RISCHIO RESIDUO DI PATOLOGIA CROMOSOMICA DOPO TEST PRENATALE NON INVASIVO (NIPT) PER LE ANEUPLOIDIE FETALI SU PLASMA MATERNO:

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1 RISCHIO RESIDUO DI PATOLOGIA CROMOSOMICA DOPO TEST PRENATALE NON INVASIVO (NIPT) PER LE ANEUPLOIDIE FETALI SU PLASMA MATERNO: valutazione da un esperienza di diagnosi prenatali del primo e del secondo trimestre Francesca Romana Grati1, Jose Carlos Pinto B. Ferreira2, Beatrice Grimi1, Komal Bajaj2, Francesca Malvestiti1, Livia Marcato1, Silvia Paganini1, Elisa Gaetani1, Lorenza Martinoni1, Federico Maggi1, Giuseppe Simoni1, Susan Gross2, DISCLOSURE TOMA partecipa ad un progetto di ricerca su NIPT insieme a European Commission, Joint Research Centre (JRC) Institute for Health and Consumer Protection

2 LA DIAGNOSI PRENATALE E GLI SCREENING PRENATALI La diagnosi prenatale delle anomalie cromosomiche si ottiene mediante l analisi del CVS o del AF amniocentesi e villocentesi comportano un rischio di complicanze cliniche e di perdita fetale (1/200 1/1600 rischio aggiuntivo) (Tabor and Alfirevic, 2010; Eddleman et al, 2006)

3 LA DIAGNOSI PRENATALE E GLI SCREENING PRENATALI Diagnosi cromosomica in caso di rischio aumentato Rischio personalizzato per alcune aneuploidie fetali tramite analisi di screening Combined Quad Slide: courtesy of Howard Cuckle Gestational age

4 LA DIAGNOSI PRENATALE E GLI SCREENING PRENATALI Test prenatali non invasivi mediante sequenziamento parallelo massivo (NIPT-MPS) di molecole circolanti di DNA libero fetale (cffdna) nel plasma materno hanno mostrato essere altamente sensibili per il riconoscimento di alcune aneuploidie fetali (Chiu et al, 2011; Ehrich et al, 2011; Palomaki et al, 2011; Palomaki et al, 2012; Bianchi et al, 2012; Sparks et al,2012; Ashoor et al, 2012; Norton et al, 2012) DNA FETALE LIBERO CIRCOLANTE (cffdna) DNA MATERNO

5 TEST PRENATALI NON INVASIVI SU PLASMA MATERNO (NIPT) STUDIES DR FPR T21 Test Failed No classification T18 DR FPR Test Failed No classification T13 DR FPR Test Failed No classification Chiu et al., 2011 (2-plex) Ehrich et al., 2011 Palomaki et al., 2011 Bianchi et al., 2012 Sparks et al, 2012 Ashoor et al., 2012 Norton et al, 2012 COMBINED 86/86 (100%) 39/39 (100%) 209/212 (98.6%) 89/89 (100%) 36/36 (100%) 50/50 (100%) 81/81 (100%) 590/593 (99.5%) 3/146 (2.1%) 1/410 (0.2%) 3/1471 (0.2%) 0/404 (0.0%) 0/123 (0,0%) 0/297 (0.0%) 3/2888 (0,03%) 11/5739 (0.2%) 11/764 (1.4%) 18/467 (3.9%) 13/1686 (0.8%) 16/532 (3.0%) 8/338 (2.4%) 3/400 (0.8) 148/3228 (4.6) 217/7415 (2.9%) 7/503 (1.4%) 7/503 (1.4%) 59/59 (100%) 5/1688 (0.3%) 17/1988 (0.9%) 35/36 5/ /532 (97.2%) (0.3%) (3.0%) 8/8 1/123 (100%) (0.8%) 8/338 (2.4%) 49/50 (98.0%) 0/297 (0%) 3/400 (0.8%) 37/38 3/ /3228 (97.4%) (0.1%) (4.6%) 188/191 10/ /6486 (98.4%) (0.2%) (3.0%) 5/502 (1.0%) 5/502 (1.0%) 11/12 (91.7%) 11/14 (78.6%) 22/26 (84.6%) 16/1688 (0.9%) 3/488 (0.6%) 19/2176 (0.9%) 17/1988 (0.9%) 16/532 (3.0%) 33/2520 (1.3%) 2/502 (0.4%) 2/502 (0.4%) Nessuno degli studi dimostra la possibilità di escludere con certezza risultati falsi positivi o falsi negativi occasionali (Benn et al., 2012): non è un test diagnostico e non sostituisce la diagnosi prenatale su AF e CVS No dati su gravidanze gemellari discordanti per trisomia e sui vanishing twins No dati sui mosaici e, in particolare, sui CPM Tassi di fallimento ancora elevati Protocolli NIPT sono attendibili solo per T18 e T21 in donne ad alto rischio (dopo test di screening)

6 RILEVANZA DELLA SINDROME DI DOWN La sindrome di Down è la patologia clinicamente più frequente e significativa associata ad anomalie cromosomiche presenti alla nascita ed è pertanto il principale interesse dei test prenatali. Tuttavia i test diagnostici invasivi attualmente in uso permettono anche di identificare un'ampia gamma di altre anomalie citogenetiche clinicamente significative nell ambito della quale la trisomia 21 rappresenta il 30-60% di essa. Intermediate T21 Mild outcome T18 & T13 Serious outcome Grati et al, AJMG 2010

7 VANTAGGI E SVANTAGGI DEI NIPT Proposta di eseguire i NIPT come test di primo livello anche in sostituzione di test invasivi e anche per le gestanti che sono candidate al cariotipo prenatale (ASHG, 6-10 Novembre 2012, Bombard et al, oral communication), ha come vantaggio principale la drastica riduzione del numero di esami invasivi Il vantaggio della riduzione del numero dei test invasivi è stato ampiamente divulgato dai laboratori che offrono il test Gli svantaggi e una stima precisa del rischio residuo per tutte le anomalie cromosomiche rilevabili e clinicamente significative è quello che vogliamo aggiungere alla discussione con la paziente, al fine di fornire una informazione equilibrata

8 SCOPO DELLO STUDIO Calcolare l effettiva DR dei NIPT e l effettivo rischio residuo (RR) per anomalie cromosomiche clinicamente rilevanti in relazione al totale delle anomalie cromosomiche clinicamente rilevanti Calcolare l aumento di sensibilità dei NIPT rispetto ai MSS come test di primo livello nelle donne con AMA e ansietà

9 METODI audit retrospettivo di diagnosi prenatali citogenetiche del primo e del secondo trimestre effettuate dal laboratorio TOMA ( ) estrapolazione dei risultati citogenetici inerenti le sole gestanti con indicazione AMA (96.000) e ansietà (33.500) Classificazione dei cariotipi anormali in classi di rischio ed entità dell outcome clinico (Grati et al, 2010) High Risk group (HR) rischio elevato o fenotipo fetale patologico severo (an abnormal outcome expected in most of these cases) - T21, 18, 13-45,X - 69,XXX/XXY/XYY - Autosomal aneuploidies other than T21,18,13 - Complex unbalanced karyotypes - De novo non-sat and sat SMC containing euchromatic material (47,+mar) - Unbal. structural rearr. - TFM (autosome aneuploidy and 45,X cell line >30%) Intermediate (low to high) Risk group (IR) rischio intermedio o con un fenotipo fetale patologico moderato (adverse outcome in some cases, but the precise risks are difficult to assign without further information) - De novo inversions - De novo apparently balanced reciprocal translocations (DNABRT) - mos46/45,x (45,X cell line <30%) Low Risk group (LR) senza o con effetto fenotipico lieve o associati ad un rischio trascurabile di fenotipo fetale patologico (background risk ~3%) - De novo and familial Robs, - Inherited or de novo sat. SMC without euchromatic material - Structural bal. rearr. inherited from a normal parent - Homogeneous and mosaic sex chr. anomalies other than 45,X or mos46/45,x (i.e.: 47,XXX, 47,XXY, 47,XYY, X-Y dicentric chromosomes).

10 RISCHIO PERSONALE A PRIORI DI ANOMALIE CROMOSOMICHE HR+IR HR+IR indagabili da NIPT e MSS (T21,18,13,triploids,MX) Ricalcolabile post-test (rischio residuo per T21,18,13,triploids,MX) HR+IR NON indagabili da NIPT e MSS (rischio basale) RISCHIO RESIDUO TOTALE POST-TEST

11 CALCOLO DELLA DR EFFETTIVA E DEL RISCHIO RESIDUO TOTALE PER HR+IR DOPO MSS E NIPT IN RELAZIONE ALLA CROMOSOMOPATIA CLINICAMENTE SIGNIFICATIVA Effective DR of MSS (Grati et al, 2010) and NIPT for HR+IR chromosome abnormalities: %Σdetectable (comb2)= [(n T21 obs. cases x 85/100)+(n T18 obs. cases x 82/100)+(n OA obs. cases x 76/100)/n total abnormal cases]x100; %Σdetectable (quad)= [(n T21 obs. cases x 83/100)+(n T18 obs. cases x 100/100)+(n OA obs. cases x 44/100)/n total abnormal cases]x100 %Σdetectable (NIPT)= [(n T21 obs. cases x 100/100)+(n T18 obs. cases x 100/100)+(n T13 obs. cases x 92/100)+(n MX obs. cases x 94/100)/n total abnormal cases]x100; Total RR after MSS (Grati et al, 2010) and NIPT for HR+IR chromosome abnormalities: + ΣObserved HR+IR - Σdetectable by NIPT/MSS HR+IR n total HR+IR Conferma anche tramite calcolo Bayesano partendo dal rischio a priori (incidenza di T21,18,13,triploids,MX in relazione alla cromosomopatia fetale clinicamente significativa) e dalla specificità dei test (MSS 95%, NIPT 99.7%)

12 CONFRONTO DELLA DETECTION RATE DELLE ANOMALIE CROMOSOMICHE HR+IR TRA MSS E NIPT COME TEST DI SCREENING DI PRIMO LIVELLO Calcolo della OR = Odds ratio per la valutazione del miglioramento della detection rate dei NIPT rispetto ai test di screening biochimici nel rilevamento delle anomalie cromosomiche HR+IR % CI OR interseca il valore 1: l assenza di un miglioramento statisticamente significativo della dr 95% CI OR non interseca il valore 1 ed è >1: presenza di un miglioramento statisticamente significativo della dr

13 RISULTATI CVS E CALCOLO DEL RISCHIO BASALE (n=42246; <35y=8458; 35y=33788) CHROMOSOMAL ABNORMALITY IN CV TYPE <35Y Relative freq. (%) 35Y Relative freq. (%) Trisomy 21 (T21) 27 31, ,85 Trisomy 18 (T18) 6 6, ,56 Trisomy 13 (T13) 5~53% 5,75 38~79% 5,05 Monosomy X (45,X) 6 6, ,46 Triploidy 2 2, ,66 HR Autosomal aneuploidies other than T21, T18, T13 1 1, ,86 Complex unbalanced karyotypes 0 0,00 2 0,27 Non-satellited and satellited de novo SMC containing euchromatic material 2 2,30 6 0,80 Unbalanced structural rearrangements 4 4, ,39 True Fetal Mosaicism (TFM) (autosomes and mos46/45,x >30%) 12 13, ,24 De Novo Inversion 10 11,49 8 1,06 Apparently balanced de novo reciprocal translocation IR 10 11, ,72 TFM 46/45,X (45,X<30%) 2 2,30 8 1,06 Familial Robertsonian translocation De novo Robertsonian translocation 3 12 Inherited Inversion LR Inherited and satellited de novo SMC without euchromatic material 0 10 Apparently balanced familial reciprocal translocation 5 38 Sex chr anormalies other than 45,X (mosaic and homogeneous) TOTAL ANALYSED CASES N OF HR+IR KARYOTYPES FREQUENCY OF HR+IR KARYOTYPES (%) 1,03 2,23 Rischio Basale per MSS/NIPT 1/206 MSS 1/197 NIPT 1/210 MSS 1/187 NIPT

14 RISULTATI AF E CALCOLO DEL RISCHIO BASALE (n=93043; <35y=25454; 35y=62255) CHROMOSOMAL ABNORMALITY IN AF TYPE <35Y Relative freq. (%) 35Y Relative freq. (%) Trisomy 21 (T21) 55 36, ,74 Trisomy 18 (T18) 5 3, ,31 Trisomy 13 (T13) 5 ~48% 3,31 31~77% 3,17 Monosomy X (45,X) 7 4, ,23 Triploidy 0 0,00 3 0,31 HR Autosomal aneuploidies other than T21, T18, T13 1 0,66 4 0,41 Complex unbalanced karyotypes 1 0,66 5 0,51 Non-satellited and satellited de novo SMC containing euchromatic material 2 1, ,54 Unbalanced structural rearrangements 27 17, ,89 True Fetal Mosaicism (TFM) (autosomes and mos46/45,x >30%) 32 21, ,77 De Novo Inversion 6 3, ,33 Apparently balanced de novo reciprocal translocation IR 9 5, ,46 TFM 46/45,X (45,X<30%) 1 0, ,33 Familial Robertsonian translocation De novo Robertsonian translocation 6 21 Inherited Inversion Inherited and satellited de novo SMC without euchromatic material LR 3 15 Apparently balanced familial reciprocal translocation Sex chr anormalies other than 45,X (mosaic and homogeneous) TOTAL ANALYSED CASES N OF HR+IR KARYOTYPES FREQUENCY OF HR+IR KARYOTYPES (%) 0,59 1,57 Rischio Basale per MSS/NIPT 1/322 MSS 1/322 NIPT 1/274 MSS 1/271 NIPT

15 CALCOLO DELLA DR EFFETTIVA E DEL RISCHIO RESIDUO TOTALE POST-TEST PER HR+IR DOPO MSS & NIPT IN RELAZIONE ALLA TOTALITA DELLE ANOMALIE CROMOSOMICHE CLINICAMENTE SIGNIFICATIVE Total # of HR+IR chromosome abnormalities (frequency = a priori risk; 95% CI) # of HR + IR anomalies detectable by MSS (effective DR=sensitivity; 95% CI) Total Residual risk ( +Π) for HR + IR anomalies after MSS (95% CI) # of HR + IR anomalies detectable by NIPT (effective DR=sensitivity; 95% CI) Total Residual risk ( +Π) for HR + IR anomalies after NIPT (95% CI) OR (95% CI) <35 yo N= (1%; ) 38 (0.44; ) 1/169 (1/144-1/205) 43 (0.49; ) 1/195 (1/163-1/248) 1.26 ( ) >35 yo 752 (2.2%; 2-2.4) 493 (0.66; ) 1/125 (1/112-1/137) 567 (0.76; ) 1/186 (1/165-1/212) 1.61 ( ) 151 (0.6%; ) 56 (0.37; ) 1/251 (1/226-1/288) 71 (0.47; ) 1/313 (1/ ) 1.51 ( ) 977 (1.6%; ) 620 (0.63; ) 1/159 (1/147-1/173) 744 (0.77; ) 1/268 (1/237-1/293) 1.84 ( ) CVS N=33788 AF <35 yo N=25454 >35 yo N=

16 CONFRONTO DELLA DETECTION RATE DI NIPT E MSS COME TEST DI SCREENING DI PRIMO LIVELLO Total # of HR+IR chromosome abnormalities (frequency = a priori risk; 95% CI) # of HR + IR anomalies detectable by MSS (effective DR=sensitivity; 95% CI) Total Residual risk ( +Π) for HR + IR anomalies after MSS (95% CI) # of HR + IR anomalies detectable by NIPT (effective DR=sensitivity; 95% CI) Total Residual risk ( +Π) for HR + IR anomalies after NIPT (95% CI) OR (95% CI) CVS <35 yo N= (1%; ) 38 (0.44; ) 1/169 (1/144-1/205) 43 (0.49; ) 1/195 (1/163-1/248) 1.26 ( ) >35 yo 752 (2.2%; 2-2.4) 493 (0.66; ) 1/125 (1/112-1/137) 567 (0.76; ) 1/186 (1/165-1/212) 1.61 ( ) N=33788 AF <35 yo N=25454 >35 yo N= (0.6%; ) 56 (0.37; ) 1/251 (1/226-1/288) 71 (0.47; ) 1/313 (1/ ) 1.51 ( ) 977 (1.6%; ) 620 (0.63; ) 1/159 (1/147-1/173) 744 (0.77; ) 1/268 (1/237-1/293) 1.84 ( ) CONCLUSIONE <35 anni: non vi è alcun miglioramento significativo nel tasso di rilevamento utilizzando NIPT come test di primo livello rispetto ai test di screening biochimici sia nel 1 che nel 2 trimestre 35 anni: vi è un aumento statisticamente significativo del tasso di rilevamento, anche se con un OR di solo 1.61 (1 trimestre) e 1.84 (2 trimestre)

17 CALCOLO DELLA DR EFFETTIVA E DEL RISCHIO RESIDUO TOTALE POST-TEST PER LE ANOMALIE CROMOSOMICHE HR+IR DOPO MSS & NIPT IN RELAZIONE ALLA TOTALITA DELLE ANOMALIE CROMOSOMICHE CLINICAMENTE SIGNIFICATIVE Total # of HR+IR chromosome abnormalities (frequency = a priori risk; 95% CI) # of HR + IR anomalies detectable by MSS (effective DR=sensitivity; 95% CI) Total Residual risk ( +Π) for HR + IR anomalies after MSS (95% CI) # of HR + IR anomalies detectable by NIPT (effective DR=sensitivity; 95% CI) Total Residual risk ( +Π) for HR + IR anomalies after NIPT (95% CI) OR (95% CI) <35 yo N= (1%; ) 38 (0.44; ) 1/169 (1/144-1/205) 43 (0.49; ) 1/195 (1/163-1/248) 1.26 ( ) >35 yo 752 (2.2%; 2-2.4) 493 (0.66; ) 1/125 (1/112-1/137) 567 (0.76; ) 1/186 (1/165-1/212) 1.61 ( ) 151 (0.6%; ) 56 (0.37; ) 1/251 (1/226-1/288) 71 (0.47; ) 1/313 (1/ ) 1.51 ( ) 977 (1.6%; ) 620 (0.63; ) 1/159 (1/147-1/173) 744 (0.77; ) 1/268 (1/237-1/293) 1.84 ( ) CVS N=33788 AF <35 yo N=25454 >35 yo N=

18 CONCLUSIONI Per entrambi i test, MSS e NIPT, esiste una quota basale di rischio ineliminabile dovuto alla quota di anomalie cromosomiche clinicamente significative che, allo stato attuale, non è indagabile né coi MSS e nemmeno coi NIPT (1/197 1/322 <35a; 1/187 1/ a seconda del trimestre di gestazione) Di tale RR finale dovrebbe essere chiaramente informata ogni gestante prima di eseguire il test MSS/NIPT per avere tutti gli elementi per prendere una decisione consapevole Alla luce di questo rischio basale ineliminabile con gli attuali MSS/NIPT bisognerebbe utilizzare con cautela il risultato dei NIPT/MSS come filtro per l accesso alla DP invasiva A differenza dei MSS, sono indubbie la potenzialità dei NIPT che sicuramente colmeranno i limiti attuali (mosaici, gravidanze gemellari, gestanti a basso rischio, tassi di fallimento ) e copriranno parte delle anomalie cromosomiche clinicamente significative non indagabili con i metodi attuali e, magari, anche microdelezioni/microduplicazioni che oggi sono evidenziabili solo mediante microarray cromosomici dopo prelievo invasivo (Jensen et al, Clin Chem Jul;58(7): )

19 GRAZIE Jose Carlos Pinto B. Ferreira Komal Bajaj Susan Gross

20 LA DIAGNOSI PRENATALE E GLI SCREENING PRENATALI NIPT NIPT Combined Quad Slide: courtesy of Howard Cuckle Gestational age