, ed. Labor und Diagnose, 4 a ed. Marburg: Die Medizinische Verlagsgesellschaft, 1992: Assmann G. At what levels of total low- or high-density lipoprotein cholesterol should diet/drug therapy be initiated? European guidelines. Amer J Cardiol 1990;65:11F. 29. Assmann G, Schriewer H, Schmitz G et al. Quantification of high-density lipoprotein cholesterol by precipitation with phosphotungstic acid/mgcl 2. Clin Chem 1983;29: Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III). NIH Publication No ; maggio Bablok W et al. A General Regression Procedure for Method Transformation. J Clin Chem Clin Biochem 1988;26: Le aggiunte o modifiche significative sono indicate mediante una linea verticale posizionata in margine Roche Diagnostics Roche Diagnostics GmbH, D Mannheim , V 3 IT 5 / 5
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