Dominio degli Acytota o Aphanobionta

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1 Dominio degli Acytota o Aphanobionta Si definisce forma di vita non cellulare o acitota una forma di vita che esiste senza possedere una struttura cellulare. Questo termine presume la classificazione dei virus come forme di vita. Nelle discussioni sulla tassonomia dei domini viventi, il termine acytota viene utilizzato occasionalmente (assieme all'equivalente Aphanobionta), come il nome del regno dei virus. Il corrispondente dominio degli organismi cellulari sarebbe quindi detto cytota. Il concetto di "vita" senza struttura cellulare èemerso con forza nella comunitàscientifica nel 2003, in seguito alla scoperta del Mimivirus, pur non venendo universalmente accettato. Si definisce Mimivirus un genere virale contenente una sola specie ad oggi identificata (figura 1), cui èstato attribuito il nome Acanthamoeba polyphaga mimivirus (APMV). Nel linguaggio colloquiale, l'apmv è più comunemente definito con la sola denominazione di Mimivirus. Questa specie possiede il piùgrande capside fra tutti i virus conosciuti, cosìcome il piùesteso e complesso genoma. Figura 1 Schema di Acanthamoeba polyphaga mimivirus, con il piùgrande capside fra tutti i virus conosciuti. Si tratta di un virus a dsdna, con una capaciràcodificante del 90%, con 1,2 milioni di paia di basi, circa 911 geni codificanti proteine, geni aggiuntivi (aminoacil trna sintetasi, metabolismo degli zuccheri, dei lipidi e degli aninoacidi I gruppi appartenenti agli Acytota sono: Akamara (agente genomico acellulare) Euviria (veri virus) Virus Satellite Viroide (agenti subvirali) Virusoide Virofago

2 Transposone Elemento virale endogeno (come il provirus) Plasmide che include Cosmide Fagemide Prione (agente proteico di infezione) Viroidi e prioni I virus variano notevolmente nella morfologia, nella struttura e nel modo di replicarsi. In questo mondo virale esiste ogni versione di acido nucleico: RNA o DNA a singolo o doppio filamento, lineare o circolare. Ebbene, pur con tanta varietà, c è dell altro. Vi sono in natura altri agenti, detti viroidi e prioni, che non sono conformi alla definizione di virus, anche se sono altrettanto piccoli e contagiosi. Esiste una stretta affinitàfra virus e viroidi: i viroidi sono infatti molecole di acido nucleico nude composte interamente di RNA circolare. I prioni, d altro canto, sono entità infettanti a parte: sono costituite soltanto di singole molecole proteiche. La descrizione che qui saràfatta dei prioni è stata inserita in questa sezione del libro perché non è stato possibile individuare un altro settore affine in cui poter inserire questo interessante tema scientifico. Viroidi. I viroidi sono i piùpiccoli agenti patogeni conosciuti e agenti causali di malattie delle piante. La forma extracellulare del viroide consiste semplicemente di molecole di RNA nude, ovvero non racchiuse da un rivestimento proteico protettivo; tali agenti infettanti non codificano infatti neppure per una singola proteina. Un viroide èquindi solo una piccola molecola di RNA circolare arrotolata su se stessa a creare un esteso segmento a doppio filamento (figura 2). Figura 2 Struttura di un viroide I viroidi causano malattie nelle coltivazioni agricole, come le maculature solari nell avocado, il mosaico latente nella pesca e la maculatura fogliare gialla (cadangcadang) nella noce di cocco, e costituiscono in agricoltura un problema economico serio. Infatti, sia la coltivazione della noce di cocco nelle Filippine che il crisantemo che cresce negli Stati Uniti sono stati minacciati seriamente dalle malattie indotte da viroidi. Come fanno i viroidi a causare malattia? Moltiplicandosi essi deviano le risorse delle cellule, anche se tale alterazione nei nutrienti non riesce a condizionare molto l ospite vegetale. Si pensa che per causare effetti patogeni di rilievo si debba verificare un interazione diretta fra l RNA del viroide e uno o più obiettivi cellulari; tuttavia il meccanismo non èancora conosciuto nei suoi dettagli. 2

3 Una delle caratteristiche maggiori dei viroidi èla loro piccola dimensione; per esempio, il viroide che infetta la patata e che causa l affusolamento del tubero di patata (Potato spindle tuber viroid, PSTVd) contiene soltanto 359 nucleotidi (figura 3). Figura 3 Potato spindle tuber viroid, PSTVd. Tubero sano a destra a confronto con tre tuberi deformati a fuso a causa del virus (A); pianta di patata nanizzata, con portamento assurgente a causa dell infezione di PSTVd (B); Solanum jasminoides (C), Brugmansia spp (D), Lycianthes rantonnetii (E), sono alcune solanacee ornamentali in grado di ospitare il PSTVd. I viroidi non sono protetti da un capside e non sembra che ne abbiano bisogno. Essi posseggono vaste regioni a doppio filamento che sono resistenti alla distruzione da parte delle ribonucleasi. Circa la riproduzione dei viroidi va detto, innanzitutto, che essi, poichénon debbono affrontare il problema di sintetizzare le proteine del capside, nel loro genoma non sono codificati i relativi geni. Tuttavia essi devono affrontare, al pari dei virus a RNA, il problema di sintetizzare l RNA da RNA stampo, ed inoltre di come renderlo circolare. Le modalitàcon cui i viroidi compiono tale sintesi è un evento abbastanza complesso. L RNA dei viroidi infettanti viene replicato da una RNA polimerasi dell ospite che può sintetizzare l RNA usando un RNA stampo. Le polimerasi sono comuni nelle piante ma non lo sono negli animali e nei batteri non infetti. Il processo di replicazione viene attuato mediante l impiego dell RNA circolare come stampo e formando una copia, complementare ad esso, con lo spostamento tutto intorno al cerchio; questo meccanismo di replicazione a cerchio rotante viene usato anche da alcuni virus a DNA e dai plasmidi. Il risultato di tale operazione non consiste in una singola copia dello stampo, ma in una lunga serie di copie ripetute in tandem, come un rotolo di carta non svolto. Per produrre i viroidi, questa lunga molecola deve essere scissa in segmenti di dimensioni adeguate; questo può essere fatto in uno dei due seguenti modi. In alcuni viroidi, lo stesso RNA presenta un attività enzimatica, ossia un ribozima che ècapace di tagliare la lunga catena in singole copie; in altri viroidi il taglio viene eseguito da una endonucleasi dell ospite. In entrambi i casi le copie risultanti devono legarsi in cerchi, che poi assumono la struttura molecolare del viroide. Il solo agente infettante umano simile al viroide èdetto erroneamente virus dell epatite D (Hepatitis D virus, HDV); in realtà tale particella è qualcosa di intermedio fra un virus e un viroide e quindi un altra possibile denominazione potrebbe essere quella di virusoide. Inoltre, HDV è costituito da RNA 3

4 nudo che differisce dai viroidi delle piante in quanto codifica per proteine. Tuttavia, a differenza dei virus veri e propri, l agente dell epatite D non codifica per il proprio capside, mentre le proteine che esso codifica sembrano svolgere un ruolo importante nell impacchettamento delle particelle. L agente dell epatite D utilizza il capside di un virus autentico, ossia il virus dell epatite B (HBV), per essere impacchettato. Da tutto ciò si evince che la malattia dell epatite D si verifica solo se l ospite viene contemporaneamente coinfettato dal virus dell epatite B e dall agente dell epatite D. Questo particolare tipo di infezione doppia comporta l insorgenza di una malattia ben più grave di quella indotta dalla sola infezione da virus dell epatite B. L agente dell epatite D puòcausare la malattia, inattivando un componente essenziale delle cellule: il suo RNA presenta, infatti, un ampia omologia di sequenza con una particella citoplasmatica di RNA, la 7S, coinvolta nel riconoscimento del segnale e nella traslocazione di proteine secretorie e di quelle associate alla membrana; è probabile che l RNA del virusoide sequestri o scinda la particella 7S, determinando la morte cellulare. Prioni. La degenerazione del sistema nervoso centrale costituisce una grave patologia, spesso con conseguenze mortali per gli esseri umani e gli animali. Recentemente, la piùnota patologia degenerativa cerebrale è stata la cosiddetta malattia della mucca pazza, ma ci sono anche altre manifestazioni cliniche simili, come la malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD) negli esseri umani e lo scrapie nelle pecore. Queste malattie sono denominate nel loro insieme encefalopatie spongiformi perchéformano fori nel cervello, che fanno assumere al tessuto cerebrale un aspetto a spugna. La natura infettiva di una di queste malattie umane, il kuru, fu ipotizzata quando venne osservata l associazione fra persone colpite ed il loro consumo di carne di cervello umano, a seguito di rituali tribali. È stato poi provato che alcune di queste malattie possono essere trasmesse anche in animali da laboratorio. In tutti questi esempi patologici, i ricercatori hanno sospettato che l agente eziologico potesse essere un virus e tuttavia non riuscivano ad isolare alcun agente infettivo conosciuto (virus, batteri o altri). In seguito, fu chiarito che l agente infettivo, poi chiamato prione, è altamente insolito, in quanto non contiene acidi nucleici, ma ècomposto interamente da una proteina. Ciòrisulta sorprendente perchétutti gli altri agenti infettivi, ovvero tutte le entitàin grado di replicarsi, possiedono genomi a base di acido nucleico. Tale mistero èstato parzialmente risolto con la scoperta che le proteine prioniche hanno proprietàinsolite. Al pari delle altre proteine possono piegarsi in un certo numero di strutture tridimensionali differenti: in una configurazione, sono costituenti normali delle cellule del sistema nervoso centrale e non causano danno; in un altra configurazione, invece, si trasformano in prioni e assumono la capacitàinsolita di fungere da stampo per convertire le molecole di proteine normali in prioni. I prioni e i loro precursori normali hanno la stessa sequenza aminoacidica e sono codificati dagli stessi geni: differiscono solamente nella conformazione molecolare, ovvero nel modo in cui tali componenti proteici sono ripiegati. Le proteine, precursori normali dei prioni (proteina prionica cellulare o PrPc ), sono, infatti, ricche di siti molecolari nella conformazione α-elica, mentre tutte le proteine patologiche prioniche (PrPSc) mostrano una prevalenza di siti molecolari che si presentano srotolati (unfolded) nella conformazione a foglietti-β. Contrariamente alle loro controparti normali, i prioni sono altamente resistenti alle proteasi, agli agenti chimici aggressivi ed alle temperature elevate. La disinfezione di materiali contaminati da prioni richiede misure di disinfezione specifiche: per esempio, gli oggetti contaminati devono essere impregnati di idrossido di sodio 1N (normale), per almeno un ora, per poter distruggere le proteine prioniche. Vediamo come fanno i prioni a imporre il loro tipo di ripiegamento alle molecole normali. Si pensa che i prioni inducano le proteine normali a ripiegarsi nella forma di prione. Non ènoto, tuttavia, se i prioni agiscano su proteine che sono ancora nel processo di piegamento o su quelle che giàsi sono piegate nella loro configurazione naturale. Tale processo non èstato ancora riprodotto in vitro; si ritiene che esso sia irreversibile, ossia i prioni non ritornano ad essere proteine normali. Qualunque sia il meccanismo, l accumulo di quantità sufficienti di prioni e la loro diffusione alle cellule adiacenti comporta l alterazione delle normali funzioni cerebrali. Nelle pecore la malattia èdenominata scrapie perchégli animali ammalati si strofinano intensamente su qualsiasi superficie, scorticando la propria 4

5 lana e la pelle (scrape, scorticare). Con la morte di ampi aggregati cellulari nervosi, il cervello assume sempre piùla forma di un formaggio svizzero con i buchi. Le proteine prioniche si aggregano in fibrille traslucide cerose, dette amiloidi, che inducono la morte programmata delle cellule. Il termine encefalopatia spongiforme si riferisce all aspetto spugnoso del tessuto cerebrale che consegue alla estesa necrosi cellulare. Le malattie da prioni mostrano sempre uno sviluppo lento nel tempo; èopportuno sottolineare che la funzione della forma normale dei prioni èancora sconosciuta. I topi mutanti privi di questa proteina non mostrano sintomi. È possibile ipotizzare che se i prioni interessassero una proteina essenziale, le manifestazioni della malattia sarebbero piùimmediate. In termini generali, l attività dei prioni rientra nel campo di interesse dell epigenetica, ovvero dei cambiamenti ereditari che non derivano da sequenze alterate del genoma. In tal senso gli esempi che riguardano organismi complessi sono alquanto numerosi si pensi alla capacitàdelle cellule del fegato di riprodurre sempre se stesse pur avendo lo stesso genoma, per dire, delle cellule di muscolo. In alcuni casi, il cambiamento nel modello dell espressione genica che caratterizza un dato tipo di cellule èstato attribuito a modificazioni del DNA, dovute a metilazione. Negli organismi unicellulari il fenomeno sembra essere piùlimitato; comunque i lieviti hanno proteine che si comportano come prioni, ossia inducono modificazioni ereditabili se introdotte per accoppiamento in altre cellule. Come i prioni animali, i prioni dei lieviti si aggregano in fibrille e inattivano le loro forme naturali. Rimane da vedere quanto sia diffuso il meccanismo dei prioni negli altri organismi. I prioni potrebbero essere coinvolti in altri fenomeni epigenetici, come la memoria a lungo termine o persino la differenziazione delle cellule somatiche. I virus, i viroidi ed i prioni rivelano la grande plasticitàdel mondo biologico, ampliando i nostri concetti basilari sulla cellula come base della vita ai messaggeri chimici delle informazioni genetiche. Da queste entitàinfettanti si apprende che determinati fenomeni da cui dipendono i nostri concetti su che cosa èun vivente, come si replica e muta, non sono di pertinenza delle sole cellule. Questi processi possono essere indipendenti rispetto alle caratteristiche principali delle cellule, che sono, fra l altro, quelle di dividersi e formare cellule figlie. Tali entitàintracellulari non operano nel vuoto: hanno bisogno di cellule in grado di fornire l energia ed i meccanismi di sintesi delle proteine. Se i virus, che sono giàcapaci di sintetizzare il proprio acido nucleico, fossero dotati di un meccanismo necessario per ottenere l energia e sintetizzare proteine, forse sarebbero capaci di replicazione autonoma. In altre parole, forse, sarebbero delle vere cellule. Tutto ciòsembra assumere una particolare importanza per alcuni dei grossi virus dotati di envelope, come quelli che causano il vaiolo, che sono forniti di un significativo complesso enzimatico per la sintesi dell acido nucleico. Questo contesto cosìstimolante invita ad ulteriori congetture. Da dove si originano i virus? Sono essi delle cellule in forma ridotta, ovvero il risultato della perdita delle proprietà necessarie per poter condurre un esistenza indipendente, oppure si sono evoluti come entitànuove? O ancora, seguono altre vie evolutive? Che significato puòassumere la grande varietàdei virus, anche in un singolo ospite? Si pensi a tutti i virus conosciuti che causano patologie solo nell uomo. A differenza dei batteri, che si sono evoluti in modo indipendente, i virus si sono evoluti solo in associazione con i loro ospiti. Inoltre, i prioni sono piùdiffusi di quanto oggi possiamo sapere ed assolvono funzioni nei fenomeni biologici essenziali, come la differenziazione. Virusoidi. Gli RNA delle piante a basso peso molecolare, circolari, con singolo filamento patogenico creano un considerevole interesse per le piccole dimensioni dei loro 246 a 388 nucleotidi, per le loro caratteristiche strutturali uniche e per la loro capacitàdi produrre spesso sintomi gravi o nessun sintomo nelle piante infette. Molti di essi sono importanti patogeni delle piante coltivate. La loro apparente incapacitànel codificare qualsiasi proteina indica che tutte le interazioni con i componenti cellulari avvengono mediante le loro sequenze e le loro strutture secondarie e terziarie. La caratteristica di alcune delle interazioni è, probabilmente, quella di contribuire alle conoscenze della struttura delle relazioni e della funzione dell RNA in tutte le cellule (Diener, 1979; 1983; 1987; Riesner et Gosso, 1985; Keese et Symons, 1987; Keese et al., 1988). 5

6 Questi RNA possono essere suddivisi in due gruppi: i viroidi, che replicano indipendentemente perchénon richiedono un virus helper ; i virusoidi con gli RNA incapsulati, simili a virus, che richiedono un virus helper. Tabella 1 Classificazione dei viroidi in relazione al gruppo ed al sottogruppo. Nome Sigla Lunghezza dei nucleotidi A, gruppo ASBV Sottogruppo ASBV Avocado sunblotch viroid ASBV B, gruppo PSTV B1, sottogruppo PSTV Chrysanthemum stunt viroid CSV 354 e 356 Citrus exocortis viroid CEV Coconut cadang-cadang viroid CCCV 246 e 247 Coconut tinangaja viroid CTiV 254 Columnea latent viroid CLV 370 Cucumber pale fruit viroid CPFV 303 Hop latent viroid HLV 256 Hop stunt viroid HSV Potato spindle tuber viroid PSTV 359 Tomato apical stunt viroid TASV 360 Tomato planta macho viroid TPMV 360 B2, sottogruppo ASSV Apple scar skin viroid ASSV 330 Australian grapevine viroid AGV 369 Grapevine yellow speckle viroid GYSV 367 Grapevine viroid 1B GV1B 363 a Schema di classificazione di Koltunow et Rezaian (1989) per i viroidi sequenziati. b Cucumber pale fruit viroid èrealmente una sequenza variante di Hop stunt viroid. Solo quattro virusoidi sono stati finora scoperti, tutti in Australasia (tabella 2), sebbene un diverso isolato di Lucerne transient streak virusoid (vltsv) èstato trovato in Canada (Abouhidar et Paliwal, 1988). Tabella 2 Virus attualmente scoperti. Nome Sigla dei Lunghezza dei nucleotidi virusoidi Lucerne transient streak virus vltsv 324 Solanum nodiflorum mottle virus vsnmv 377 Subterranean clover mottle virus vscmov 332 e 388 Velvet tobacco mottle virus vvtmov 365 e 366 I 16 viroidi (tabella 1), che sono stati cosìdefiniti, possono essere divisi i due gruppi principali sulla base delle della sequenza omologa comparativa. Avocado sunblotch viroid (ASBV) è finora l unico 6

7 membro, mentre i viroidi rimasti possono essere divisi in due sottogruppi basati sulle relative sequenze nella parte centrale delle molecole viroidi bastonciniformi (Keese et Symons, 1985, 1987; Koltunov et Rezaian, 1989 ). I virusoidi nelle piante infette esistono quasi unicamente come molecole circolari libere o incapsulate entro i virioni dei virus helper. Ciòèin contrasto con le dimensioni dei satelliti ad RNA di Tobacco ringspot virus (TRSV) che è stato trovato in vivo in ambedue le molecole circolari a singolo filamento, ma solo le forma lineare è incapsulata (Kiefer et al., 1982; Bruening, 1990). Sebbene ègeneralmente considerato che un viroide ed un virusoide non codificano per nessun polipeptide, la prova definitiva, evidente e circostanziale èpienamente carente (Sanger, 1987; Keese et Symons, 1987). Nonostante l incapacità degli RNA circolari ad essere tradotti mediante i ribosomi degli eucarioti (Kozak, 1979), la possibilitànon puòessere dismessa che frammenti subgenomici dei viroidi e dei virusoidi possono agire come gli RNA messaggero in vivo e che la fase di iniziazione della sintesi del peptide puòverificarsi per un codone diverso da AUG (Dasso et Jackson, 1989; Kozak, 1989). Il maggior problema nella sequenza relativa e struttura dei viroidi e virusoidi a funzionare èla scarsitàdelle funzioni dei marcatori. Quando usando i mutanti per questo tipo di lavoro, questi possono essere ottenuti in due modi, sia mediante isolamento naturali, verificando mutanti di un viroide o di un virusoide (varianti di sequenze), sia preparando loro mediante mutagenesi sito-diretta dei cloni di cdna (Owen et Hammond, 1988; 1990). Tuttavia, il saggio della variazione dell effetto patogenetico sulle piante inoculate èuna delle poche strade valide che hanno fornito dati definitivi (Visvader et Symons, 1986). Piùrecentemente, dati preliminari che indicano un effetto su movimento da cellula a cellula di Potato spindle tuber viroid (PSTV), mediante mutazioni nell anello terminale destro della molecola del viroide, dovrebbe aiutare ad identificare le caratteristiche strutturali che determinano il range degli ospiti del viroide (Owens et Hammond, 1990). Nell area di replicazione, nell analisi in vitro in lavorazione dei precursori oligometrici di ASBV ed i quattro virusoidi hanno identificato una specifica struttura di autoscissione nota come il martello ed ha mostrato che circa il 20-30% di ogni molecola èrichiesto per la formazione di queste strutture. Questa area èdiscussa sotto, insieme con i domini di sequenza nei viroidi, in termini di evidente funzione e fornitura per l evoluzione dei viroidi e possibili virusoidi, mediante ricombinazione dell RNA. I domini di sequenza nei viroidi indicano evoluzione mediante riarrangiamento dell RNA Analisi comparative a coppie delle sequenze dei membri del sottogruppo B1 di PSTV (tabella 1) indicano la presenza di cinque domini (figura 1), i confini dei quali sono stati definiti da bruschi cambiamenti, da alti a bassi o viceversa, nell omologia della sequenza (Keese et Symons, 1985; Keese et al., 1988). Differenti confronti di coppie sono stati sempre consistenti nel definire l esatta posizione dei confini. Il modello del dominio èstato sviluppato mediante l impiego di sequenze solo del sottogruppo B1 di PSTV (tabella 1). Tuttavia, i viroidi di Apple scar skin viroid (ASSV), sottogruppo B2, hanno gli stessi domini, come osservato attraverso il confronto delle sequenze (Koltuniw et Rezaian, 1989). Il gruppo PSTV della tabella 1 èdiviso in due sottogruppi sulla base delle sequenze conservate nel dominio centrale (C). Entro il dominio C di ogni sottogruppo, ci sono le sequenze di circa 30 nucleotidi che sono altamente conservate fra tutti i membri di ogni sottogruppo, ma che sono abbastanza differenti da quelli dell altro sottogruppo (Visvader et al., 1985; Koltunow et Rezaian, 1989). Queste sequenze centrali conservate compongono circa un terzo del dominio C, in ogni caso. Tuttavia, una caratteristica comune di ogni sottogruppo èla presenza di una breve, rovesciata, ripetuta sequenza, con i nucleotidi conservati, che si puòosservare con le frecce della figura 4. 7

8 Figura 4 Modello dei domini per il gruppo dei viroidi di Potato spindle tuber virus (PSTV). I cinque domini T1, P, C, V e T2 sono stati determinati dalle omologie delle sequenze tra i viroidi. Le frecce rappresentano una sequenza ripetuta invertita, che puòformare un ciclo continuo. Gli elementi delle sequenze sono quelli del sottogruppo B1 di PSTV (tabella 1). R ed Y indicano una corta elica di oligopurine-oligopirimidine. Gli stessi domini esistono in Apple scar skin viroid (ASSVd) sottogruppo B2 (Keese et Symons, 1987; Koltunow et Rezaian, 1989),. Questo modello di dominio è guidato dalla proposta che l evoluzione dei viroidi include il riarrangiamento dei domini fra i viroidi che infettano la stessa cellula, seguito da un ulteriore evoluzione (Keese et Symons, 1985). Un supporto sperimentale di come un modello èdifficoltoso da ottenere èrappresentato da nuove sequenze del viroide che continuano ad apparire, come risulta da una forte evidenza indiretta. Per esempio (Hammond et al., 1989), nella recente sequenza di Columnea latent viroid (CLVd), i domini del terminale sinistro (T1) e del terminale destro (T2) mostrano un elevata omologia di sequenza nello stesso dominio in PSTV e Tomato apical stunt viroid (TASVd), rispettivamente, con confini bruscamente definiti e consistenti, con confronti a coppie. (figura 5). Figura 5 Diagramma schematico di Columnea latent viroid (CLVd) che mostra le omologie di sequenza in altri viroidi. I domini sono mostrati insieme con i numeri del residuo ai confini di ogni dominio. La regione centrale conservata (CCR) contiene la sequenza ripetuta invertita (Hammond et al., 1989). 8

9 La presenza di lunghi subdomini delle sequenze di Tomato planta macho viroid (TPMVd) nel dominio patogenetico (P) e di PSTV e di Hop stunt viroid (HSV) nel dominio C (figura 5) indica che i riarrangiamenti possono avvenire entro un dominio come ai confini. Un viroide più complesso è l Australian grapevine viroid (AGV) del sottogruppo B2 di ASSV (tabella 1) nel quale quasi tutti i 370 nucleotidi appaiono essere derivati dai segmenti di Citrus exocortis viroid CEV), PSTV, ASSV e Grapevine yellow speckle viroid, GYSVd (Rezaian, 1990), La somiglianza della sequenza dei segmenti di AGV varia dal 52 al 100% delle corrispondenti sequenze nei viroidi dei parentali putativi (Koltunow et Rezaian, 1989). Solo un esempio èstato trovato finora nei virusoidi dei riarrangiamenti di tali RNA. Quattro separati isolati di Subterranean clover mottle virus (SCMoV) contengono due virusoidi di differenti dimensioni, i quali possono stare insieme o separatamente (Francki, 1985; 1987). Analisi della sequenza dei virusoidi mostrano l evidente situazione in cui la sinistra di ogni molecola è quasi identica, mentre le parti destre sono completamente diverse, ad eccezione di alcune brevi sequenze (Davies et al., 1990), come si puòosservare in figura 6. Presumibilmente, i due virusoidi sono sorti dalla ricombinazione fra i tre parentali che devono essere ancora scoperti ed identificati. Figura 6 Strutture secondarie proposte per gli RNA di Subterranean clover mottle virusoid (SCMoVd). I nucleotidi conservati tra gli RNA, in posizioni simili della struttura secondaria, sono racchiusi in box. Una sequenza di 18 nucleotidi, in cui 14 dei nucleotidi sono comunemente in ambedue gli RNA èindicata con una linea spessa. Il sito di autoscissione in ogni RNA èmostrato da una freccia (Davies et al., 1990). 9

10 Il meccanismo di questi riarrangiamenti dell RNA èsconosciuto. Un possibile meccanismo èla trascrizione discontinua dove una polimerasi di RNA, copiando un modello di viroide o di un virusoide cambia, oltre a copiare, un secondo modello di giusta posizione allo stesso punto, molto probabilmente determinato mediante le strutture terziarie di due modelli (Keese et Symons, 1987). Esempi di ricombinazione fra piùvirus a filamento RNA si stanno accumulando (King, 1988). Nel caso dei virus delle piante, forse il classico e definitivo esempio èquello proposto da Allison et al. (1990) per il Cowpea chlorotic mottle virus (CCMV), in cui la completa infezione richiede l inoculazione simultanea dei tre RNA genomici. Gli RNA 1 e 2 sono ciascuno monocistronici, mentre RNA 3 èdicistronico, codificante per la proteina 3a (probabilmente responsabile del movimento del virus nella pianta) e per la coat protein. L inoculazione delle piante con gli RNA 1 e 2 normali e due RNA 3, uno con una delezione nel cistrone 3a e l altro con una delezione nel cistrone della coat protein, guida alla infezione normale e la scoperta di RNA3 di tipo selvatico. Nessuna infezione sistemica si riscontra quando ognuno dei mutanti RNA 3 èstato inoculato separatamente con RNA 1 e RNA 2. Quindi, l evento di ricombinazione dell RNA deve avvenire con un elevata frequenza in molte delle cellule inoculate. Un risultato potrebbe incoraggiare i ricercatori nel campo dei viroidi e dei virusoidi se simili esperimenti riescono a provare l evoluzione dei viroidi e dei virusoidi mediante la riorganizzazione dell RNA. Il dominio P di CEV gioca un ruolo nella patogenicità Naturalmente bisogna disporre di isolati dei viroidi, preparati da singola pianta, spesso con piùdi una variante della sequenza di un viroide e poter separare e sequenziale, mediante la preparazione di strutture clonali di piena lunghezza, dei cloni del cdna da miscele di viroidi (Visvader et Symons, 1985; Rakowski et Symons, 1989). Dei cloni di cdna dei viroidi e loro trascritti di RNA che sono infettivi quando inoculati su piante suscettibili (Cress et al., 1983) possono essere preparati, ciò offre un unica opportunità per mettere in relazione la sequenza e quindi la struttura, con la patogenicità. Figura 7 Sommario dell analisi di 17 varianti di sequenze di Citrus exocortis viroid, CEV, (Visvander et Symons, 1985). Molti cambi di nucleotidi avvengono nei domini PL e PR entro i domini di CEV patogenici, normali (P) e variabili (V). Analisi della sequenza di varianti di PSTV, CEV e HSV mostrano che almeno tutte le differenze delle sequenze per ogni viroide sono localizzate entro i domini di P e della variabile V (Schnölzer et al., 1985; Visvader et Symons, 1985; Shikata, 1990). Ciòindica che la variazione della gravità 10

11 dell espressione dei sintomi di queste varianti della sequenza è molto probabilmente determinata dalla variazione della sequenza in uno o ambedue questi domini. Molti dati sono variabili per CEV ed i risultati mostrano che in 17 varianti, essenzialmente tutta la variazione delle sequenze avvenute entro i domini di P e di V nelle regioni chiamate PL e PR (figura 7, Visvader et Symons, 1985; Keese et al., 1988). Per definire se il dominio P o V o ambedue sono responsabili dell espressione della modulazione dei sintomi, cloni chimerici infettivi di cdna sono stati preparati in una metàdi una variante in sequenza, in cui approssimativamente metàdella variante di una sequenza era unita attraverso il dominio C con l'altra metàdi un'altra variante (figura 8). Figura 8 Diagramma schematico di due parentali di Citrus excortis viroid (CEV) e di due viroidi chimerici di forma circolare. Il parentale CEV-A(2) induce sintomi gravi in piantine di pomodoro, mentre l altro parentale, CEV-DE30(a), induce sintomi molto leggeri. Due varianti delle sequenze sono state usate, una che induce gravi sintomi sulle piantine di pomodoro ed un altra che induce sintomi leggeri. I costrutti di cdna sono stati convenientemente preparati usando i siti BamHI e HindIII nel dominio C. I risultati di infettivitàindicano che il dominio P determina sintomi di espressione, mentre il dominio V puòavere un effetto sul livello del viroide che sviluppa nelle piante infettate (Visvader et Symons, 1986). La sequenza dei viroidi della progenie è stata la stessa di quella del clone usato per l inoculazione. Tuttavia, i risultati non danno informazioni sulle basi molecolari dell induzione della risposta patogenica. La periodicità di sequenze nei viroidi indica l origine mediante duplicazione Molti viroidi mostrano una periodicitàstrutturale caratterizzata da unitàripetute di 11 o 12 nucleotidi per il sottogruppo PSTV, 60 nucleotidi per ASSV e80 per ASBV (Juhasz et al., 1988). Tabella 3 Esempi di periodicitàstrutturali nei viroidi a, b. Viroidi c Unitàripetute Consenso PSTV 12 CNGRRGRRAYCN ( nt) CCCV 12 CNGRRGRRAYCN ( nt) ASSV 60 Ripetuto 4,5 volte in 330 nt ASBV 80 Ripetuto 3 volte in 247 nt a Dati da Juhasz et al., b R, purina /A o G); Y, pirimidina /C o U); N, nucleotide non conservato (A, C, G o U; nt, nucleotide. c Le abbreviazioni sono riportate in tabella 1. 11

12 Sebbene la sequenza delle ripetizioni èstata trovata approssimativamente per un terzo della sequenza totale dei membri del sottogruppo di PSTV, la piùlunga delle ripetizioni di ASSV e ASBV occupa la completa lunghezza di ogni molecola (tabella 3). Le periodicitàdella tabella 3 sembrano essere specifiche per i viroidi, da quando non furono trovati altri piccoli RNA, come piccoli RNA nucleari, ed i virusoidi, in sequenza randomizzata generata quando la stessa composizione di base come quella di alcuni viroidi fu usata (Juhasz et al., 1988). Tuttavia, una cospicua periodicitànon fu trovata per HSV o varianti delle sue sequenze, Cucumber pale fruit viroid (CPFV), ambedue membri del sottogruppo PSTV, che rimane un dilemma. Juhasz et al. (1988), hanno suggerito che la periodicitàosservata dei viroidi puògiocare un ruolo nell interazione dell'rna del viroide simile al DNA con le proteine, da quando una delle caratteristiche della capacitàdi legare le proteine del DNA èdi una periodicitàstrutturale (Travers, 1987). Una possibilitàaggiuntiva èquella che questa periodicitàstrutturale di molti viroidi riflette la loro origine evoluzionaria per cui la duplicazione della sequenza successiva alla mutazione permette un aumento della dimensione e lo sviluppo di molecole infettive (Diener, 1989). Un bell esempio di come la duplicazione parziale della molecola del viroide èosservabile durante l infezione delle noci di cocco da Coconut cadang-cadang viroid (CCCV). I 246 nucleotidi del viroide appaiono presto infetti ma, come i sintomi appaiono, nuove molecole di elevato peso molecolare insorgono ed eventualmente dominano la popolazione del viroide, come il progresso della malattia (Imperial et al., 1981; Mohamed et al., 1982). La duplicazione dell intero dominio avviene ed inizia a tre separati siti entro il dominio V per dare delle sequenze aggiuntive di 41, 50, 55 o 2x50 nucleotidi (figura 9; Haseloff et al., 1982; Keese et Symons, 1987; Keese et al., 1988). Figura 9 Duplicazioni parziali delle sequenze in Coconut cagang-cadand (CCCV). Le due sequenze con un totale di 41, 50, 55, o 2x50 nucleotidi sono duclicate come indicato. Le frecce che puntano alla destra indicano i confini delle sequenze X ed Y, mentre i cerchi pieni le sequenze duplicate dei confini. I nucleotidi circolari sono i siti di mutazione nelle varianti delle sequenze (Keese et al. (1988). 12

13 Le implicazioni funzionali dello sviluppo di queste piùelevate forme di CCCV, durante la progressione della malattia non sono conosciute. Ovviamente, esse possono dar luogo ad alcuni vantaggi della replicazione, per esempio, dando luogo ad un incremento della competizione mediante il legame di queste sequenze ripetute di alcuni componenti dell ospite, importanti per la replicazione, ma che sono in limitata disponibilità(keese et al., 1988). È stato suggerito che questa duplicazione del dominio T2 avviene con una trascrizione discontinua mediante una polimerasi dell RNA, accendendo o saltando da un modello ad un altro (Keese et Symons, 1985), un modello analogo a quello proposto per la generazione dell interferenza difettiva degli RNA del virus dell influenza (Jenning et al., 1983). Presumibilmente, la duplicazione della sequenza in altri membri del gruppo PSTV dei viroidi potrebbe avere bisogno di una via similare per costruire eventualmente la molecola di intera lunghezza. Via di replicazione per i viroidi e virusoidi riscontrato nel meccanismo del rolling circle È generalmente concordato che questi RNA circolari e covalentemente chiusi sono replicati mediante un meccanismo circolare, come si puòosservare in figura 10 (Branch et Robertson, 1984; Symons, 1989), sebbene molti aspetti della loro replicazione non sono caratterizzati a livello molecolare. Figura 10- Modelli di rolling circle per la replicazione dei viroidi e virusoidi e del satellite RNA di Tobacco ringspot virus. A: percorso dove i plus ed i minus RNA aderiscono. B: percorso dove solo l RNA plus aderisce. I siti di adesione sono indicati mediante frecce (Forster et Symons,1987 ). In una delle due variazioni del meccanismo di rolling circle (figura 10A), l infezione circolare dello stesso meccanismo (figura 10A), ècopiato continuamente mediante una non identificata RNA dipendente da RNA, per formare un minus filamento concatamerico (step 1). Uno specifico sfaldamento di questo filamento produce dei monomeri (step 2) che sono circolarizzati da una ligasi dell RNA dell ospite e poi copiato mediante la stessa o una differente polimerasi (step 4). La specifica scissione del lungo e lineare filamento positivo produce monomeri positivi (step 5) che sono circolarizzati (step 6) per dare la progenie RNA. ASBV e vltsv, molto probabilmente seguono questo percorso (Hutchins et al., 1986; Forster et Symons, 1987a; 1987b). Nelle altre variazioni (figura 10B), il filamento minus lineare (step 1) non èscisso ma copiato direttamente per dare un filamento lineare positivo (step 3) che èscisso per fornire piùmonomeri e, alla fine, progenie circolare. Molti viroidi e tre dei quattro virusoidi, piùprobabilmente, seguono questo percorso (Branch et al., 1988; Hutchins et al., 1985; Davies et al., 1990). Molti di questi sono senza risposta circa questi due relativi percorsi. Ci si chiede la polimerasi RNA ècoinvolta nella replicazione e quanto gli stessi enzimi copiano i due plus e minus filamenti. Nel caso dei viroidi, l enzima deve essere codificato dall ospite, ma non ci sono evidenze dirette che indicano se èl RNA polimerasi I, II o III o alcune varianti del loro complesso multicomponente. Nel caso dei virusoidi del satellite, è generalmente assunto che la polimerasi dell helper che 13

14 codifica l RNA, con o senza i componenti dell ospite, è responsabile, ma non direttamente provano la validità. La possibilità che un enzima derivato dall ospite simile a quello richiesto per la replicazione dei viroidi ènecessario e non puòessere respinto. Non ci sono informazioni per la sequenza di specifici promotori sugli RNA circolari che definiscono il sito di iniziazione della trascrizione. I siti della sintesi dei viroidi e virusoidi nelle cellule sono anche sconosciuti. Nel caso di PSTV e CEV, Riesner ed i suoi colleghi hanno chiaramente mostrato che il nucleolo èil maggior sito dell accumulo dei viroidi (Riesner, 1987; Harders et al., 1989), ma nessuno è noto circa l attuale sito di sintesi. Una comprensiva analisi mediante l ibridazione in situ ènecessaria per procurare più dati definitivi su questi aspetti che interessano i viroidi ed i virusoidi. Il meccanismo dello studio dei precursori dei viroidi del gruppo PSTV èancora da risolvere Il maggior aspetto del meccanismo di rolling circle è l elevata specifica reazione di scissione richiesta per la produzione di monomeri da RNA concatamerico. Un unica reazione di autoscissione che è mediata dall RNA, in assenza di proteine, e dimostrato in vitro, molto probabilmente funziona in vivo per ASBV e per quattro virusoidi. Tuttavia, per tutti i viroidi del gruppo di PSTV, non esistono dati definitivi e la risoluzione del meccanismo di studio rimane la maggiore sfida nel campo dei viroidi. Finora, tentativi di rilevare un evento non enzimatico per gli oligomerici di PSTV èstato mostrato solo a livelli di attivitàmolto bassi (Robertson et al., 1985) o negligibili (Tsagris et al., 1987a). Tuttavia, Tsagris et al. (1987b) sembra avere ottenuto una ragionevole specifica scissione dei precursori di PSTV e la produzione di monomeri circolari in bassa resa, quando precursori di unità superiori alla lunghezza sono stati incubati con estratti di nuclei di piante. I risultati ottenuti indicano che l ottenimento in vivo dei precursori di PSTV richiede l azione di specifici RNase per dar luogo a monomeri che sono poi legati alla forma circolare. La possibilitàche proteine negli estratti nucleari possono avere un rapporto strutturale e che un ruolo catalitico nel processo di lavorazione dell RNA precursore non può essere eliminato. I risultati non sono abbastanza semplici come sembra apparire in un primo momento, perchémolti RNase aderiscono alle regioni del singolo filamento per dare terminali di 5 -idroxil e 2,3 -fosfato, che sono quelli richiesti per l accoppiamento di RNA di ligasi di RNA di piante (Branch et al., 1982). Inoltre, dato che il precursore oligomerico RNA consistentemente piega in una o più configurazioni, un RNase non specifico potrebbe intaccare le regioni esposte del singolo filamento alle lunghezze approssimativamente monometriche, con la conseguente ligasi dell RNA che si accoppia della giusta posizione dei terminatori 5 e 3. Ovviamente molti più specifici dati sono necessari per fornire ulteriore supporto per o contro una specifica scissione della nucleasi degli RNA dei precursori. Sembra fattibile che il meccanismo in vivo per i viroidi del gruppo di PSTV potrebbe rivelarsi essere qualche tipo di auto-scissione. Giàtre tipi di autoscissione sono stati identificati in soli 12 RNA di auto-scissione che sono stati finora caratterizzati; nove attraverso la reazione di martello, una struttura differente e ancora da essere pienamente caratterizzata per i minus TRSV (Bruening et al., 1988; Bruening, 1990). É principalmente fattibile che piùtipi di autoscissione saranno trovati, uno dei quali potrebbe spiegare l attività dei precursori di tutti i membri del gruppo di PSTV. La mutagenesi sito-diretta definisce un potenziale sito per l attività di CEV I cloni del cdna monomerico di PSTV e CEV sono infetti su piantine di pomodoro quando clonati al sito di BamHI (figura 11 per CEV) in alcuni vettori di plasmidi o di fagi BamHI, come sono i trascritti di RNA e dei monomeri escissi (Tabler et Sänger, 1984; Visvander et Symons, 1985). Tuttavia, i cloni monomerici di cdna preparati ad altri siti nella molecola del viroide, per esempio gli altri siti della figura 11A, non sono infettivi a meno che non possano essere asportati come monomeri con estremitàappiccicose. Presumibilmente, i monomeri escissi sono legati ai circoli monomerici in vivo per iniziare la trascrizione dell arrotolamento dal DNA circolare. 14

15 Figura 11 Sintesi dei dati che rappresentano il sito di scissione di Citrus excortis viroide (CEV) e di altri viroidi del sottogruppo di Potato spindle tuber viroid (PSTV), durante la replicazione del circolo di arrotolamento. A: siti della molecola di CEV usata per la costruzione dei cloni di cdna di completa lunghezza. B: siti di costruzione in vivo dei trascritti di RNA derivati dai cloni dei due mutanti puntiformi di CEV; i nucleotidi cerchiati rappresentano la mutazione dei punti introdotti a G97 per dare A97 o U97. Il clone di tipo selvaggio di cdna, così come l inserto escisso erano infetti quando inoculati su piantine di pomodoro. In contrasto, solo i cloni mutanti intatti erano infetti. La sequenza ripetuta di 11 nucleotidi si correla con l infettività ed i siti proposti alle posizioni 1, 2 o 3 sono indicati. C: le sequenze palindromiche e le strutture che possono formarsi ai siti 5 e 3 dei trascritti di RNA del mutante U97 del clone di cdna. La sequenza ripetuta dell 11 nucleotide è rappresentata in un riquadro. D: nucleotidi conservati e strutture potenziali nel dominio centrale conservato di tutti i viroidi di PSTV del sottogruppo B1. N è un nucleotide non conservato. La sequenza del nucleotide 11 èrappresentata in un box ed il sito di lavorazione proposto sono indicati mediante frecce. In Hop stunt viroid (HSV), un U èinserito nella posizione del cerchio pieno. Questo U si potrebbe abbinare con un A che èrappresentato da N, lasciando una C inappaiata contrassegnata con C. Le coppie di basi A:G potenziali sono legate mediante linee spezzate. (Visvader et al., 1985). 15

16 Per una rimarchevole coincidenza, l infettività dei cloni intatti monometrici di cdna è correlata con la presenza di una sequenza 3 di 11 nucleotidi al sito BamHI nella sequenza del viroide che è ripetuta dopo il clonaggio del sito di BamHI nel vettore, come si puòosservare nei tratti neri nella figura 11B, la sequenza di tipo selvaggio contiene un G al sito del circolo A ed U (Tabler et Sänger, 1984; Visvander et Symons, 1986). Dai cloni monomerici senza una sequenza ripetuta o con solo una ripetizione di sei nucleotidi non infettivi, si puòevincere che i trascritti di RNA si verificano con la sequenza di ripetizione del nucleotide 11. Il sito di mutagenesi diretto di G97 della sequenza di CEV a U o A (figura 11B) èrisultato in un clone di infezione, ma in un inserto non infettivo (Visvander et al., 1986). La progenie del CEV infettivo dal clone infettivo mutato di cdna ècontenuto nella sequenza di tipo selvaggio. Il risultato èstato spiegato mediante il processo in vivo dei trascritti di RNA, generato in vitro o in vivo, ad uno dei tre collegamenti del fosfodiestere sul lato della mutazione puntiforme (identificata come 1, 2 o 3 nella figura 11B). Esso èapprossimativamente lo stesso sito identificato da Tsgris et al. (1987b), come uno dei due possibili siti in PSTV, dai loro esperimenti effettuati, usando estratti nucleari. Dato che il processo si verifica ad uno dei tre siti proposti in CEV e che alcuni altri meccanismi non sono operativi, poi una possibile struttura bidimensionale èpossibile ed èdata in figura 11C (Riesner et al., 1979; Visvader et al., 1985; Diener, 1986). I nucleotidi posti nei box sono il l1-nucleotide della figura 11B, mentre i sette nucleotidi (CGAGCUC) sono vicini al terminatore 3 e sono sequenze del vettore che provvede a fornire un accoppiamento di base limitato. L'elaborazione richiederebbe l escissione dell RNA monomerico mediante scissione a due posizioni corrispondenti ai siti 1, 2 o 3 (indicati mediante frecce) ed il suo successivo legame enzimatico alla forma circolare. Alternativamente, il meccanismo di escissione puòdirettamente produrre un monomero circolare. Durante la continua trascrizione a circolo rotolante di un modello meno circolare, l analoga struttura a quella di figura 11C èdata nella figura 11D. Tutti i nucleotidi sono derivati dal filamento superiore del dominio C (figura 4) e quelli mostrati sono conservati in tutti i viroidi del sottogruppo PSTV. È possibile che la doppia scissione considerata in figura 11C èsostituita da una piùcomplessa sequenza di eventi dei precursori oligomerici considerati nella figura 8D. Per esempio, se la struttura palindromica (strutture alternative con appaiamento intracatena tra le basi) è l attuale struttura richiesta per la scissione, poi la scissione puòsolo verificarsi sul filamento superiore per rilasciare un monomero lineare seguito dal riarrangiamento della struttura per piazzare il successivo sito di scissione in una struttura attiva. In questo modo, làpotrebbe essere il rilascio sequenziale dei monomeri lineari. Non c è una reale evidenza per ognuno di questi modelli. Diener (1986) ha considerato modelli analoghi a quelli della figura 11D, mentre Riesner (1990) ha descritto modelli strutturali con ibridizzazione similare nella regione conservata centrale per un oligomero di circa quattro unità. Nonostante i dati limitati, speculazione considerevole e due modelli dimensionali costruiti, non si puòdavvero essere fiduciosi su nessun aspetto riguardante il lavoro sui precursori oligomerici dei viroidi del gruppo di PSTV. Reazione di autoscissione in ASBV e nei quattro virusoidi Quest area è stata estensivamente revisionata di recente (Symons, 1989; 1990; Sheldon et al., 1990; Forster et al., 1990; Davies et al., 1990) ed aspetto chiave èstato considerato. Trascritti di RNA, piùe meno, preparati da cloni di cdna di ASBV e vltsv si sono autoscissi, in un alto specifico modo, durante la trascrizione e dopo l isolamento, in completa assenza di proteina. La reazione coinvolge un fosforil Mg 2+ catalizzato in una reazione che scinde l RNA per dare terminali con 2,3 fosfato ciclico e un 5 idroxil (figura 12). 16

17 Figura 12 Reazione di autoscissione che coinvolge una reazione di fosforil trasferimento dal 5 -idrossil del residuo 3 nucleotide al 2 -idrossil del residuo 5. (Symons (1989). Sulla base di specifici siti di scissione, una struttura conservata bidimensionale a martello èstata sviluppata (figura 13) che potrebbe essere applicata all autoscissione degli RNAdi plus e minus ASBV, plus e minus vltsv, plus Velvet tobacco mottle visusoid e plus vscmov, come pure un plus strsv. Figura 13 Struttura di consenso a martello intorno al sito di autoscissione (indicato da frecce) di Avocado sunblotch viroid, i quattro virusoidi ed il satellite positivo di RNA di Tobacco ringspot virus (vltsv, Lucerne transient streak virusoid). I 13 nucleotidi conservati sono racchiusi in box ed i nucleotidi non conservati sono indicati con N. 17

18 La struttura a martello di figura 13 consiste di tre steli accoppiati alla base (I, II e III intorno ad una regione a singolo filamento aperto) con 13 nucleotidi (in box) che sono conservati in nove RNA auto scissi identificati finora si scindono lungo questa struttura. Sebbene l evidenza definitiva è stata ottenuta, sembra probabile che la reazione di auto scissione, caratterizzata in vitro, è anche responsabile per l allestimento di precursori oligomerici in vivo. La struttura del martello bidimensionale della figura 12 non spiega perché c è una scissione non enzimatica dell RNA allo specifico sito. Si considera che, in presenza di MK 2+, il martello assume un attiva struttura terziaria la quale abbassa l energia di attivazione sufficientemente e specificamente al legame dell internucleotide del sito di auto scissione, per permettere il trasferimento del fosforile della reazione di autoscissione. Quando spaccata, la struttura è considerata rilassata e quindi prevenire la reazione inversa dal verificarsi, dal momento che nel complesso la reazione èteoricamente reversibile. Nel caso di ASBV e dei quattro virusoidi, le sequenze coinvolte nella reazione a martello forniscono informazioni per un passaggio chiave nel ciclo di replicazione. Esse sono anche le sole sequenze in questi patogeni a RNA, per cui si ha l informazione che indica il loro ruolo funzionale. Tuttavia, nel caso di ASBV, i siti di plus e minus auto-scissione sono 14 nucleotidi e le sequenze delle due strutture a martello coinvolgono approssimativamente un terzo centrale della molecola totale (Hutchins et al., 1986; Forster et al., 1987). Se questa parte della molecola di ASBV possiede qualche altro ruolo funzionale, ciòèsconosciuto. I siti di plus e minus auto-scissione di vltsv sono solo sei nucleotidi e le sequenze che compongono le strutture di plus e minus auto-scissione si sovrappongono e costituiscono la parte destra per un terzo della molecola di vltsv (Forster et Symons, 1987a; 1987b). Con riferimento ad ASBV, non ènoto se questa regione possiede qualche altra funzione ed altri dati di informazione sul resto della molecola. Solo i plus RNA degli altri tre virusoidi si autoscindono. Circa 60 nucleotidi sono richiesti per le strutture a martello e queste sono derivate dal filamento superiore sul lato destro delle molecole bastonciniformi (Keese et Symons, 1987; Davies et al., 1990). Prese insieme al filamento frontale, parzialmente accoppiato alla base di ogni virusoide, il totale ècirca un terzo di ogni molecola. Nessuna altra informazione funzionale ènota per questi RNA, ad eccezione della specificitànella relazione ai loro virus helper (Francki, 1985; 1987). Elementi di struttura terziaria sono presenti nei viroidi e virusoidi Sembra fattibile che nelle strutture a bastoncino dei viroidi e virusoidi, elementi aggiuntivi della struttura terziaria si riscontrano nello stato nativo come durante i vari stadi della loro replicazione. Come elementi strutturali potrebbero giocare un ruolo funzionale nel ciclo vitale di questi patogeni, così come l iniziazione degli effetti patogenici. Un esempio di struttura terziaria locale in PSTV èil cross-linking covalente indotto da UV fra G98 e U260 nella regione altamente conservata del dominio C (figura 14; Branch et al., 1985). Figura 14 Diagramma schematico di siti cross-linked indotti da UV in HeLa 5SrRNA e Potato spindle tuber viroid (PSTV). Le frecce a due punte indicano le posizioni dell attacco covalente. (Branch et al., 1985). 18

19 Presumibilmente, questa regione del viroide èin uno stato di attivazione che permette uno specifico ed efficiente cross-linking per verificare quando si verifica l irradiazione con luce UV. Un simile cross-linking è stato trovato nell elica di cellula HeLa 5S RNA (figura 14) cosìcome in un dominio del RNA del simil-viroide di Hepatitis delta virus (Branch et al., 1989) e 7SL RNA, che èun componente del segnale di riconoscimento della particella (Zwieb et Schüler, 1989). Questo sito di cross-linking in HeLa 5S RNA èin una regione di molecola analoga a quella della proteina TFIIIA del sito di legame su Xenopus 5S RNA e vicino al sito per la proteina ribosomale L5, mentre 7SL RNA lega un numero specifico di proteine. Tuttavia, l elemento sensibile di UV in PSTV potrebbe formare un sito di legame per una o piùproteine coinvolte nella replicazione e trasporto (Branch et al., 1990). Le numerose forme strutturali possibili in PSTV e relativi viroidi sono stati ben documentati da Riesner e colleghi (Riesner, 1990), potrebbero provvedere per multiple opportunitàin vivo nella costituzione di precursori oligomerici di ASBV, dei quattro virusoidi e dei plus TRSV. Allo stesso modo, l'elaborazione nel gruppo di PSTV di viroidi può essere caratterizzata come un altra struttura terziaria attivata. Elementi putativi conservati di introni in viroidi e virusoidi più probabilmente non hanno origini comuni ed RNA elaborazione Negli ultimi 10 anni, èdiventato popolare speculare sulla possibilitàche i viroidi e virusoidi contengono elementi conservati di introni del I gruppo, il che indica una comune origine ed una implicazione nel processo di formazione dei precursori multimerici durante la replicazione del ciclo di arrotolamento (Diener, 1981; Dinter-Gottlieb, 1986; 1987). Caratteristiche che sono normalmente assenti come i confronti di sequenza sono una critica analisi statistica della probabilitàdi osservare omologie di sequenza parziale necessarie casualmente e la presenza di come le omologie di altri RNA potrebbero essere considerati completamente estranei. Fa riflettere considerare che il confronto della sequenza di PSTV con 25 sequenze generate a random dal computer delle stesse dimensioni e composizione di base danno omologie di sequenza del 29,5 4,2%. Nel caso dei virusoidi, l elaborazione dei precursori oligomerici molto probabilmente si verifica in vivo tramite la reazione di autoscissione che coinvolge la struttura a martello, una reazione caratterizzata in vivo (figura 13; Forster et Symons, 1987a; 1987b; Forster et al, 1987; Sheldon et Symons, 1989; Davies et al., 1990). Come si puònotare in Diener (1989), l assenza di questi elementi della sequenza del gruppo I-type nella struttura a martello annulla ogni considerazione che essi giocano un ruolo nell elaborazione dell RNA in questi RNA patogenici. Come giàconsiderato sopra, se un simile gruppo di reazione di autoscissione ècoinvolto nella costituzione dei precursori dei viroidi del gruppo PSTV, poi questo provvede ad ulteriori evidenze contro ogni ruolo per questo gruppo I delle relative sequenze simili ad un introne. Dato che questa sequenza del gruppo I nei viroidi e nei virusoidi possiede alcuni ruoli funzionali è fattibile che essi possono coinvolgere alcuni aspetti della struttura terziaria, come, ad esempio, un percorso simile alla prolina che normalmente ècoinvolta nelle pieghe delle molecole proteiche. La comprensione del ruolo dei motivi delle varie sequenze nella struttura terziaria dell RNA è in aumento; un recente esempio potrebbe essere quello dei ruolo strutturali e funzionali giocati dai pseudonodi (Plej, 1990).. Bibliografia requirement for Cowpea chlorotic mottle virus 3a and protein genes for systemic infection. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:

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