Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno Unito

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1 Protezione e miglioramento della salute pubblica Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno Unito Identificazione delle Enterobatteriaceae Emesso da Standards Unit, Microbiology Services Division, PHE Batteriologia I B 9 I Emissione no: 9 I Data emissione I Pagina 1 di 29 Crown copyright 2015

2 Ringraziamenti Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici. Per ulteriori informazioni contattare: Standards Unit Microbiology Services Public Health England 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ [email protected] Website: Numero di accesso alle pubblicazioni PHE: Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la collaborazione di: I loghi sono aggiornati al momento della pubblicazione Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 2 di 34

3 Contenuti RINGRAZIAMENTI... 2 TABELLA MODIFICHE... 4 RICERCHE MICROBIOLOGICHE STANDARD DEL REGNO UNITO: SCOPO E OBIETTIVO... 6 SCOPO DEL DOCUMENTO... 9 INTRODUZIONE... 9 INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA MICRORGANISMI BERSAGLIO IDENTIFICAZIONE IDENTIFICAZIONEDI ENTEROBACTERIACEAE REFERTAZIONE INVIO NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE BIBLIOGRAFIA... 8 NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for Microbiology Investigations. L accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio Informazioni più dettagliate sull accreditamento possono essere consultate: Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 3 di 34

4 Tabella delle Modifiche Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il sistema locale di gestione della qualità. Modifica No/Data. 6/ Emissione eliminata. no 3.2 Emissione inserita no. 4 Sezione(i) interessate Intero documento Pagina 2. Modifica. Collegamenti ipertestuali aggiornati al gov.uk. Loghi aggiornati aggiunti. La tassonomia della famiglia Enterobacteriaceae è stata aggiornata. Introduzione Ulteriori informazioni sono state aggiunte alla sezione Caratteristiche. Vengono menzionate le specie clinicamente rilevanti. La sezione relativa ai Principi d identificazione è stata aggiornata per includere il MALDI-TOF Informazione Tecnica/limitazioni Considerazioni sulla Sicurezza. Microrganismi Bersaglio Aggiunte informazioni riguardanti il test dell indolo, sierotipizzazione, erronea interpretazione dei risultati, sistemi di identificazione commerciale e MALDI-TOF MS. Questa sezione è stata aggiornata in merito alla manipolazione dei microrganismi e delle infezioni acquisite in laboratorio. La sezione sui organismi bersaglio è stato aggiornata e presentata in modo chiaro. Eseguiti aggiornamenti in 3.2, 3.3 e 3.4 in riferimento agli standard pratici. Identificazione. Aggiornate le sezioni e per includere MALDI- TOF MS e NAAT con bibliografia. Aggiornata la sottosezione 3.5 per includere i Metodi Molecolari Rapidi. Diagramma di flusso per Identificazione Modifica del diagramma di flusso per identificazione delle Enterobacteriaceae per facilitare l orientamento. Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 4 di 34

5 Refertazione Invio Intero documento Bibliografia Aggiornate le sottosezioni 5.3, 5.5 e 5.6 in merito alle informazioni richieste per una refertazione professionale. Aggiornati gli indirizzi dei laboratori di riferimento. Documento presentato in un nuovo formato. Bibliografia in parte aggiornata. Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 5 di 34

6 Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito # : Scopo e Obiettivo Utilizzatori delle SMI Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai professionisti che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive. Le SMI forniscono ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio riferibili alle ricerche per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni forniscono indicazioni che facilitano la prenotazione elettronica di tests appropriati Le SMI forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai responsabili della sanità pubblica che devono considerarle come parte delle procedure da adottare per la salute (sia clinica che pubblica) per la propria popolazione. Informazioni di Base per le SMI Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove di laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati). Gli algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione della prova. La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di garantire in tutto il Regno Unito strategie d indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le attività di ricerca e di sviluppo. Collaborazione Paritaria La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE, NHS, Royal College of Pathologists e le organizzazioni professionali. L'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere trovato su sitohttps:// L'inclusione del logo di una organizzazione in una SMI implica il sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno parte del comitato direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei rappresentanti possono non essere rigorosamente conformi a quelle dei membri delle organizzazioni a cui appartengono né a quelle delle loro organizzazioni. I rappresentanti prescelti rappresentano uno strumento bidirezionale per la consultazione e dialogo. Le opinioni espresse sono ricercate con un processo di consultazione. Le SMI sono sviluppate, revisionate ed aggiornate con un ampio processo di consultazione # Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC (General Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica. Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 6 di 34

7 Assicurazione di Qualità Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata dai Gruppi di Lavoro per produrre le SMI L accreditamento è applicabile a tutte le linee guida prodotte dall Ottobre del La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008. Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si devono attenere per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio disponibili nel Regno Unito. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti dell accreditamento con la promozione di procedure d elevata qualità che possono essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo. Le prestazioni della SMI dipendono dal personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del controllo di qualità interno. Coinvolgimento del Paziente e della Comunità Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento dei pazienti e dell opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L opportunità di partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l accesso libero al nostro sito web Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili La PHE è un organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza. Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti. Dichiarazione Legale Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente, escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche. Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell ente accreditato NICE. I diritti d autore delle SMI sono della Crown e questi dovrebbero essere riconosciuti quando appropriato. Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 7 di 34

8 Citazione Suggerita per questo Documento Identificazione delle Enterobatteriaceae Public Health England. (2015). Identification of Enterobacteriaceae. UK Standards for Microbiology Investigations. ID 16 Emissione 4. Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 8 di 34

9 Scopo del Documento Questa SMI descrive l identificazione dei componenti la famiglia delle Enterobatteriaceae. Le specie incluse in questa famiglia sono numerose. I laboratori di diagnosi della microbiologia clinica sono soliti utilizzare prove biochimiche per ottenere l identificazione. Il livello dipende dalla sede dell infezione, dalla condizione immunologia dell ospite e dalle richieste della sorveglianza epidemiologica. A causa del loro numero, questa SMI si dedicherà alle specie e ai generi riscontrati con maggior frequenza nei campioni clinici. L identificazione delle Enterobatteriaceae è semplificata dal fatto che tre specie rappresentano fra l 80 e il 95% degli isolati clinici. Queste sono Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Proteus mirabilis 1. Le altre possono essere facilmente identificate con le prove biochimiche. Questa SMI deve essere usata con le altre SMI. Introduzione Tassonomia La Tassonomia della famiglia batterica delle Enterobacteriaceae comprende attualmente 53 generi (e oltre 170 specie classificate) e queste comprendono Arsenophonus, Biostraticola, Brenneri, Buchnera, Budvicia, Buttiauxella, Calymmatobacterium, Cedecea, Citrobacter, Cosenzaea, Cronobacter, Dickeya, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Gibbsiella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Levinea, Lonsdalea, Mangrovibacter, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Phaseolibacter, Photorhabdus, Plesiomonas, Praga, Proteus, Providencia, Rahnella, Raoultella, Saccharobacter, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shigella, Shimwellia, Sodalis,Tatumella, Thorsellia, Trabulsiella, Wigglesworthia, Xenorhabdus, Yersinia e Yokenella. 26 di questi generi sono noti per essere associati ad infezioni nell'uomo. La classificazione delle Enterobacteriaceae è complicata e si è avvalsa di caratteristiche biochimiche e antigeniche. Recentemente, l'applicazione di nuove tecnologie, come ibridazione del DNA, ha portato a numerose modifiche tassonomiche delle Enterobacteriaceae 1. Sono stati individuati diversi nuovi generi e specie, alcuni di loro insoliti e rari, e molti di questi sono inoltre stati riclassificati in altri generi, per esempio Enterobacter sakazakii in Cronobacter sakazakii 2. Caratteristiche Gli appartenenti alle Enterobacteriaceae sono piccoli bastoncini diritti gram negativi, non sporigeni. Alcuni tipi sono mobili per mezzo di flagelli peritrichi, tranne le specie Tatumella, Shigella e Klebsiella che non sono mobili. Sono anaerobi facoltativi e la maggior parte delle specie cresce bene a 37 C, anche se alcune di loro crescono meglio a C. Si sviluppano bene su terreni contenenti estratto di peptone e di carne. Alcuni ceppi crescono in presenza di D-glucosio come unica fonte di carbonio e di energia, ma altri richiedono vitamine e/o aminoacidi. Durante la fermentazione del D-glucosio e di altri carboidrati viene prodotto acido 3,4. Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 9 di 34

10 Sono ossidasi negativi e nelle Enterobacteriaceae il test della catalasi é variabile. I nitrati sono ridotti a nitriti tranne che per alcuni ceppi di Erwinia. Sono distribuiti ovunque e possono essere riscontarti nel suolo, acqua, piante, uomini e animali. Generi di Importanza Clinica della famiglia delle Enterobatteriaceae sono 5 ; Citrobacter species Sono note 11 specie delle quali 10 sono state isolate da materiale clinico 6. Si trovano nelle feci dell uomo e degli animali come appartenenti alla flora normale e si sviluppano sui terreni di uso comune. Le cellule sono a forma di corti bastoncini disposti singolarmente, in coppia, o in corte catene con estremità arrotondate. Sono mobili con flagelli peritrichi. Le colonie sono generalmente grigie, lisce e umide, anche se si riscontrano ceppi mucoidi o rugosi. Alcuni ceppi di Citrobacter assomigliano biochimicamente alle specie Salmonella e agglutinano con gli antisieri polivalenti di Salmonella; ciò può determinare un erronea identificazione 7. Sono positive per indolo, catalasi e riduzione dei nitrati. Producono acidi e gas da esculina, arabinosio, glucosio, galattosio, glicerolo, inositolo, lattosio, levulosio, maltosio, mannitolo, mannosio, raffinosio, ramnosio, salicina, sorbitolo, amido, saccarosio, trealosio, e xilosio. Specie Enterobacter Sono note 26 specie e due sottospecie, delle quali di recente, sei sono state riclassificate in altri generi. Solo 10 sono state isolate da materiale clinico. Crescono facilmente su terreni comuni, fermentano il glucosio con produzione di acido e gas e sono mobili per presenza di flagelli peritrichi. Alcuni ceppi con antigene K possiedono una capsula. Le colonie di Enterobacter possono essere moderatamente mucose. Sono catalasi positive e ossidasi negative. Riducono i nitrati. Fermentano inoltre il glucosio e il lattosio con produzione di acido e gas. Enterobacter possiede le caratteristiche generali delle specie di Klebsiella, ma si differenzia in quanto microrganismi mobili e ornitina positivi. Le specie Enterobacter sono diffusamente distribuite in natura. Si trovano nel suolo, acqua, latticini e nell intestino di animali ed esseri umani. Specie Escherichia Sono note cinque specie e tutte sono riconosciute essere causa di malattia nell uomo 9. Le cellule si presentano in genere a forma di bastoncello, non formano spore, sono mobili con flagelli peritrichi o non mobili, misurano 2.0μm di lunghezza e μm di diametro. Sono in grado di crescere in atmosfera aerobia ed anaerobia. La crescita ottimale si verifica a 37 C. Su agar MacConkey le colonie si sviluppano con un colore rosso o sono incolori con diametro di circa 2-3 millimetri. Sono catalasi positive e ossidasi negative. Riducono i nitrati. L isolato più frequente è Escherichia coli, a cui appartengono numerosi sierotipi, alcuni dei quali sono associati a malattie specifiche. Un certo numero di ceppi di E. coli può produrre enterotossina o altri fattori di virulenza, compresi quelli associati all invasività. Alcuni ceppi sono capsulati e possiedono un antigene K. Per maggiori informazioni sull'identificazione di E. coli O157, fare riferimento a ID 22 - Identification of Escherichia coli O157. Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 10 di 34

11 Specie Hafnia Al genere Hafnia appartengono attualmente due specie 10. La temperatura ottimale per la crescita è di 35 C. Cresce facilmente su terreni comuni ed è generalmente mobile. La motilità è più accentuata a 30 C che a 37 C 11. Le reazioni biochimiche di alcuni ceppi di H.alvei possono somigliare a quelle di Salmonella non mobile, e sono in grado di agglutinare l antisiero polivalente di salmonella. Su agar moderatamente selettivi, appaiono in genere come colonie grandi, lisce, convesse, traslucide di 2-3 mm di diametro, con un bordo regolare; alcune possono presentare un bordo irregolare. Alcuni ceppi di Hafnia producono inoltre colonie rosse o rosa su agar xilosio-lisina desossicolato. Sono ossidasi e indolo negative e sono positive per la riduzione dei nitrati e per l'antigene comune delle Enterobacteriaceae. Inoltre producono acido con o senza gas dal metabolismo del glucosio e di altri carboidrati o composti simili ai carboidrati 12. Specie Klebsiella Al genere Klebsiella appartengono sei specie e tre sottospecie. Quattro specie interessano gli esseri umani e comprendono K. pneumoniae sottospecie pneumoniae, ozenae e rhinoscleromatis; K. oxytoca; K. granulomatis e K. variicola. Le altre due specie, K. singaporensis and K. michiganensis sono state isolate rispettivamente dal terreno e da un porta spazzolini da denti. Nel genere sono presenti oltre 77 antigeni capsulari (antigene K), che caratterizzano diversi sierogruppi 13. La notevole produzione di capsula polisaccaridica conferisce alle colonie un caratteristico aspetto mucoso. Le specie Klebsiella non sono mobili, hanno forma di bastoncelli solitamente capsulati, appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae. Questi batteri producono lisina decarbossilasi, ma non ornitina decarbossilasi, e sono generalmente positivi al test Voges- Proskauer nonché all indolo e all'ureasi. Generalmente sono anaerobi facoltativi, e misurano da 0,3-1,0 mm di larghezza e 0,6-6,0 mm di lunghezza 14. Tutti i ceppi si sviluppano facilmente su terreni comuni. Su agar MacConkey, le colonie appaiono tipicamente grandi, mucose, di colore rosso; il pigmento rosso solitamente diffonde nell'agar circostante ed è indice di fermentazione del lattosio e di produzione di acido. Possono causare batteriemia ed infezioni epatiche; sono state isolate anche da infezioni non comuni incluse endocardite, ascesso mediastinico primario contenente gas, peritonite, colecistite acuta, mionecrosi crepitante, piomiosite, fascite necrotizzante, ascesso del muscolo psoas, infezioni dello spazio fasciale della testa e del collo e artrite settica 5. Specie Morganella Al genere Morganella appartengono due specie, e solo una, Morganella morganii, è riconosciuta coma causa di infezioni nell'uomo 16. M. morganii comprende due sottospecie in funzione della loro capacità di fermentare il trealosio. Su agar nutriente, le colonie hanno diametro di 1-2 millimetri, colore grigio e sono opache, rotonde, convesse, e lisce con margine regolare dopo 24 ore a 35 C. Crescono bene anche a 22 C. Sono mobili con flagelli peritrichi, ma alcuni ceppi non sviluppano flagelli a temperatura superiore a 30 C. Le reazioni biochimiche di alcuni ceppi di M. morganii possono somigliare a quelle di Salmonella non mobile, e sono in grado di agglutinare l antisiero polivalente di salmonella. Sono ureasi e indolo positive e ossidasi negative. Producono acido e gas dalla fermentazione del glucosio e solamente acido da quella di mannosio, galattosio e trealosio 17. Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 11 di 34

12 Le specie appartenenti al genere Morganella sono state isolate da campioni clinici umani quali feci, ferita, espettorato, occhio, bile, ulcera gastrica, urine 17. Shigelloides Plesiomonas Al genere Plesiomonas appartiene una sola specie, Plesiomonas shigelloides 18. Sono corti bastoncini Gram negativi. Misurano generalmente μm in lunghezza e μm in larghezza, sono mobili con flagelli lofotrichi polari, non producono spore, e sono anaerobi facoltativi. Sono in grado di crescere a concentrazioni saline di 0-5%, ph 4,0-8,0, e temperature da 8-44 C. Plesiomonas shigelloides cresce sulla maggior parte dei terreni per batteri enterici sui quali forma colonie non fermentanti lattosio e saccarosio. Su Inositol Brilliant Green Bile Agar produce colonie rosa mentre su agar sangue le colonie hanno diametro di 2-3 mm, sono grandi, grigie, opache, convesse e β-emolitiche dopo incubazione a C per ore. Sono anche catalasi-positive e ossidasi-positive e possono essere distinte dalle altre Enterobacteriaceae in quanto sono l'unico genere ossidasi positivo di questa famiglia. Plesiomonas è negativo per la DNAsi; questo e altri test biochimici (lisina di Moeller, ornitina, test dell arginina e fermentazione del meso-inositolo) consentono la differenziazione dalla specie Aeromonas. Alcuni ceppi di Plesiomonas condividono antigeni con Shigella sonnei e possono verificarsi reazioni crociate con gli antisieri di Shigella 19. E stato isolato da campioni clinici umani quali feci, sangue, liquor, ferite, vie respiratorie e urine. E 'stato anche isolato da acque dolci, pesci d'acqua dolce, frutti di mare e da diversi tipi di animali 20. Specie Proteus Sono note quattro specie di Proteus, tre delle quali sono causa di malattia (consultare sezione 2) 21. Poiché appartiene alla famiglia delle Enterobacteriaceae, le caratteristiche generali sono quelle attribuite a questo genere. Tutti i ceppi sono mobili. Possono sciamare su agar sangue, producendo zone concentriche o una pellicola uniforme. Su agar MacConkey le colonie sono incolori, piatte, spesso leggermente sciamanti con diametro di 2-3mm (questo aspetto è specifico per Proteus vulgaris e Proteus mirabilis). Altre specie non sciamano. Sono resistenti alla polimixina B e colistina. Le reazioni biochimiche di alcuni ceppi di Proteus possono somigliare a quelle di Salmonella non mobile, e sono in grado di agglutinare l antisiero polivalente di salmonella. Le specie Proteus non fermentano il lattosio, ma hanno dimostrato di essere in grado di fermentarlo, in funzione della specie, su agar TSI (Triple sugar iron agar). Sono ossidasi negative, ma catalasi e nitrati positive; sono inoltre ureasi positive (test essenziale per differenziare Proteus da Salmonella) e fenilalanina deaminasi positive. Tutti i ceppi sono ureasi positivi. Sono state isolate da feci umane, urina, sede addominale, collo, inguine, e ferite dell'anca, congiuntiva infetta, decubito sacrale ed espettorato 22. Specie Providencia Il genere Providencia fu originariamente creato per microrganismi simili al genere Proteus, ma ureasi negativi. Sono note otto specie appartenenti al genere delle quali tre causano malattia (consultare sezione 2) 23. Tutte le specie sono mobili su agar sangue e agar MacConkey, le colonie sono incolori, piatte, con diametro di 2-3 millimetri e non sciamanti. Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 12 di 34

13 Non fermentano il lattosio e producono gas in piccola quantità dai carboidrati fermentabili. Non producono acido solfidrico e non idrolizzano l urea. Sono resistenti a polimixina B e colistina. Gli isolati umani delle specie Providencia sono stati riscontrati in urine, faringe, perineo, ascelle, feci, sangue e campioni di ferite 22. Specie Salmonella Per informazioni sulle specie di Salmonella, fare riferimento a ID 24 - Identification of Salmonella species. Specie Serratia Al genere Serratia appartengono 15 specie e tre sottospecie (ma solo Serratia liquefaciens e Serratia marcescens sono comunemente isolate da campioni clinici) 24. Serratia marcescens spesso produce un pigmento chiamato prodigiosina, che varia dal colore rosso scuro al rosa pallido in funzione dell'età delle colonie quando si sviluppano a 20 C. La produzione dei pigmenti è molto variabile tra le diverse specie e dipende da molti fattori quali la specie e il tempo d incubazione. Le colonie non pigmentate assomigliano ad altri membri delle Enterobacteriaceae. La temperatura ottimale di crescita è di 37 C, ma possono anche svilupparsi a temperature comprese fra 5-40 C. Sono anaerobie facoltative. La maggior parte delle specie sono mobili per la presenza di flagelli peritrichi. Le cellule sono bastoncelli e misurano μm x μm. Producono tipicamente tre enzimi quali lipasi, DNasi e gelatinasi. Sono inoltre resistenti a polimixina B e colistina e questa resistenza può essere eterogenea mostrando l aspetto tipico a bersaglio. Sono positive alla fermentazione di glucosio e saccarosio (con produzione di gas); positive alla riduzione dei nitrati e negative ai test indolo, ureasi e ossidasi. Le infezioni da Serratia plymuthica, Serratia liquefaciens, Serratia rubidaea, Serratia odorifera, e Serratia fonticola sono state evidenziate in un numero esiguo di casi. Le specie Serratia si riscontrano nelle feci, essudati da ferita, campioni respiratori, sangue, colture oculari e urine 20. Serratia marcescens è la specie più rappresentativa. Specie Shigella Per informazioni sull'identificazione delle specie Shigella, fare riferimento a ID 20 - Identification of Shigella species. Specie Yersinia Per informazioni sull'identificazione delle specie Yersinia, fare riferimento a ID 21 - Identification of Yersinia Species from Faeces. Altri generi della famiglia Enterobacteriaceae Altri generi della famiglia noti per aver causato infezioni sono elencati nella sezione 2. Principi di Identificazione Morfologia della colonia, colorazione Gram, ossidasi e utilizzo di alcune prove biochimiche consentono d identificare gli isolati dal materiale clinico. Patogeni enterici, come le specie Salmonella devono essere identificati con prove biochimiche e tipizzati sierologicamente. Le specie Hafnia, Morganella e Proteus possono assomigliare biochimicamente a Salmonelle immobili e agglutinare con sieri polivalenti anti-salmonella. Per la variabilità Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 13 di 34

14 delle prove biochimiche in questa SMI non sono descritti i profili biochimici di ciascuna specie. Saranno pertanto descritte solo alcune prove di screening per i più frequenti generi e specie. Una particolare attenzione dovrebbe essere posta agli isolati che forniscono un identificazione insolita; prima di accettare i risultati del sistema d identificazione commerciale tutte le prove dovrebbero essere considerate, comprese le caratteristiche di crescita, la morfologia delle colonie e la relativa sierologia. L identificazione molecolare completa, utilizzando, ad esempio, Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) può essere utilizzata per identificare gli isolati a livello di specie. Se è necessaria un'ulteriore identificazione o conferma, gli isolati dovrebbero essere inviati al Laboratorio di Riferimento. Informazione Tecnica/Limitazioni Test per Indolo I microorganismi da saggiare per l indolo devono essere prelevati da un terreno contenente triptofano (ad esempio agar sangue) e mai da agar MacConkey in quanto contiene indicatori di ph e pigmento (nelle colonie lattosio-positive) che rendono difficile l interpretazione cromatica della reazione 29. Sistemi Commerciali d Identificazione Attualmente nessun sistema commerciale comprende nella sua banca dati tutte le nuove specie di recente classificazione pertanto, quando si usano questi sistemi, si potrebbe generare un profilo inaccettabile o nessun tipo d identificazione, ad esempio nel caso di Escherichia albertii e Hafnia alvei 12,30. Sierotipizzazione Per maggiori informazioni sulle limitazioni tecniche delle specie Shigella, fare riferimento a ID 20 Identification of Shigella species. Antigeni capsulari: Ciò si applica anche alle specie di Klebsiella dove le reazioni crociate sono riscontrate nei 77 tipi di capsula e pertanto, i singoli sieri devono essere absorbiti con gli antigeni K crossreagenti. La procedura per la sierotipizzazione di Klebsiella è impegnativa per il tempo richiesto per l esecuzione della prova ed è suscettibile d interpretazioni soggettive per presenza di reazioni deboli non sempre facili da interpretare. Poiché gli antisieri anti-capsula non sono disponibili in commercio, questa tecnica è eseguita prevalentemente in laboratori specializzati 14. Risultati mal interpretati Quando si ottengono risultati contrastanti, ad esempio mancata concordanza fra profilo sierologico e biochimico, le prove dovrebbero essere ripetute dalla piastra originale. Controllo qualità Ogni nuovo lotto o fornitura di antisieri/ sistemi d identificazione commerciali deve essere saggiato e validato per la reattività positiva e negativa con ceppi noti di controllo; assicurando l idoneità allo scopo. Le istruzioni del produttore vanno seguite nell utilizzo di questi prodotti. Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 14 di 34

15 TOF MALDI-MS Uno dei limiti di MALDI-TOF MS è l'attuale incapacità di differenziare in modo affidabile gli isolati di E. coli patogene da quelle non patogene, inoltre, numerose segnalazioni hanno descritto la difficoltà che si riscontra quando si devono differenziare i ceppi di E. coli dalle specie Shigella. La differenziazione dei ceppi patogeni di E. coli dalle specie Shigella è impegnativa a causa della stretta correlazione genetica fra i microrganismi 31. Come strumento per la tipizzazione delle sottospecie e tipizzazione delle varianti sierologiche, MALDI-TOF MS fornisce una prospettiva interessante, ma saranno richiesti altri studi e modificazioni dei protocolli esistenti prima che il metodo possa essere utilizzato come strumento di accertamento unico 31. Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 15 di 34

16 1 Considerazioni sulla Sicurezza 25-28,32-44 Tutte le Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, B e C, Shigella dysenteriae tipo 1, E. coli O157 e Yersinia pestis appartengono al Gruppo di microrganismi di Rischio 3 e gli isolati da infezioni sistemiche in viaggiatori di ritorno dall estero e in altre infezioni rilevanti, devono essere manipolate in ambiente con livello di contenimento 3. Specie Salmonella La maggior parte delle specie di Salmonella appartiene al gruppo di rischio 2 con importanti eccezioni tra le quali S. Typhi e S. Paratyphi A, B e C. Le manipolazioni riguardanti questi microrganismi devono essere eseguite in condizioni di livello di contenimento 3. S. Typhi, S. Paratyphi A, B e C causano malattie gravi e talvolta letali. Sono state segnalate circa 258 casi e 20 morti da infezioni acquisite in laboratorio 45,46. E disponibile la vaccinazione per S. Typhi e le linee guida sono fornite dal Department of Health immunisation policy 47. Specie Shigella Le specie Shigella sono molto infettive, in particolare S. dysenteriae 38,39. La dose minima infettante in grado di causare infezione è di 10 microorganismi 48. Le specie Shigella sono state recentemente identificate come l'agente più frequentemente identificato nelle infezioni acquisite in laboratorio a causa della loro elevata virulenza e ridotta dose infettante. Sono state segnalate numerose infezioni acquisite in laboratorio. L'infezione può essere acquisita tramite l'ingestione o inoculazione parenterale accidentale 49,50. Specie Escherichia Le specie Escherichia sono altamente infettive e in modo particolare quelle di E. coli O157, e richiedono il numero minimo di 10 microrganismi vitali per una dose infettante. È stata identificata come uno dei patogeni enterici segnalati come causa di infezione acquisita in laboratorio, ma sono fra quelle meno frequenti. Sono stati segnalati quattro casi di infezione acquisita in laboratorio da E. coli dal Yersinia pestis Yersinia pestis è molto infettiva e la dose infettante è sconosciuta. Sono state segnalate 10 infezioni acquisite in laboratorio con quattro decessi 53. La vaccinazione è raccomandata per il personale di laboratorio che è abitualmente esposto a microrganismi viventi di Y. pestis. Fare riferimento alle linee guida sulla manipolazione sicura dei microrganismi documentati in questa SMI Devono essere indossati appropriati dispositivi di protezione individuale (DPI) e rispettate in ogni momento le tecniche finalizzate a ridurre al minimo l'esposizione del personale di laboratorio. Il metodo più efficace per la prevenzione delle infezioni acquisite in laboratorio è l'adozione di pratiche di lavoro sicuro. Procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi devono essere eseguite in cabina di sicurezza microbiologica. Le linee guida precedentemente enunciate devono essere supplementate dalle valutazioni del COSHH locale e dalla valutazione del rischio. E essenziale Il rispetto delle regolamentazioni postali e di trasporto. Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 16 di 34

17 2 Microrganismi Bersaglio Identificazione delle Enterobatteriaceae Enterobacteriaceae Segnalate come Causa d Infezione nell Uomo 12,14,15,17,22,25-27,30,51,53-65 Genere Specie Cedecea davisae, lapagei, neteri, specie 3, specie 5 Citrobacter amalonaticus, braakii, farmeri, freundii,gillenii, koseri, murliniae,, sedlakii, werkmanii, youngae Cronobacter sakazakii (Enterobacter sakazakii), malonaticus, turicensis, universalis (in precedenza Cronobacter genomospecie 1) Edwardsiella hoshinae, ictaluri, tarda Enterobacter aerogenes, amnigenus, asburiae, cancerogenus, cloacae, cowanii, gergoviae, hormaechei, kobei, ludwigii, Escherichia albertii, coli, fergusonii, hermanii, vulneris Ewingella americana Hafnia alvei, paralvei (in precedenza nota come Hafnia alvei biogruppo 2) Klebsiella granulomatis, oxitocia, pneumoniae sottospecie aerogenes, ozaenae, pneumoniae,e rhinoscleromatis, vanicola Kluyvera ascorbata, cryocrescens, georgiana Leclercia adecarboxylata Morganella morganii sottospecie morganii e sibonii Pantoea agglomerans, dispersa, septica Photorhabdus luminescens, asymbiotica sottospecie australis, asymbiotica Pleiomonas shigelloides Proteus mirabilis, penneri, vulgaris Providencia alcalifaciens, rettgeri, stuartii Rahnella aquatilis Salmonella bongori, enterica (>2500 sierotipo) sottospecie arizonae, diarizonae, enterica, houtenae, indica e salamae, importante sierotipi (serovar.) - Enteritidis, Paratyphi, Typhi, Typhimurium. Serratia fonticola, grimesii, liquefaciens, marcescens, odorifera, plymuthica, proteamaculans, quinovorans, rubidaea Shigella boydii, dysenteriae, flexneri, sonnei Tatumella ptyseos Yesinia bercovieri, enterocolitica, intermedia, frederiksenii, kristensenii, mollaretti, pestis, pseudotuberculosis, rohdei Yokenella regensburgei Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 17 di 34

18 Altri Generi della Famiglia delle Enterobatteriaceae che possono essere Associati a Infezioni nell Uomo Citrobacter gillenii (In precedenza Citrobacter Genomospecies 10), Citrobacter murliniae (In precedenza Citrobacter Genomospecie 11), Leminorella grimontii, Leminorella richardii, Moellerella wisconsensis, Altri generi e specie delle Enterobatteriaceae possono essere associati raramente a malattie nell uomo. 3 Identificazione 3.1 Aspetto Microscopico Colorazione Gram (TP 39 - Staining Procedures) Bastoncini Gram negativi, alcuni presentano colorazione bipolare (es. specie Yersinia) 3.2 Terreno di Primo Isolamento Agar sangue (AS): ore d'incubazione in 5-10% CO 2 a C Agar MacConkey (MAC): ore d incubazione aerobica a C Agar cistina-lattosio-elettroliti deficiente (CLED, cystine-lactose-electrolyte deficient agar) con blu di bromotimolo (CLED B) o indicatore di Andrade (CLED A): ore d incubazione aerobica a C Sono inoltre disponibili terreni cromogeni appropriati per tipo di campione o di microrganismo target. Fare riferimento alle più importanti ID SOP. Incubare i terreni cromogeni in aerobiosi a C per ore. 3.3 Aspetto delle Colonie AS Colonie con diametro di 2-3 mm, piatte, convesse, grigie, lisce o mucose, possono essere emolitiche o sciamanti. MAC Le colonie possono apparire di colore rosa (lattosio fermentanti) o prive di colore (lattosio non-fermentanti), dimensioni e aspetto variano nelle singole specie. CLED B Le colonie possono apparire di colore giallo (lattosio fermentanti) o blu (lattosio non-fermentanti), dimensioni e aspetto variano nelle singole specie. CLED A Le colonie possono apparire di colore rosa (lattosio fermentante) o verde translucido (lattosio non-fermentanti), dimensioni e aspetto variano nelle singole specie. In merito all aspetto delle colonie di specifici microrganismi bersaglio su terreno cromogeno, fare riferimento all appropriata SOP ID Nota: Le colonie della specie Yersinia possono essere più piccole di quelle delle altre Enterobatteriaceae. 3.4 Procedure di Prova Prove biochimiche Prova dell Ossidasi (TP 26 Oxidase test) Tutte le Enterobatteriaceae sono ossidasi-negative tranne Pleisomonas shigelloides. Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 18 di 34

19 Test Indolo (TP 19 Indole Test) Il test dell'indolo determina la capacità di un microrganismo di produrre indolo dalla degradazione dell aminoacido triptofano. E un supporto nella differenziazione delle Enterobacteriaceae e di altri generi. Nelle specie Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e Serratia la reazione all indolo è variabile, ma solitamente negativa. Le specie appartenenti al genere Escherichia sono positive al test dell indolo, tranne E. vulneris. Test di Fermentazione dei Carboidrati La fermentazione del lattosio presenta risultati variabili in base al genere e alla specie Sistemi di identificazione commerciali I laboratori dovrebbero seguire le istruzioni del produttore e i test rapidi e le confezioni dovrebbero essere validati per dimostrare di essere idonei allo scopo prima dell'uso Sierotipizzazione La Sierotipizzazione è il metodo che si avvale della immuno-reattività dei vari antigeni. Le specie Shigella sono per definizione non mobili, di conseguenza, per la determinazione del sierotipo, sono utilizzati solo gli antigeni somatici (O). Gli antigeni flagellare (H) non sono espressi. La maggior parte dei sierotipi di Salmonella possiedono due fasi di antigeni H (flagellari) e può anche essere effettuata la sierotipizzazione di queste specie. Per la descrizione dettagliata delle procedure, fare riferimento a TP 3 - Agglutination Test for Salmonella species and TP 32 - Changing the Phase of Salmonella Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation - Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry Il Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), può essere utilizzato per l analisi della composizione proteica di una cellula batterica, ed è emerso come una nuova tecnologia per l'identificazione delle specie. Questo sistema ha dimostrato di essere uno strumento potente e rapido per la sua riproducibilità, velocità e sensibilità analitica. Il vantaggio di MALDI-TOF rispetto ad altri metodi d identificazione è dovuto alla disponibilità dei risultati delle analisi entro poche ore anziché diversi giorni. La velocità, la semplicità di preparazione del campione e l acquisizione del risultato, associato a costi minimi dei materiali di consumo rendono questo metodo adatto per l uso di routine e per l alta produttività 70. Questo sistema è stato utilizzato per facilitare il riconoscimento e l identificazione a livello di specie di Salmonella e del complesso Enterobacter cloacae complex. Come strumento per la tipizzazione di sottospecie e tipizzazione sierologica, MALDI-TOF MS mostra significative possibilità, ma saranno richiesti ulteriori studi e modifiche dei protocolli esistenti prima che il metodo possa essere usato come strumento di accertamento unico 31. Questa tecnica è stata anche utilizzata per l'identificazione delle specie Pantoea ma la banca dati dovrebbe essere arricchita con l inserimento di profili d interesse ambientale e clinico per essere ulteriormente consolidata 71. E 'stato anche utilizzato con successo per l'identificazione e la caratterizzazione di isolati appartenenti a Proteus mirabilis, Plesiomonas shigelloides ed Enterobacter cloacae, ma la banca dati del MALDI-TOF MS richiede miglioramenti per poter determinare l identificazione a livello di specie, per esempio dell Enterobacter cloacae complex 31. Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 19 di 34

20 MALDI-TOF MS è in grado di differenziare con accuratezza due microrganismi clinicamente rilevanti e geneticamente molto simili con identiche sequenze genomiche 16S rrna, quali quelle di Y. pestis e Y. Pseudotuberculosis 72. I metodi di inattivazione utilizzati per questi microrganismi patogeni non ha alcuna interferenza sullo spettro generato da MALDI-TOF MS. Questo metodo è stato anche utilizzato per identificare e sottotipizzare gli isolati di Yersinia enterocolitica 73. MALDI-TOF MS è in grado di identificare a livello di specie gli isolati del genere Cronobacter o di identificarli come isolati non-cronobacter nel caso di ceppi non bersaglio e di identificare diversi biotipi appartenenti alla specie C. sakazakii, sebbene secondo uno studio da Cetinkaya et al., le tecniche molecolari, quali 16S rrna, il sequenziamento del gene fusa e la multilocus sequence typing (MLST) sono i metodi d identificazione più affidabili per Cronobacter Uno dei limiti è dovuto all'attuale impossibilità di MALDI-TOF MS di differenziare in modo affidabile gli isolati patogeni di E. coli da quelli non patogeni, inoltre, numerose segnalazioni hanno descritto la difficoltà riscontrata nella differenziazione di E. coli dalle specie Shigella. La differenziazione dei ceppi patogeni di E. coli da quelli appartenenti alla specie Shigella è impegnativa a causa dello stretto grado di correlazione genetica dei microrganismi e, pertanto, per l identificazione, sono essenziali le prove biochimiche e sierologiche Test Nucleic Acid Amplification (NAAT) La PCR è generalmente considerata un buon metodo di rilevazione batterica in quanto semplice, rapida, sensibile e specifica. La base per le applicazioni diagnostiche della PCR in microbiologia è la rivelazione di agenti infettivi e la discriminazione dei ceppi non patogeni da quelli patogeni in quanto dotati di geni specifici. Tuttavia, questo metodo ha dei limiti. Sebbene il gene 16S rrna funga generalmente da modello per la progettazione dei primer identificativi PCR specie-specifici, questo risulta difficile quando le sequenze dei geni omologhi hanno elevata affinità. Questo metodo è stato utilizzato con successo per l'identificazione delle Enterobacteriaceae - Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, specie Citrobacter, Enterobacter cloacae e Salmonella sottospecie I, sierotipi di Salmonella enterica, Typhimurium, Typhi e Enteritidis così come per Salmonella enterica sottospecie arizonae e diarizonae (in modo rapido e preciso senza l ausilio dei test sierologici) Tuttavia, la PCR multiplex per l identificazione dei sierotipi di Salmonella può essere impegnativa (per la sua limitata specificità) e talvolta manca di riproducibilità tra laboratori a causa delle condizioni specifiche richieste per l'amplificazione simultanea di diverse regioni 78,81. La PCR è stato utilizzata per la rilevazione di Y. pestis tra le specie patogene di Yersinia e di altre Enterobacteriaceae aventi antigeni in comune con Y. pestis. E 'molto utile nelle emergenze CBRN (chimiche, biologiche, radiologiche e nucleari) e per la sorveglianza epidemiologica82. Questo metodo è stato inoltre utilizzato per individuare i geni di virulenza di Yersinia enterocolitica e Y. pseudotuberculosis in isolati clinici umani 83. I sistemi commerciali PCR real-time sono stati sviluppati e validati per la rilevazione simultanea di patogeni enterici batterici sia direttamente dal campione di feci, senza alcun pre-arricchimento, che previo arricchimento overnight Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 20 di 34

21 3.5 Identificazione Successiva Metodi molecolari Rapidi Identificazione delle Enterobatteriaceae Di consuetudine, per il rilevamento di routine dei batterici patogeni enterici, la maggior parte dei laboratori di microbiologia clinica usa ancora tecniche diagnostiche tradizionali, come l esame colturale. Queste tecniche sono dispendiose in termini di tempo e laboriose, inoltre, comportano un ritardo nella comunicazione dei risultati. La ricerca dei patogeni con metodi molecolari ha dimostrato comunque di essere più veloce e sensibile dell esame colturale tradizionale 84. Ottenere risultati in tempi rapidi consente indagini epidemiologiche precoci e interventi di controllo infezioni. Ciò è particolarmente importante quando la ricerca colturale del patogeno è problematica o carente di sensibilità. I metodi molecolari hanno avuto un impatto enorme sulla tassonomia delle Enterobacteriaceae. L analisi delle sequenze geniche ha accresciuto la comprensione delle relazioni filogenetiche delle Enterobacteriaceae e dei microrganismi correlati e questo ha comportato l identificazione di numerose nuove specie. Le tecniche molecolari hanno reso più rapida e precisa l identificazione di molte specie rispetto a quanto sia possibile con le tecniche fenotipiche. Per gli isolati da campioni clinici sono stati sviluppati numerosi metodi di tipizzazione rapida; questi includono tecniche molecolari, come la Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), Multilocus Sequence Typing (MLST), Multiple-Locus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis (MVLA), SNP assays e Whole Genome Sequencing (WGS). Questi approcci consentono la sottotipizzazione di ceppi non correlati ma con gradi diversi di accuratezza, capacità discriminante, e riproducibilità. Tuttavia, alcuni di questi metodi rimangono disponibili solo presso i laboratori di riferimento e sono difficili da implementare per l identificazione batterica di routine in un laboratorio clinico. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) La PFGE rileva variazione genetica tra ceppi con rari tagli ottenuti con gli enzimi endonucleasi di restrizione e successiva separazione dei grandi frammenti genomici ottenuti su gel di agarosio. La PFGE è nota per essere altamente discriminante ed è una tecnica utilizzata frequentemente per le indagini sui focolai epidemici avendo acquisito una vasta applicazione nella caratterizzazione degli isolati epidemiologicamente correlati. Tuttavia, la stabilità della PFGE può essere insufficiente per un applicazione affidabile e in studi epidemiologici a lungo termine. Inoltre, a causa della sua natura, richiede tempo (30 ore o più per l esecuzione) e attrezzature speciali. La PFGE non è diffusamente usata se non nei laboratori di riferimento 87,88. E stata utilizzata con successo per identificare e differenziare le specie della famiglia delle Enterobacteriaceae ad esempio per riconoscere la fonte d infezioni da Salmonella per i diversi sierotipi ed è considerata lo standard di riferimento per la tipizzazione molecolare di Salmonella e di Klebsiella 14,89,90. E stata utilizzata con successo per differenziare i ceppi di Yersinia enterocolitica e sarà ancora utile in futuro per la sorveglianza delle fonti e delle vie di trasmissione dei ceppi sporadici di Yersinia enterocolitica 91. Multilocus Sequence Typing (MLST) La MLST determina direttamente le variazioni di sequenza del DNA in un gruppo di geni strutturali e caratterizza i ceppi tramite i loro profili allelici unici. Il principio della MLST è semplice: la tecnica comporta una PCR seguita dal sequenziamento del DNA. Le differenze nucleotidiche tra ceppi possono essere valutate in un numero variabile di geni in funzione del grado di differenziazione desiderato. La tecnica è altamente discriminante, in quanto rileva tutti i polimorfismi nucleotidici all'interno di un gene anziché solamente i cambiamenti non Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 21 di 34

22 sinonimi (quelli che determinano una modifica nella sequenza aminoacidica) che alterano la mobilità elettroforetica dei frammenti proteici. Uno dei vantaggi di MLST rispetto agli altri metodi di tipizzazione molecolare è dovuto al fatto che i dati ottenuti dal sequenziamento sono condivisibili tra i laboratori e hanno reso possibile la creazione di banche dati globali che consentono lo scambio dei risultati di tipizzazione molecolare tramite Internet 92. La MLST è stata ampiamente usata come uno dei principali metodi di tipizzazione per analizzare le relazioni genetiche all'interno della popolazione delle Enterobacteriaceae, in particolare per il genere Salmonella 89,90. La MLST ha consentito una migliore differenziazione fra i ceppi di Salmonella sierotipo Enteritidis rispetto alla PFGE e un accurata differenziazione fra i ceppi epidemici e cloni dei sierotipi di Salmonella più frequentemente associati alla malattia umana. E 'stata anche utile per la tipizzazione dei ceppi non tifoidei di Salmonella 93. E stata anche utilizzata per identificare E. coli produttore di tossina Shiga (verotossina), Shigella e Klebsiella 14,94. Gli svantaggi della MLST sono dovuti al costo e al notevole lavoro di laboratorio richiesto per amplificare, determinare, e interpretare la sequenza nucleotidica dei frammenti del DNA bersaglio; ciò rende il metodo poco adatto per test di routine di laboratorio. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MVLA) also known as VNTR La Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MVLA) è un metodo utilizzato per eseguire la tipizzazione molecolare di microrganismi particolari. Utilizza la variazione naturale del numero di sequenze di DNA ripetute in tandem reperibili in molti loci differenti nel genoma di una varietà di microrganismi. I profili di tipizzazione molecolare vengono utilizzati per studiare le vie di trasmissione, per valutare le fonti d infezione e anche per definire l'impatto dell'intervento umano quale la vaccinazione e l'uso di antibiotici sulla composizione delle popolazioni batteriche. Questo metodo è stato utilizzato con successo per la sottotipizzazione di isolati di Salmonella enterica subsp sierotipo enterica Typhimurium, Enteritidis, Typhi, Infantis, Newport, Paratyphi A, Saintpaul e Gallinarum 89,93,95,96. Il metodo si è dimostrato molto utile per individuare e analizzare i focolai, poiché ha la capacità di differenziare ceppi strettamente correlati. È tecnicamente semplice e poco costosa da eseguire. Tuttavia, non ha alcuna utilità per la definizione dei sierotipi o per studi filogenetici globali poichè la portata di ogni test MLVA è comunemente limitata ad un unico sierotipo. Il metodo MLVA è stato usato con successo per identificare e differenziare ceppi di Yersinia enterocolitica ed è stato riscontrato essere più efficace della PFGE. Questo metodo richiede inoltre meno impegno lavorativo ed i risultati ottenuti sono più facili da analizzare. Questo è usato anche nelle ricerche su focolai epidemici 91. E stato anche utilizzato con successo per identificare ceppi di Shigella ed Escherichia, suggerendo che potrebbe contribuire in modo significativo alle analisi epidemiologiche retrospettive delle infezioni da Shigella e di epidemie da Escherichia patogeni. E 'stato anche utilizzato per genotipizzare Yersinia pestis 97. Whole Genome Sequencing (WGS) Questo è noto anche come "sequenziamento completo del genoma, completo sequenziamento del genoma, o intero sequenziamento del genoma". Si tratta di un processo di laboratorio che determina la sequenza completa di DNA del genoma di un organismo in un unica seduta. Sono disponibili diverse tecniche ad alta produttività che sono disponibili ed utilizzate per sequenziare un intero genoma, come pyrosequencing, tecnologia nanopore, sequenziamento IIIumina, sequenziamento Ion Torrent, ecc. Questo metodo di sequenziamento rappresenta una grande promessa per una rapida, precisa e completa Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 22 di 34

23 identificazione delle vie di trasmissione batterica in ambito ospedaliero e istituzioni comunitarie, con concomitanti riduzione di infezioni, morbilità e costi. E stato utilizzato con successo per esplorare il genoma delle specie Shigella ed E. coli O157: H7 per identificare i geni che possono concorrere come responsabili della patogenesi e per sviluppare migliori metodi di rilevamento dei ceppi e far progredire la comprensione dell'evoluzione delle E. coli. Con questa tecnica, è stato scoperto il trasferimento genico laterale di E. coli che è risultato essere molto diffuso 48,98. Il WGS è stato utilizzato anche per fornire importanti conoscenze sulla patologia di Yersinia enterocolitica e, più in generale, l'evoluzione di genere in altri enteropatogeni umani 99. Questa tecnica è stata pure utilizzata per caratterizzare Salmonella enterica sierotipo Typhi e per individuare i suoi geni di recente acquisizione, come quelli che codificano l'antigene Vi, tramite eventi di trasferimento orizzontale e ha fornito nuove informazioni sul modo in cui questo patogeno è evoluto fino a causare la malattia invasiva nell uomo 90. rpob Single Nucleotide Polymorphism (rpob SNP) assay rpob è una coppia-singola di gene cromosomico che codifica la β-subunità della RNA polimerasi. Questo gene è stato precedentemente utilizzato nell analisi filogenetica per le specie batteriche e per delineare il genere, dal momento che fra i microrganismi è altamente conservato 100. Tuttavia, il gene 16SrRNA è stato utilizzato ampiamente e la sua utilità è notevolmente migliorata grazie alla creazione di banche dati di dominio pubblico; la sua sensibilità è stata messa in discussione in particolare tra le Enterobacteriaceae pertanto quando il gene rpob è stato utilizzato come alternativa per il rilevamento del Polimorfismo di un Singolo Nucleotide è stato riscontrato essere più compatibile con la classificazione attualmente accettata delle Enterobacteriaceae e come un potente strumento che può essere utile per l'identificazione batterica universale. E stato utilizzato per dimostrare che il genere Klebsiella è polifiletico e per individuare Salmonella enterica sierotipo Typhimurium 81. Il vantaggio di SNP e altri metodi basati sulla sequenza nucleotidica, rispetto ai metodi che generano profili, è che le relazioni genetiche possono essere stabilite sulla base di dati discreti che sono direttamente adattabili per l analisi statistica bioinformatica Conservazione e Invio Salvare un isolato puro su becco di clarino di agar nutriente per l invio al Laboratorio di Riferimento Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 23 di 34

24 4 Identificazione delle Enterobatteriaceae Il Diagramma di Flusso rappresenta solo un indicazione Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 24 di 34

25 5 Refertazione 5.1 Identificazione Presunta Se rilevate appropriate caratteristiche di crescita, aspetto delle colonie, colorazione Gram della coltura, ossidasi e risultati sierologici. 5.2 Conferma dell Identificazione Ulteriori test biochimici e/o metodi molecolari e/o risultati del laboratorio di riferimento 5.3 Medico Microbiologo Informare il medico microbiologo di tutte le colture positive presunte o confermate di Y. pestis, S. Typhi, S. Paratyphi, specie Shigella, E. coli O157 e specie Salmonella (secondo le procedure locali). In accordo con i protocolli locali, il medico microbiologo deve inoltre essere informato se il modulo di richiesta contiene informazioni relative a infezione da Y. pestis quali: Sindrome ulcerativa-ghiandolare/polmonare Setticemia Viaggio, cacciatore, agricoltore, lavoro veterinario all estero Informazione relativa a casi di: Enterocolite Dissenteria Setticemia Sindrome emolitica-uremica Disfunzione neurologica o stati confusionali esantema (che non impallidisce) Devono essere segnalati al medico microbiologo anche i casi con identificazione preliminare o confermata di febbre enterica, dissenteria ed enterocolite, in modo particolare se l anamnesi del paziente segnala: recente viaggio all estero agricoltore (o visita in fattoria) veterinario o lavoro in laboratorio alcolismo, abuso di stupefacenti, immunodeficienza o altre condizioni gravi quale i tumori Devono inoltre essere segnalati al medico microbiologo gli isolati con identificazione presunta o confermata di Enterobatteriaceae da casi d intossicazione alimentare e da ricerche di situazioni epidemiche. Seguire i protocolli locali per la refertazione al clinico 5.4 CCDC Fare riferimento al Memorandum locale di Informazione. Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 25 di 34

26 Tutti gli isolati clinicamente significativi dovrebbero essere notificati dal laboratorio per assicurare una rapido avvio delle procedure appropriate 5.5 Public Health England 101 Fare riferimento alle attuali linee guida su CIDSC e COSURV Denunciare tutti gli isolati seguenti: E. coli (identificazione preliminare [confermata localmente] di VTEC O157 e altri possibili ceppi di VTEC) Specie Salmonella Specie Shigella Yersinia pestis La notifica orale urgente al Public Health England Centre entro 24 ore dall identificazione è ritenuta necessaria per porre in atto appropriati interventi di protezione sanitaria quando l identificazione presunta è stata posta nelle seguenti situazioni : S. Typhi o S. Paratyphi Specie Salmonella se si sospetta un epidemia o in caso di operatore alimentarista o di comunità chiusa quale una casa di cura Specie Shigella diverse da S. sonnei S. sonnei se si sospetta un epidemia o un caso di operatore alimentarista o in comunità chiusa quale una casa di cura E. coli O157 con identificazione presunta (confermata localmente) dal laboratorio diagnostico E. coli diverse dalla O157 produttrici di verocitotossina Yersinia pestis Quando disponibili, i risultati di conferma e della tipizzazione devono essere inoltrati al Public Health England Centre il più celermente possibile per porre in atto appropriate interventi di protezione sanitaria. 5.6 Gruppo Controllo Infezione I Informare il gruppo di controllo delle infezioni degii isolati presunti e confermati di E. coli O157, specie Yersinia, Salmonella e Shigella 6 Invio 6.1 Laboratorio di Riferimento Contattare appropriati laboratori di riferimento nazionali specializzati per informazioni su accertamenti disponibili, tempi di risposta, procedure di trasporto ed altre informazioni riguardanti l invio del campione: Gastrointestinal Bacteria Reference Unit Bacteriology Reference Department Public Health England 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 26 di 34

27 Contattare il centralino della PHE: Tel. +44 (0) Identificazione delle Enterobatteriaceae Inghilterra e Galles Scozia Iirlanda del Nord 7 Notifica al PHE 101,102 o Equivalente Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s identificano gli agenti causali elencati nella Scheda 2 della Direttiva, Le denuncie devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica, entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro sette giorni. Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l ufficio locale della PHE. Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d infezione imputabili ad agenti causali soggetti a tale disposizione. La denuncia secondo la Direttiva dell Health Protection (Notification) Regulations 2010 non sostituisce l informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di alcuni tipi d infezione. Queste iniziative devono continuare. Nota: La linea guida dell Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt Jakob disease CJD da includere nel Notification Duties of Registered Medical Practitioners, e non al Notification Duties of Diagnostic Laboratories. Esistono accordi diversi in Scotland 103,104, Wales 105 e Northern Ireland 106 Traduzione a cura di Roberto Rescaldani, già primario del Laboratorio di Microbiologia e Virologia A.O. San Gerardo dei Tintori Monza. Collaboratori: Roberto Rossetti, già Primario del Laboratorio di Microbiologia, Ospedale Civile di Pistoia ASL 3 Monica Raggi, Dirigente di primo livello del Laboratorio di Microbiologia e Virologia A.O. San Gerardo dei Tintori di Monza I testi originali e le traduzioni sono disponibili sul Web APSI - Webmaster Sergio Malandrin, Dirigente di primo livello del Laboratorio di Microbiologia e Virologia A.O. San Gerardo dei Tintori di Monza Batteriologia Identificazione ID 16 Emissione no: 4 Data emissione Pagina: 27 di 34

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