L assicurazione della qualità nei laboratori che eseguono analisi nel comparto della microbiologia ambientale: i metodi di prova

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1 ANALISI IN MICROBIOLOGIA AMBIENTALE E RISULTATI DI PROVA 9 a e 10 a Prova Interlaboratorio ISS-UNICHIM L assicurazione della qualità nei laboratori che eseguono analisi nel comparto della microbiologia ambientale: i metodi di prova Francesca Anna Aulicino Istituto Superiore di Sanità Roma, 29 novembre 2005

2 Assicurazione di qualità tutte quelle azioni, pianificate e sistematiche, necessarie a fornire sufficiente sicurezza che un prodotto, procedimento o servizio risponda a prestabiliti requisiti di qualità Definizione ISO (Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione)

3 Assicurazione di qualità L assicurazione di qualità comprende: Il Controllo Analitico di Qualità (CAQ) La valutazione Esterna di Qualità (QE) CAQ: Controlli positivi, negativi, uso di Materiali di riferimento, ecc. QE: Prove interlaboratorio

4 Assicurazione di qualità: il programma Lo sviluppo di studi mirati al perseguimento dell obiettivo dell assicurazione di qualità si realizza mediante l attuazione di un PROGRAMMA DI ASSICURAZIONE DI QUALITÀ

5 PROGRAMMA DI ASSICURAZIONE DI QUALITÀ Il programma deve tener conto di. analisi del processo di lavoro fattori che influenzano il processo di lavoro priorità per l attuazione del programma In ogni programma è importante che tutto il personale sia reso consapevole e responsabile del proprio ruolo e abbia una chiara percezione dell importanza del coinvolgimento e della condivisione

6 Gli elementi di un PAQ PERSONALE (organigramma, compiti, capacità, formazione, ) AMBIENTI DI LAVORO (organizzazione del laboratorio, sicurezza,.) ATTREZZATURE (uso, manutenzione, taratura, registrazioni,.) MATERIALI (vetreria, filtri, acqua distillata, prodotti chimici, terreni di coltura: preparazione e controlli qualità, ) CAMPIONI (piani e siti di campionamento, campionamento, trasporto, ricezione, conservazione, ) METODI DI PROVA (scelta, istruzioni-protocollo, controlli di qualità )

7 I METODI DI PROVA I METODI DI PROVA POSSONO ESSERE DEFINITI COME Metodi Standardizzati quelli che riportano indicazioni complete e dettagliate per l analisi (composizione terreni, descrizione procedimento, analisi di conferma, espressione dei risultati) quelli con sufficienti garanzie per essere stati sottoposti a verifiche (procedure di validazione) che ne comprovano l affidabilità e l applicabilità. quelli forniti da.. ISO (International Standards Organization CEN (Comitato Europeo di Normalizzazione) IDF (International Dairy Federation) AOAC (Association of Official Analytical Chemists) Altre organizzazioni di standardizzazione di ogni paese come UNI (Ente Nazionale Italiano Unificazione)

8 I METODI DI PROVA I METODI POSSONO ESSERE DEFINITI COME Metodi normalizzati quelli emanati da enti di normazione (ISO, UNI, CEN, OMS, EPA, ecc) Metodi ufficiali quelli pubblicati o citati in legislazioni, G.U. nazionali o europee METODI non normati come.. Metodi interni Metodi basati sulla letteratura scientifica Metodi commerciali Per tutti i metodi è necessario che siano disponibili requisiti minimi di affidabilità (es. ripetibilità e riproducibilità). Ad esempio..

9 I METODI DI PROVA in relazione ai controlli ufficiali sui mangimi e alimenti. (Regolamento CE 882/2004) è riportato che i laboratori che partecipano a controlli ufficiali dovrebbero operare secondo procedure approvate internazionalmente o secondo norme di efficienza basate su criteri e usare metodi di analisi che siano stati convalidati nei limiti del possibile. Anche in altre norme..

10 I METODI DI PROVA come la UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2000 è riportato che Il laboratorio deve usare preferibilmente metodi pubblicati su norme internazionali, regionali o nazionali. Nel caso di utilizzo di metodi non normalizzati occorre una validazione appropriata prima del loro utilizzo Uno dei principali aspetti innovativi della ISO/IEC è quello relativo al fatto che prevede criteri più elastici ed articolati per la scelta dei metodi di prova, nei quali assume notevole valore la figura del responsabile del laboratorio

11 La scelta dei metodi di prova nella microbiologia del comparto idrico Per l isolamento e l enumerazione di microrganismi del comparto idrico sono disponibili molti metodi, alcuni dei quali specificati da normative. Tutti i metodi devono essere scelti seguendo criteri microbiologici precisi Anche nel caso di metodi previsti da normative i metodi devono essere sempre considerati una scelta del laboratorio... SCELTA significa accettare consapevolmente tutte le indicazioni da seguire e di cui si deve comprenderne appieno il significato.

12 Fattori implicati nella scelta dei metodi microbiologici Tipo e definizione del microrganismo da rilevare Tipo di campione e numero di microrganismi Esistenza di limiti per le quantità di microrganismi per i quali il campione è a norma Rapidità nella risposta Semplicità ed economicità del metodo Sicurezza nell esecuzione del metodo Possibilità del controllo di ogni fase del metodo I terreni di coltura

13 Il tipo di microrganismo da rilevare 1/2 Gruppi microbici di interesse per il comparto delle acque.. Eterotrofi Lieviti e muffe Microrganismi indicatori Patogeni e nelle normative..

14 Parametri microbiologici nelle normative del comparto acque 2/2 DL 31 (Acque potabili) 2001 E.coli, Enterococchi, CT, Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa, Colonie a 22 e 37 C DPR 470 (Balneazione) 1982 CT, CF, SF, Salmonella, Enterovirus Proposta di Direttiva Parlamento Europeo (Balneazione) 2004 E.coli, Enterococchi DL 152 Tutela delle acque dall inquinamento (1999) E.coli, Enterococchi, CT, CF, SF D.M.Ambiente n.185 (Riutilizzo acque reflue) 2003 E.coli, Salmonella Conferenza Stato Regioni (Piscine) 2003 E.coli, Enterococchi, Pseudomonas aeruginosa, CBT, Staphylococcus aureus

15 Tipo di campione e cariche microbiche 1/5 TIPO di CAMPIONE Acque sotterranee CARICA MICROBICA Scarsa-Media Acque superficiali Scarsa-Media Media-Alta Acque potabilizzate Liquami Fanghi Sedimenti Acque di piscine Scarsa Media-Alta Alta Media-Alta Scarsa-Media

16 Le tecniche in funzione del numero 2/5 Tecnica Spatolamento su agar Inclusione in agar MPN Concentrazione microbica Elevata MF MPN Media-Bassa

17 Le tecniche Pour plate e Spread plate 3/5 POUR PLATE Vantaggi: analisi di quantità di campione di 1-5mL Svantaggi: danni ai batteri per temperature non controllate del terreno disciolto da aggiungere al campione. Più difficile isolare le colonie cresciute per eventuali analisi di conferma. I batteri aerobi non sono propriamente facilitati nella crescita SPREAD PLATE Vantaggi: colonie ben isolabili Svantaggi: analisi di piccole quantità di campione (0,1mL) a meno di non aspettare molto tempo per il disseccamento della piastra. Più facili i fenomeni di contaminazione.

18 Il metodo MPN 4/5 Vantaggi: Rivitalizzazione dei microrganismi Svantaggi: Tempi lunghi, oneroso in quanto a lavoro e materiali, ma.. attualmente c è disponibilità di metodi con meno svantaggi di questo tipo

19 Il metodo della filtrazione su membrana 5/5 Si applica quando occorre concentrare un campione ma. il filtro si può occludere o può trattenere materiale particolato amorfo e bio-colloidale per cui si possono avere.. cambiamenti nella composizione dei nutrienti disponibili protezione dei microrganismi concorrenti dall effetto di sostanze inibitrici presenti nei terreni selettivi RISULTATO Si può bloccare la filtrazione Può essere cambiato l effetto di selezione del terreno di coltura utilizzato per favorire lo sviluppo di una definita flora microbica e possono svilupparsi microrganismi interferenti (vedi anche ISO )

20 Acqua destinata al consumo umano Parametri microbiologici e limiti 1/1 Acque distribuite Escherichia coli (c.r. e c.v.) Enterococchi (c.v.) Batteri coliformi (i. c.r.) Clostridium perfringens (i. c.r.) Colonie 22 C (i.) VALORI 0/100 ml 0/100 ml 0/100 ml 0/100 ml Senza variazioni anomale Acque imbottigliate Escherichia coli (c.r. e c.v.) Enterococchi (c.v.) Pseudomonas aeruginosa (c.r. e c.v.) Colonie 22 C (c.r.) Colonie 37 C (c.r.) Batteri coliformi (i. c.r.) VALORI 0/250 ml 0/250 ml 0/250 ml 100/ ml 20/ ml 0/250 ml c.r.=controllo di routine per la qualità delle acque ed efficacia dei trattamenti c.v.= Controllo di verifica per accertare se tutti i valori di parametro sono rispettati i.=parametri indicatori da ricercare in caso di inosservanza dei valori di parametro

21 Acqua destinata al consumo umano Parametri microbiologici e Metodi 1/2 Colonie a 22 C e a 37 C ISO 6222 = APAT-IRSA = ISTISAN Bozze 03 MU 956 = APAT-IRSA Batteri Coliformi a 37 C ISO = ISTISAN Bozze 03/3 (qualche diversità nelle conferme) MU 952/2 = APAT-IRSA 7010 A1 APAT-IRSA 7010 B = ISTISAN 03/1 APAT-IRSA 7010 C1= ISTISAN 03/2 Escherichia coli ISO Standard Test = ISTISAN 03/2 ISO Rapid Test = ISTISAN 03/3 APAT-IRSA 7030 B = ISTISAN 03/1

22 Acqua potabile Parametri microbiologici e Metodi 2/2 Enterococchi ISO =APAT-IRSA 7040 B ISO = MU 954/1 = APAT-IRSA 7040 C = ISTISAN 04 Clostridium perfringens DL 31 = ISTISAN 03/1 ISO/CD = ISTISAN 03/2 (qualche diversità nelle conferme) Pseudomonas aeruginosa (imbottigliate) UNI EN = ISTISAN 04 (qualche diversità nelle conferme)

23 I terreni di coltura 1/13 I terreni di coltura possono essere (UNI 10674:2002) ad ampio spettro (completi): offrono condizioni nutrizionali che favoriscono la crescita di una grande varietà di microrganismi (es. eterotrofi) minimi: con solo gli elementi di base per lo sviluppo microbico di arricchimento: favorenti lo sviluppo di un determinata specie selettivi: con sostanze inibitrici (es. antibiotici), coloranti marcatori e nutrienti, supportanti la crescita di range ristretti di microrganismi

24 Esempio di scelta di terreni/metodi di analisi 2/13 ETEROTROFI/COLONIE a C Per acque naturali Per studiare la facies microbica occorrono terreni poveri in nutrienti (R2A), temperature di incubazione vicine a quelle naturali, tempi di incubazione protratti e tecnica dello spatolamento su piastra Per acque potabili Occorrono terreni ricchi in nutrienti (PCA, YEA, ecc), tempi di incubazione brevi, temperature prefissate, tempi stabiliti e tecnica dell inclusione in agar, che permette l analisi di 1-2 ml di campione. Ma se per le acque potabili occorre verificare fenomeni di ricrescita, allora la scelta va indirizzata a terreni diversi (es. (R2A o altro) e metodi di spatolamento e semi-qualiquantitativi

25 Esempio di scelta di terreni/metodi di analisi 3/13 PCA, YEA, R2A: sono diversi? PCA= Triptone (5g/l), estratto di lievito (2,5g/l), glucosio (1g/l), agar (9g/l) YEA= Triptone (6g/l), estratto di lievito (3g/l), agar (10-20g/l) R2A= Polipeptone (0,5g/l), estratto di lievito (0,5g/l), idrolizzato acido di caseina (0,5g/l), glucosio (0,5g/l), amido solubile (0,5g/l), fosfato bipotassico (0,3g/l), solfato di magnesio (0,024g/l), sodio piruvato (0,3g/l), (0,5g/l), agar (15g/l) PCA e YEA possono essere comparabili. R2A non è adatto a rilevare eterotrofi in H 2 0 potabili e tanto meno a rilevare colonie coltivabili a 22 e 36 C, le quali comprendono funghi e lieviti

26 UN PROBLEMA IN CAMPO IDRICO POTABILE I MICRORGANISMI INJURED 4/13 Una percentuale di microrganismi enterici riesce a sopravvivere ai trattamenti di disinfezione. Si tratta di una popolazione microbica danneggiata (injured) generalmente, non isolabile sui terreni di coltura idonei. I batteri injured possono incontrare condizioni idonee di sviluppo nelle pellicole biologiche così comuni nelle reti idriche e riacquistare le loro normali capacità di crescita Microrganismi enterici patogeni injured possono sopravvivere in reti idriche e creare problemi circa l utilizzo delle acque La possibile presenza di microrganismi indicatori (es. E.coli) nello stato di injured deve essere valutata attentamente

27 Esempio di scelta di terreni/metodi di analisi: indicatori di contaminazione fecale 5/13 La rilevazione di indicatori di contaminazione fecale come Escherichia coli richiede l uso di terreni selettivi, temperature di incubazione di C e tempi di incubazione di ore La rilevazione di indicatori di fecalizzazione, come E.coli, in uno stato injured, richiede l uso di terreni di coltura che li rivitalizzino e supportino idoneamente, di temperature di incubazione differenziate e/o di tempi di incubazione prolungati

28 UNI EN ISO : 2002 Definizioni di E.coli e coliformi 6/13 Standard test Coliformi: batteri aerobici capaci, a 36± 3 C, di produrre acidi su terreni selettivi contenenti lattosio in 21 ± 3h ed ossidasi negativi Escherichia coli: coliformi che producono indolo da triptofano a 44 ± 0,5 C in 21 ± 3h Rapid test Escherichia coli: batteri resistenti ai sali di bile e che producono indolo da triptofano a 44 ± 0,5 C in 21 ± 3h

29 UNI EN ISO : 2002 Caratteristiche dei metodi 7/13 Metodo standard rileva coliformi in 21-24h ed E.coli in 2-3 giorni bassa selettività e idoneo per batteri injured utilizzabile solo per acque potabili disinfettate o, in generale, con basse cariche batteriche può favorire crescita di fondo interferente con l enumerazione di coliformi ed E.coli in H 2 0 non disinfettate o H 2 0 di pozzi poco profondi Metodo rapido (opzionale) rileva E.coli in 21-24h Utile se occorrono risposte rapide

30 Metodo UNI EN ISO :2002 COLIFORMI ed Escherichia coli Test standard 8/13 TERRENI DI COLTURA Lactose TTC agar sodio eptadecilsolfato (Isolamento) Lattosio, peptone, estratto di lievito, estratto di carne, blu di bromotimolo, TTC, Tergitol, agar e H 2 O Brodo al triptofano (conferma indolo +) Tryptone Soy agar (TSA) (conferma ossidasi -) *Nutrienti *indicatori *Inibitore flora concorrente (Gram+)

31 Metodo UNI EN ISO : 2002 COLIFORMI ed Escherichia coli Test standard 9/13 ESECUZIONE ISOLAMENTO 1. Filtrare e porre la membrana su Lactose TTC-Tergitol 2. Incubare a 36 ± 2 C per 21 ± 3h Coliformi= colonie gialle nel terreno sotto membrana CONFERMA Prova dell ossidasi e dell indolo ossidasi - = Coliformi ossidasi - e indolo + = Escherichia coli

32 LE COLONIE SU TERRENI CON TERGITOL-TTC Test standard 10/13 Il lattosio, fermentato da coliformi ed Escherichia coli, acidifica il terreno (acidi e aldeidi) e, in presenza dell indicatore Blu di bromotimolo, si producono COLONIE CON COLORE GIALLO in terreno sotto membrana (coliformi, E. coli) Il TTC, da coliformi e non da E.coli, è ridotto e trasformato in FORMAZANO (colorante acido azoico insolubile) che si accumula in granuli solo in coliformi COLONIE ROSSE, ARANCIO (coliformi, no E.coli).poi ossidasi - = coliformi ossidasi - e indolo+ = E.coli

33 Metodo UNI EN ISO / 2002 COLIFORMI ed Escherichia coli Test rapido 11/13 Il metodo è idoneo a rilevare microrganismi injured ed utilizza TSA, terreno di uso generale e senza carboidrati aggiunti TBA sviluppato per la determinazione di E.coli in alimenti da Anderson e Baird-Parker nel Permette Velocità di risposta Recupero di ceppi che fermentano poco il lattosio e che non producono gas

34 Metodo UNI EN ISO : 2002 COLIFORMI ed Escherichia coli Test rapido 12/13 ESECUZIONE ISOLAMENTO 1. Filtrare e porre la membrana su TSA 2. Incubare a 36 ±2 C per 4-5h e poi.. 3. Trasferire la membrana su TBA a 44 ±0,5 C per 19-20h CONFERMA 1. Trasferire la membrana su carta da filtro saturata con il reagente per l indolo (p-dimetilamminobenzaldeide+ HCl) 2. Porre sotto luce UV per minuti Colonie rosse = Escherichia coli

35 LE COLONIE SU TERRENI CON TSA e TBA 13/13 Il terreno TSA è necessario per la rivitalizzazione di E.coli injured Il terreno TBA permette lo sviluppo di ceppi di E.coli che fermentano poco o tardivamente il lattosio. La temperatura di incubazione (44 C) ed i sali di bile sopprimono la flora interferente indolo +. E.coli sul terreno TBA produce indolo a partire da Triptofano (triptone). La produzione di indolo è evidenziata dal reagente per l indolo. L esposizione ad UV serve a rendere la reazione colorata più nitida. COLONIE ROSSE/ARANCIO (E.coli)

36 I metodi di prova ed i controlli di qualità

37 Gli aspetti trattati nei metodi di prova Nei metodi di prova sono fornite indicazioni per l esecuzione delle analisi, ma anche molti altri aspetti, quali. il campionamento (se effettuato dal laboratorio), il trasporto, la conservazione e la preparazione del campione da sottoporre alle analisi una stima dell'incertezza dì misura (quando appropriato) tecniche statistiche per l'analisi dei dati di prova ed altro Le indicazioni possono essere più o meno dettagliate e ciò è in relazione al tipo di metodo.

38 La descrizione dei metodi di analisi: i diversi capitoli (ISO/TC 34 n.7667) Titolo Scopo e campo di applicazione Riferimenti Definizioni Principio e reazioni Diluenti, terreni di coltura e altri prodotti Apparecchiature e vetreria Campionamento Preparazione del campione Preparazione dei terreni Procedimento Espressione dei risultati Precisione Registrazione delle prove INDICAZIONI PER IL CONTROLLO DI QUALITA

39 Sistemi di controllo della qualità Livelli di controllo della qualità I livello = autocontrollo (tarature apparecchiature, controlli qualità terreni e metodi, ). Esamina la responsabilità del tecnico che esegue le analisi ed è frequente. II livello = (ripetibilità e riproducibilità intralaboratorio, ). Verifica che tecnici diversi o attrezzature differenti producano risultati simili. E meno frequente. III livello = Valutazioni di qualità esterne. Analizza la responsabilità della gestione del laboratorio per garantire una standardizzazione interlaboratoriale.

40 I Livello: autocontrollo 1/2 I metodi microbiologici sono scarsamente robusti perché i microrganismi non sono distribuiti omogeneamente nel campione e nella porzione esaminata. Durante la loro esecuzione diversi fattori li influenzano, tra essi, alcuni sono: terreni colturali, soluzioni e altri materiali utilizzati condizioni di incubazione (tempi e temperature) competenza del personale

41 I Livello: autocontrollo 2/2 La disomogeneità dei campioni è immodificabile ma si possono controllare gli effetti negativi derivanti dal sistema di rilevazione, formando adeguatamente il personale gestendo adeguatamente la sterilizzazione dei materiali avendo conoscenza approfondita delle caratteristiche dei locali adibiti alle prove microbiologiche e delle apparecchiature e tenendole sotto adeguato controllo verificando l idoneità dei reagenti, dei terreni di coltura, dei metodi analitici verificando che i criteri di accettabilità dei risultati siano soddisfatti gestendo adeguatamente i materiali di riferimento.

42 Assicurazione di Qualita e uso dei materiali di riferimento 1/2 I materiali di riferimento microbiologici (RM) sono costituiti tipicamente da 1. Ceppi batterici e micetici di collezione forniti da Enti di rilevanza internazionale (ATCC, NCTC, ecc.) identificati, tipizzati e puri. Classificati come CRM (Certified Reference Material). 2. Ceppi batterici e micetici selvaggi, isolati da campioni trattati nei laboratori e identificati su base biochimica, sierologica, ecc. Utili perchè possono riprodurre caratteristiche dei microrganismi naturali. Classificati come RM (Reference Material). 3. Campioni preparati con stipici microbici per simulare campioni naturali.

43 Assicurazione di Qualita e uso dei materiali di riferimento 2/2 I ceppi microbici vanno gestiti in qualità: conservati ed usati correttamente (es. non sono da usare sub-aliquote di aliquote, ecc.), verificati periodicamente per caratteristiche di purezza e di riferimento L uso dei ceppi microbici è destinato. alla verifica dell idoneità di attrezzature, terreni di coltura e reagenti, metodi, prestazioni degli operatori nel tempo, accuratezza dei risultati, ecc.. a valutazioni di ripetibilità, riproducibilità intralaboratorio. a valutazioni di qualità esterne interlaboratorio, circuiti.

44 Controllo di qualita dei terreni di coltura 1/8 In ogni laboratorio devono essere disponibili Istruzioni Operative (IO) che descrivano le modalità di esecuzione del Controllo di Qualità dei terreni colturali. Esse devono contenere anche indicazioni relative alla preparazione dei ceppi microbici usati per tali verifiche o i riferimenti ad istruzioni operative per i ceppi.

45 Controllo di qualita dei terreni di coltura 2/8 I test Sterilità: verifica (su ogni lotto) della sterilità del terreno Fertilità o Produttività: verifica della capacità dei terreni di permettere la crescita dei microrganismi ricercati Selettività: verifica della capacità dei terreni di inibire la crescita di specie interferenti supportando lo sviluppo delle specie da rilevare Potere differenziale: verifica della capacità del terreno di evidenziare, nell ambito delle specie microbiche che vi possono crescere, le caratteristiche morfologico-culturali delle colonie differenziatesi

46 Controllo di qualita dei terreni di coltura 3/8 LE FREQUENZE I Test di sterilità andrebbero eseguiti su ogni lotto di terreno coltura incubando un numero stabilito di unità scelte a caso (piastre, provette con terreno liquido,..) alle temperature previste per l utilizzo dei terreni stessi e verificando l assenza di crescita di microrganismi Per i Test di fertilità e selettività il laboratorio deve stabilirne la frequenza sulla base delle proprie esigenze (es. lotti di grosse dimensioni, lotti di terreni preparati a intervalli lunghi, ecc.)

47 Controllo di qualita dei terreni di coltura 4/8 ESEMPIO di TEST di Fertilità e di Selettività ESECUZIONE 1. Preparare colture in fase stazionaria dei ceppi di riferimento in Brain-Heart o Nutrient Broth. 2. Preparare piastre del terreno di prova e piastre di controllo non selettive (es. TSA) e suddividerle in quadranti in modo che su ciascuna piastra si evidenzino quattro sezioni. 3. Sulle piastre (controllo e prova) eseguire, con un ansa da 1μl, 5 strisci paralleli per quadrante con i ceppi di riferimento senza flambare o ricaricare l ansa ed uno striscio centrale, poi incubare.

48 Controllo di qualita dei terreni di coltura 5/8 TEST di Fertilità e di Selettività LETTURA E VALUTAZIONE I risultati sono valutati per assenza/presenza di crescita sugli strisci. Ad ogni linea si associa un valore (es.0,2-5) e a quella centrale ad es Il punteggio max per piastra sarebbe quando tutte le linee dei 4 quadranti e la linea centrale mostrassero crescita. La valutazione della crescita è riportata come indice di crescita assoluta (AGI). Il test di fertilità/selettività è favorevole se il valore AGI del microrganismo testato è quanto più vicino possibile a quello di riferimento. Il test effettuato con un ceppo che non deve crescere su un terreno selettivo è favorevole se il valore AGI è il più lontano possibile da quello di riferimento Fertilità: AGI 80 Selettività: AGI<20

49 Controllo di qualita dei terreni di coltura 6/8 ESEMPIO CON I CEPPI Nel caso si volesse determinare la fertilità di Tergitol-TTC per E.coli occorrerebbe effettuare le prove prima descritte con un ceppo di E.coli saggiandolo su TTC-Tergitol (Test) e su TSA (controllo). Quanto più elevato è l indice di crescita assoluta (AGI) su TTC-Tergitol per E.coli (es. AGI 80) tanto più la fertilità è confermata. Il valore AGI dovrebbe essere vicino il più possibile a quello ottenuto su TSA. Per determinare la selettività di Tergitol-TTC occorrerà valutarne la crescita per E.coli (che vi cresce) e per Staphylococcus aureus (che non vi cresce). Occorre anche verificare la crescita dei due ceppi in un terreno non selettivo. L indice di crescita assoluta (AGI) su TTC-Tergitol per E.coli deve essere elevato, mentre quello per Staphylococcus aureus deve essere 0 o molto vicino a 0.

50 Controllo di qualita dei terreni di coltura 7/8 TEST di Selettività: procedura quantitativa Il recupero dell organismo bersaglio e la capacità inibente verso gli organismi interferenti (organismi non bersaglio) possono essere controllati anche con procedure quantitative. 1. Preparare una brodocoltura di ceppo bersaglio ed una di ceppo non bersaglio, diluendole in modo da avere conte di unità. 2. Le sospensioni vanno seminate sul terreno di controllo e su un terreno non selettivo ed incubate. 3. Una volte cresciute si contano le colonie dei due ceppi sui terreni di coltura (controllo e non selettivo). 4. Il recupero dell organismo bersaglio deve essere almeno il 66% del risultato ottenuto sul terreno non selettivo. L organismo non bersaglio non deve crescere sul terreno selettivo.

51 Controllo di Qualita dei terreni di coltura 8/8 Esempi di microrganismi usati per controllare la capacità selettiva di terreni di coltura TERRENO DI COLTURA Lattosio TTC Tergitol Slanetz-Bartley MICRORGANISMO BERSAGLIO E.coli Enterococcus sp. MICRORGANISMO NON BERSAGLIO Ps. fluorescens E.coli

52 Controllo di Qualita di un metodo analitico 1/4 Il Controllo di Qualita si realizza monitorando le prestazioni del laboratorio nel tempo con Uso di campioni di bianco Uso di controlli positivi Uso di controlli negativi Ripetizione delle prove impiegando di ceppi di riferimento Questo tipo di controlli attualmente si sta sviluppando molto ed è da prevederne un forte sviluppo in futuro

53 Controllo di Qualita di un metodo analitico 2/4 Uso di campioni di bianco Quantità di H 2 O dist./deion. sterile uguali a quelle dei campioni da analizzare (100mL, 2mL, ecc.) si sottopongono alle stesse procedure analitiche dei campioni da analizzare L assenza di microrganismi nel campione di bianco evidenza che...terreni, materiali sono idonei in quanto a sterilità, ecc..non sono avvenute contaminazioni secondarie derivate da inidonee condizioni ambientali o da errori dell operatore

54 Controllo di Qualita di un metodo analitico 3/4 Uso di controlli positivi e negativi Si attuano analizzando con i metodi in esame campioni addizionati con organismi bersaglio (controlli positivi) e organismi non bersaglio (controlli negativi) Esempi di ceppi microbici da usare per il controllo di qualità: TERRENO M-Endo agar CONTROLLO POSITIVO E.coli CONTROLLO NEGATIVO St.aureus King A medium Ps.aeruginosa Tipo A Ps.fluorescens

55 Controllo di Qualita di un metodo analitico 4/4 Ripetizione delle prove La ripetizione delle prove consiste nell analizzare: campioni addizionati di cariche microbiche note, aliquote dello stesso campione inserite negli esami giornalieri di routine (campioni civetta) campioni analizzati con metodi diversi Deve essere verificato che la variabilità dei risultati ottenuti nell ambito di questo tipo di controllo di qualità (verifica della competenza dell operatore) sia compatibile con il criterio di accettabilità prefissato. La eventuale non compatibilità deve portare a ricercarne le cause ed a sanarle (Non Conformità e Azioni Correttive).

56 Espressione dei risultati delle prove 1/6 I risultati delle prove vanno espressi secondo modalità indicate nel metodo stesso e con espressione sull incertezza di misura del dato ottenuto. L intervallo di confidenza o di fiducia (che esprime l incertezza di misura), che caratterizza la distribuzione statistica del microrganismo nel campione, è necessario per la validità di un risultato (ottenuto da una prova o da più prove). Nel caso di valori di conteggi <15 si possono considerare valori riportati in tabelle apposite sia per prove condotte in singolo che per prove condotte in doppio. Indicazioni su come effettuare il calcolo del valore da riportare al volume di riferimento del campione e il calcolo dell intervallo di confidenza, che esprime l incertezza di misura, sono riportate nella norma ISO 7218:1996 e nella norma UNI 10674:2002

57 Espressione dei risultati delle prove 2/6 Formule per metodi di analisi che non prevedono diluizioni Formula dell intervallo di confidenza nel caso di conteggi ottenuti da due prove in parallelo con valori > 15 C C m ± 1, 96 C n Cm=media dei conteggi n=numero delle piastre m ISO 7218:1996. Microbiology of food and animal feeding stuffs- General rules for microbiological examinations

58 Espressione dei risultati delle prove 3/6 Formula dell intervallo di confidenza nel caso di conteggi ottenuti da due prove in parallelo con valori > 15 (UNI 10674:2002) C C m ± 2 C n m Che approssimando dà C C m ± 1, 4 C m Cm=media dei conteggi n=numero delle piastre UNI 10674:2002. Acque destinate al consumo umano. Guida generale per le determinazioni microbiologiche

59 Espressione dei risultati delle prove 4/6 Quando si eseguono due prove in parallelo occorre anche tener conto della compatibilità dei due conteggi successivi tramite la Equazione per la verifica della compatibilità delle conte: = C k 1 p + C 2 C 1 C 2 Kp= fattore di copertura C1 e C2=Conteggi

60 Espressione dei risultati delle prove 5/6 Criteri di valutazione del fattore di copertura sperimentale Kp (UNI 10674:2002) Kp<2,0 2,0<Kp<2,6 Kp>2,6 I conteggi sono accettabili e il risultato può essere espresso come media delle due prove La differenza tra i conteggi è considerata critica e, prima fare la media, occorre approfondire La differenza tra i conteggi è considerata anomala e le prove in parallelo devono essere ripetute

61 Espressione dei risultati delle prove 6/6 Esempio di calcolo di Intervallo di fiducia Conteggi di due piastre in parallelo: C 1 = 20 C 2 =29 K p =1,3 (è <2, quindi i conteggi sono accettabili e si può calcolare la media) Media approssimata= 25 Intervallo di fiducia: C= 25 ± 1,4 25= 25± 1,4 x5 = 25± 7 Limiti dell intervallo di fiducia Limite superiore= 32 Limite inferiore= 18

62 Parametri fondamentali per valutare l affidabilita di un metodo microbiologico 1/2 ACCURATEZZA = grado di concordanza tra il valore medio di una serie di misure e il valore vero (dedotto con sistemi diversi, ritenuti affidabili). E espressa come percentuale del valore vero, che in microbiologia è molto difficile da determinare: i microrganismi sono in continua trasformazione in quanto a vitalità e trasformazione. PRECISIONE = grado di concordanza tra risultati ottenuti in numerose prove indipendenti sotto condizioni definite, applicando uno stesso metodo analitico, su uno stesso materiale da saggio. Include Ripetibilità = concordanza tra risultati di uno stesso operatore Riproducibilità = concordanza tra risultati di operatori diversi o laboratori diversi

63 Parametri fondamentali per valutare l affidabilita di un metodo microbiologico 2/2 SENSIBILITA = Probabilità, espressa come %, che un risultato positivo sia effettivamente positivo. Aumenta col diminuire dei falsi negativi: Se= (positivi al metodo test/positivi al metodo di rif.)x100 Nell ambito della sensibilità il limite di determinazione è il livello più basso possibile di rilevazione del microrganismo indagato. SPECIFICITA = Probabilità, espressa come %, che un risultato negativo sia effettivamente negativo. Aumenta col diminuire dei falsi positivi Sp= (negativi al metodo test/negativi al metodo di rif.)x100 PRATICABILITA E APPLICABILITA PRATICABILITA E APPLICABILITA. I metodi devono essere fattibili, quindi devono utilizzare reagenti e attrezzature commercialmente disponibili oltre ad avere un costo contenuto.

64 LE PROVE INTERLABORATORIO 2005

65 PROVE INTERLABORATORIO 2005 Quantità attese dei parametri microbiologici (UFC) 9 CICLO Campione 1 Coliformi totali: 8 (5,7)/100 ml E.coli: 0/100 ml 10 CICLO Campione 1 Coliformi totali: 11(7,9) /100mL E.coli: 0/100mL Campione 2 CBT 22 C: 23 (6)/mL CBT 36 C: 23 (7)/mL Campione 2 CBT 22 C: 11 (7,4)/mL CBT 36 C: 11 (9)/mL Campione 3 Ps. aeruginosa: 72 (28,9)/250 ml Enterococchi: 0/100 ml Cl. perfringens: 0/100mL Campione 3 Ps. aeruginosa: 39(34,3)/250 ml Enterococchi: 0/100 ml Cl. perfringens: 0/100mL

66 Risultati anomali 10 Ciclo Laboratori con falsi positivi e falsi negativi 33 Lab/186 totali LABORATORI 14 (falsi neg) 11 (falsi neg) 7 (falsi neg) 3 (falsi pos) 8 (falsi pos) 7 (falsi neg) ANALITA Conte Tot. 22 C Conte Tot. 36 C CT E.coli Enterococchi Ps.aeruginosa

67 Risultati anomali 10 Ciclo Laboratori con falsi positivi e falsi negativi 35 Lab/186 totali LABORATORI 14 (falsi neg) 11 (falsi neg) 7 (falsi neg) 3 (falsi pos) 8 (falsi pos) 7 (falsi neg) 4 (falsi pos) ANALITA Conte Tot. 22 C Conte Tot. 36 C CT E.coli Enterococchi Ps.aeruginosa Cl.perfringens

68 Risultati anomali : FALSI NEGATIVI 10 Ciclo Laboratori con falsi negativi e analita ANALITA VALORE ANALITA ATTESO TOT LAB valore=0 CODICE LABORATORIO Colonie a 22 C 11 (7,4)/mL , 010, 022, 092, 099, 244, 352, 390, 412, 428, 433, 454, 466, 481 Colonie a 36 C 11 (9)/mL , 092, 101, 216, 307, 352, 375, 412, 428, 466, 481 Coliformi a 37 C 11(7,9) /100mL 7 118, 244, 364, 403, 428, 438, 456 Ps. aeruginosa 39(34,3)/250 ml 7 089, 099, 314, 354, 428, 454, 485

69 Risultati anomali : FALSI POSITIVI 10 Ciclo Laboratori con falsi positivi e analita ANALITA VALORE ANALITA ATTESO TOT LAB Valore anomalo CODICE LABORATORIO E.coli , 345, 471 Enterococchi , 214, 244, 307, 364, 405, 448, 471 Cl.perfringens , 370, 408, 496

70 Risultati anomali : FALSI NEGATIVI 10 Ciclo 27 laboratori hanno dato false negatività: 17 hanno avuto problemi con un solo analita 9 hanno avuto problemi per due analiti insieme 1 ha avuto problemi per 4 analiti insieme 13 laboratori hanno dato false positività: 11 hanno avuto problemi per un solo analita 2 hanno avuto problemi per due analiti insieme

71 Possibili spiegazioni per falsi negativi Conteggi a 22 e a 37 C (18 lab hanno ottenuto 0) Nel campione 2 analizzato c era Ps.aeruginosa Possibili danni alla lenticula n 2 Non corretta esecuzione del protocollo preparazione campione (la lenticula è stata aggiunta?) Numero troppo basso di analita nel campione da testare Errori nella esecuzione del metodo: Possibile danno ai batteri da temperatura del terreno disciolto non controllata secondo criteri di qualità Uso di terreni non fertili Ognuna di queste ipotesi è rafforzata nel caso di quei laboratori che hanno avuto problemi contemporaneamente per i conteggi alle due diverse temperature (7 Lab)

72 Possibili spiegazioni per falsi negativi Coliformi a 37 C (7 lab hanno ottenuto 0) Nel campione 1 analizzato c era Klebsiella aerogenes Possibili danni alla lenticula n 1 Non corretta esecuzione del protocollo preparazione campione (la lenticula è stata aggiunta?) Numero troppo basso di analita nel campione da testare (?) Errori nella esecuzione della prova: Uso di terreni non fertili Uso di terreni troppo selettivi (4 lab hanno usato m-endo agar Les) Colonie atipiche che non sono state confermate (4 lab non hanno eseguito le prove di conferma) Prove di conferma eseguite male (ossidasi)

73 Possibili spiegazioni per falsi negativi Ps.aeruginosa (7 lab hanno ottenuto 0) Nel campione 3 analizzato c era Ps.aeruginosa e qualche cellula di Klebsiella aerogenes Possibili danni alla lenticula n 2 Non corretta esecuzione del protocollo preparazione campione (la lenticula n 2 è stata aggiunta al campione 2? è stata aggiunta l aliquota diluita del campione 2 per costruire il campione 3? La lenticula si è sciolta*?)) Errori nella esecuzione della prova: Uso di terreni non fertili Colonie atipiche che non sono state confermate (4 lab non hanno eseguito le prove di conferma) Prove di conferma eseguite male *1 lab scrive nelle osservazioni che la lenticula si è sciolta male

74 Possibili spiegazioni per falsi positivi 3 lab hanno rilevato E.coli nel campione 1 che conteneva Klebsiella aerogenes Errori nella esecuzione della prova: Errori nella lettura delle piastre o errori nella fase di conferma I 3 lab hanno usato lo stesso terreno ( mfc agar) e non indicano le prove di conferma (come prove di conferma indicano altri test ).

75 Possibili spiegazioni per falsi positivi 8 lab hanno rilevato Enterococchi nel campione 3 Nel campione 3 analizzato c era Ps.aeruginosa e qualche cellula di Klebsiella aerogenes Errori nella esecuzione della prova: Contaminazione secondaria delle piastre* Errori nella lettura delle piastre, errori nella interpretazione della prova di conferma, errori nella fase di conferma o conferma non effettuata** * *1 Laboratorio ha enumerato circa 60 colonie di enterococchi **4Lab/8 non la effettuano; 2 lab indicano altri test senza altra specifica

76 Possibili spiegazioni per falsi positivi 4 lab hanno rilevato Cl.perfringens nel campione 3 Nel campione 3 analizzato c era Ps.aeruginosa e qualche cellula di Klebsiella aerogenes Errori nella esecuzione della prova: Contaminazione secondaria delle piastre* Errori nella lettura delle piastre, errori nella interpretazione della prova di conferma, errori nella fase di conferma o conferma non effettuata * Pseudomonas è strettamente aerobio

77 Attenzione... Risultati anomali Conclusioni... alle vials... alla fase di preparazione dei campioni... ai fenomeni di contaminazione secondaria alla fase della lettura... alla corretta esecuzione del metodo comprese le prove di conferma che portano alla esclusione di microrganismi diversi da quelli ricercati o alla loro conferma e per finire.

78 ..Grazie per la partecipazione Auguri per il prossimo ciclo di prove Ma soprattutto AUGURI per le prossime festività