Analisi delle correnti di Na secondo Hodgkin e Huxley. Prof. Mauro Toselli Dip. Biologia e Biotecnologie Università di Pavia

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1 Analisi delle correnti di Na secondo Hodgkin e Huxley Prof. Mauro Toselli Dip. Biologia e Biotecnologie Università di Pavia Scuola di Fisiologia e Biofisica 2015 Società Italiana di Fisiologia Pavia, 30/6/2015

2 E Na =+52 V La corrente di Na

3 Percé isurare le correnti di Na? Lo scopo di isurare le correnti di Na è quello di poter ottenere da esse inforazioni circa la pereabilità della ebrana allo ione Na + (ovvero circa il coportaento dei canali ionici del Na. DOMANDA: È lecito assuere ce per la corrente di Na valga la legge di O e ce quindi I Na possa essere essa in rapporto con la conduttanza g Na secondo la relazione I Na = g Na (V -E Na anzicé con la pereabilità P Na, secondo l assai più coplicata equazione di GHK per la corrente? 2 2 VF Ci Ce exp zf V / RT I Pz RT 1 exp zf V / RT

4 La isura della corrente istantanea perette di stabilire se l utilizzo della legge di O è lecito per lo studio della corrente di Na I Na = g Na (V-E Na

5 La relazione I/V istantanea per il Na è approssiativaente lineare, coe previsto dalla legge di O Pertanto g Na può essere utilizzata coe isura della pereabilità della ebrana al sodio ovvero della frazione di canali del Na aperti. I Na = g Na (V-E Na g Na = I Na /(V-E Na

6 Il odello delle gates secondo Hodgkin e Huxley Diagraa sceatico di un canale voltaggio-dipendente rappresentato coe una proteina transebranaria con un poro acquoso. Sono indicate le regioni funzionali essenziali: la gate, il sensore del voltaggio e il filtro di selettività.

7 Assunzioni di base per il odello delle gates La proteina-canale va incontro a cabiaenti conforazionali in risposta ad una variazione del capo elettrico a cavallo della ebrana. In conseguenza di tali cabiaenti conforazionali la proteina-canale passerà da uno stato ciuso, ipervio agli ioni, ad uno stato aperto pervio agli ioni, o vice versa. Qualora la transizione tra i due stati ciuso e aperto sia regolata da un unica gate, ovvero la transizione avvenga traite un unico cabiaento conforazionale della proteina-canale, lo stato di apertura (o ciusura del canale si identifica con lo stato in cui si trovano la gate e la particella di gating (sensore del voltaggio in quell istante. Ciò significa ce per un canale ce possiede un unica gate di attivazione la reazione tra stato ciuso e aperto del canale è espriibile nel seguente odo: 1 C O ovvero 1 - p (V (V p

8 Assunzioni di base per il odello delle gates 2 La reazione tra stato non perissivo (ciuso e perissivo (aperto della singola gate segue una cinetica del prio ordine, C O ed è quindi descrivibile dalla seguente equazione differenziale: dp dt (1 p p Basato su queste assunzioni, il odello delle gates fornisce una descrizione sia della voltaggio-dipendenza ce della tepo-dipendenza dei canali ionici.

9 Quando il potenziale di ebrana verrà antenuto ad un certo valore per un tepo sufficienteente lungo, la reazione cinetica raggiungerà l equilibrio (o stato stazionario. Allo stato stazionario sarà: e quindi: LA REAZIONE ALL EQUILIBRIO dp dt p( t p o ( 1 p p p 0 CINETICA DELLA REAZIONE Invece, l andaento teporale con cui lo stato stazionario verrà raggiunto sarà descritto dalla seguente funzione esponenziale, ce è una soluzione dell equazione differenziale di partenza p( t p ( p po exp Dove p è il valore di p allo stato stazionario e p o è il valore di p a t=0 e in cui la costante di tepo è in relazione con le due costanti di velocità e nel seguente odo: 1 t

10 RIASSUMENDO: p 1 OVVERO: p / ( 1 p / Pertanto, ricavando sperientalente i valori di p (V e di (V, è possibile ottenere le costanti di velocità (V e (V, ce ci perettono di descrivere quantitativaente le caratteristice di tepo-dipendenza e voltaggio-dipendenza del canale. C O

11 I concetti appena espressi verranno ora utilizzati per una analisi quantitativa del canale del Na da un punto di vista biofisico

12 Separazione dell attivazione dall inattivazione Sostanza Agenti ce eliinano l inattivazione dei canali del Na 0 V Azione Pronasi -80 V Tripsina N-brooacetaide (NBA Acido sulfonico 2,4,6-trinitrobenzene (TNBS 2-2 -acido disulfonico 4-acetaide-4-isotiocianostilbene (SITS tossine di scorpione e celenterato ph<<7 ph>>7 Intracell. Intracell. Intracell. Intracell. Intracell. extracell-. Intracell. C O I

13 L inattivazione del canale del Na Meccaniso ball and cain

14 Studio dell attivazione allo stato stazionario delle correnti di Na Riozione dell inattivazione per trattaento con pronasi C O

15 Secondo il odello proposto da H&H l attivazione dei canali del Na sarebbe ediata dall apertura di tre porte ( particelle di gating secondo la terinologia utilizzata dai due autori uguali e indipendenti Ciascuna porta di attivazione del canale del Na segue una cinetica del prio ordine C O 1 - descrivibile dalla seguente equazione differenziale: d dt (1 (V (V

16 La soluzione di tale equazione allo stato stazionario (t è: Mentre, l andaento teporale con cui lo stato stazionario verrà raggiunto sarà descritto dalla seguente funzione esponenziale, ce rappresenta una soluzione dell equazione differenziale ( t ( o exp t Dove è il valore di allo stato stazionario e o è il valore di a t=0 e in cui la costante di tepo sono in relazione con le due costanti di velocità e nel seguente odo: 1

17 Calcolo di in assenza di inattivazione (pronasi Riuovendo l inattivazione è possibile calcolare i valori di I Na e quindi ance di g Na allo stato stazionario I Na =g Na (V-E Na e g Na =I Na /(V-E Na dove g Na = G Na 3,essendo G Na è il valore assio della conduttanza allo stato stazionario, ce viene raggiunto a valori olto depolarizzanti di potenziale, quando praticaente tutti i canali del Na presenti in ebrana sono aperti, e 3 è la probabilità di avere tutte e tre le gates dell attivazione conteporaneaente aperte allo stato stazionario Quindi: 3 =g Na /G Na da cui si ricava ce: = 3 (g Na /G Na

18 Calcolo di in assenza di inattivazione (pronasi Si parte da un potenziale di olding piuttosto negativo, ad es. -70 V, e si depolarizza la ebrana a vari potenziali per diversi s, coe nell esepio in figura; Per la corrente di Na, è calcolabile interpolando l andaento teporale di g Na, ottenuto ai vari potenziali in depolarizzazione, con una funzione esponenziale elevata alla terza potenza del tipo y C A A B exp tt/ / 3 L andaento della conduttanza rispeccia l andaento della probabilità di apertura del canale

19 Calcolo di in assenza di inattivazione (pronasi Protocollo alternativo per calcolare a quei valori di potenziale olto negativi ai quali la corrente di Na attivabile con il protocollo visto pria sarebbe olto piccola. Pria si depolarizza la ebrana ad un potenziale fisso (V 1 piuttosto positivo e per un tepo sufficienteente lungo da attivare un nuero cospicuo di canali del Na, e poi si porta il potenziale di ebrana a vari livelli (V 2 ce, se sono più negativi di V 1 causeranno una ripolarizzazione e quindi una deattivazione dei canali stessi aperti a V 1, coe nell esepio di figura B. è calcolabile interpolando l andaento teporale di g Na attivata a V 2 con una funzione esponenziale elevata alla terza potenza, anc essa del tipo: y C A A B exp t / 3

20 Calcolo di in assenza di inattivazione (pronasi Utilizzando entrabi i etodi è possibile ottenere sperientalente i valori di per un apio range di potenziali

21 Studio dell inattivazionedel canale del Na Secondo il odello proposto da H&H l inattivazione dei canali del Na sarebbe ediata dall apertura di un unica porta La porta di inattivazione del canale del Na segue una cinetica del prio ordine O 1 - descrivibile dalla seguente equazione differenziale: I (V (V d dt (1

22 La soluzione di tale equazione allo stato stazionario (t è: ( V Mentre, l andaento teporale con cui lo stato stazionario verrà raggiunto sarà descritto dalla seguente funzione esponenziale, ce rappresenta una soluzione dell equazione differenziale ( t ( Dove è il valore di allo stato stazionario e o è il valore di a t=0 e in cui la costante di tepo è in relazione con le due costanti di velocità e nel seguente odo: o exp t 1

23 Studio dell inattivazione allo stato stazionario delle correnti di Na: calcolo di O I ( V

24 Calcolo di Nel range di potenziali depolarizzanti a partire da -50 V, dove il fenoeno dell inattivazione è ciaraente anifesto, coe in figura, una isura della cinetica dell inattivazione la si può ottenere interpolando la coponente inattivante della corrente di Na con una funzione onoesponenziale decrescente, dalla quale è calcolabile direttaente la costante di tepo dell inattivazione ( secondo la terinologia di Hodgkin e Huxley. y C A A B exp t /

25 Velocità del recupero dall inattivazione (de-inattivazione della corrente di Na La corrente viene evocata in successione a due potenziali test (V 1 e V 2 aventi la stessa apiezza a separati da un ritorno al potenziale di olding di durata variabile. V 1 evoca una corrente sufficienteente apia, utilizzata coe controllo, la cui durata è tale da perettere l inattivazione pressocé copleta dei canali. V 2 partirà dopo ce la ebrana verrà ripolarizzata al potenziale di olding per un nuero crescente di s, perettendo ad una frazione di canali sepre più apia di riuovere l inattivazione. Il confronto tra le correnti evocate durante V 2 e V 1 peretterà di stiare la frazione di canali ce anno recuperato dall inattivazione. Il recupero dall inattivazione sarà approssiativaente descrivibile da una funzione onoesponenziale del tipo y=1-exp(-t/, dove è la costante di tepo dell inattivazione.

26 Calcolo di Utilizzando entrabi i etodi è possibile ottenere sperientalente i valori di per un apio range di potenziali 1

27 Le costanti di velocità, e, Quindi, dai dati sperientali è possibile ricavare i valori di e, e di e Le corrispettive costanti di velocità e e e sono in relazione con essi nel seguente odo: / (1 / C O I / (1 /

28 Prob. di apertura (P o Pertanto, la corrente ionica I Na può essere rappresentata dalla seguente equazione 3 Na ( V, t ( V, t g V E Na I dove 3 rappresenta la probabilità coposta ce le tre gates e la gate siano conteporaneaente aperte e ḡ è una costante (t 3 (t 3 * Tepo (s 3 2 C 3 C 2 C 1 O I 2 3

29 THAT S ALL FOLKS!

30 Studio della cinetica di attivazione/deattivazione senza eliinare l inattivazione