CGH-array in PGD. dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd

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1 an innovative diagnostic company dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd CGH-array in PGD Padova, gennaio 2016 Pre-implantation Genetic Diagnosis (PGD) e Non Invasive Prenatal Testing (NIPT): Nuove frontiere in diagnosi prenatale Giusy Stoico Molecular Genetics Product Specialist Technogenetics s.r.l. (LO)

2 Diagnosi genetica preimpianto Premesse 1. La specie umana ècaratterizzata da una fertilitàparticolarmente bassa a. 30% di probabilità di ottenere il concepimento al massimo della propria capacitàriproduttiva b. 20% dopo i 35 anni c. 10% oltre i 40 È quindi normale attendere anche diversi mesi prima del concepimento: secondo l Organizzazione Mondiale della Sanità si può parlare di infertilità solo dopo 12/24 mesi di rapporti mirati non protetti senza risultati. In questo caso è consigliabile ricorrere a un centro specializzato, anche perché la compromissione della capacità riproduttiva, oltre a costituire un problema di carattere medico, tocca aspetti altrettanto complessi di natura psicologica e sociale. Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

3 Diagnosi genetica preimpianto Premesse 2. L incidenza di anomalie cromosomiche è direttamente proporzionale all età materna. L incidenza di embrioni aneuploidi aumenta proporzionalmente all età della donna i. 63% tra i anni di età ii. 81% in etàpiùavanzata. Questi dati suggeriscono che la riduzione della potenzialitàriproduttiva con il progredire dell età possa essere attribuita all elevata percentuale di embrioni con alterazioni cromosomiche. IPOTESI: la tendenza a produrre embrioni cromosomicamente anomali può rappresentare la causa del mancato impianto o di un aborto spontaneo, analogamente a quanto accade nelle donne in età riproduttiva avanzata. Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

4 Età media delle pazienti PMA Dati dal Registro Nazionale Procreazione Medicalmente Assistita Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

5 Incidenza dell aneuploidia negli embrioni (trofoectoderma) Per cromosoma Da Franasiak et al., J Assist Reprod Genet, 2014 Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

6 Impatto dell aneuploidia nella riproduzione L aneuploidia ha un effetto negativo crescente nella progressione dell impianto/sviluppo L impianto e la % di successo della gravidanza diminuisce progressivamente con l aumento dell età materna Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

7 Diagnosi genetica preimpianto Studio dell'assetto cromosomico degli embrioni per il trattamento delle pazienti EMA è stato applicato nel tentativo di incrementare le percentuali di gravidanza in gruppi di pazienti caratterizzati da una performance riproduttiva ridotta e/o per ridurre l incidenza di aborti, ed anche ridurre il rischio di trasferire embrioni con alterazioni cromosomiche (Wilton, 2002). Aree applicative: 1. Diagnosi preimpianto e infertilità Screening delle aneuploidie cromosomiche 24sure 2. Diagnosi preimpianto e rischio genetico Analisi delle traslocazioni cromosomiche Malattie monogeniche 24sure+ Karyomapping Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

8 BlueGnome/Illumina Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

9 Dalla letteratura Preimplantation Genetic Screening PGS TRADIZIONALE M-FISH X-Y vs PGS INNOVATIVA ARRAY CGH SNP-ARRAY Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

10 PGS tradizionale- Analisi FISH Perchè la tecnologia FISH non è il gold standard per l analisi Numero limitato di cromosomi testati Mosaicismo embrionale Limiti tecnici del metodo Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

11 Screening aneuploidie -FISH La FISH èstata ampiamente usata per indagare le aneuploidie, ma con un successo limitato: Può testare solo 5 9 cromosomi per volta Difficoltà tecniche Soggettiva con alta quota di falsi positivi Bassa riproducibilità tra laboratori Nel 2007, èstato dimostrato da molteplici studi RCTs che la FISH non era efficace per questo scopo Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

12 Background superamento dei limiti Perchè pensiamo che le nuove tecnologie siano più efficienti Numero limitato di cromosomi testati Tutti i 24 cromosomi analizzati simultaneamente con grande accuratezza. Mosaicismo embrionale Teoricamente eliminato allo stadio di blastocisti poichè tutte le cellule sono trattate come singolo campione Limiti tecnici del metodo I metodi molecolari sono meno soggettivi e sensibili agli errori tecnici Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

13 PGS innovativa- Analisi acgh L analisi CGH array produce una diagnosi veloce e realistica, usando una sola cellula embrionale, con un miglioramento nel successo riproduttivo ben dimostrato. Yang Z, et al; Mol Cytogenet. 2012;5:24. Yang Z, et al; Mol Cytogenet. 2013;6:32 C è una quota molto bassa di fallimenti della procedura, che assicura una diagnosi per ogni embrione superiore al 99% e include informazioni su tutti i 24 cromosomi. Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

14 TM Scopi dell utilizzo del 24sure TM 1. Migliorare il successo dei cicli di IVF preferendo gli embrioni euploidi per il transfer 2. Supportare il transfer elettivo di un singolo embrione per ridurre le gravidanze multiple 3. Ridurre l incidenza dell aborto 4. Ridurre il rischio di un bambino nato con un anomalia cromosomica 5. Ridurre il tempo per instaurare una gravidanza Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

15 TM Scopi dell utilizzo del 24sure TM Migliorare il successo dei cicli di IVF preferendo gli embrioni euploidi per il transfer - Screening delle aneuploidie per tutti i cromosomi/ bracci cromosomici a partire da: - Cellule singole (globuli polari, blastomero), - Cellule multiple (trofoectoderma) Caratteristiche del Test facilmente interpretabile no evidenza di CNP / no analisi del fenotipo/ no risultati eticamente opinabili (patologie a tarda insorgenza, predisposizione al cancro, piccoli CNV/sbilanciamenti de novo di significato sconosciuto) Rapido(12-24 ore) basso costo per campione/ allestimento laboratorio Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

16 Diagnosi preimpianto INDICAZIONE 1 Analisi dell assetto cromosomico per l identificazione di aneuploidie dell embrione Tale diagnostica viene comunemente chiamata PGS (Pre-Implantation Genetic Screening), rivolta a: Ripetuti fallimenti di impianto ( 3 cicli FIVET o ICSI) Abortività ricorrente ( 3) Mosaicismo cromosomico Rischio di ricorrenza Infertilità maschile grave (azoospermia)

17 Diagnosi preimpianto INDICAZIONE 2 Identificazione di specifiche anomalie genetiche in coppie a rischio di trasmissione di malattie Mendeliane (monogeniche) Karyomapping - o patologie cromosomiche note (numeriche o strutturali) 24sure+. La tecnica consente di escludere dal trasferimento in utero gli embrioni geneticamente/cromosomicamente anormali (PGD). Coppie infertili che sono portatrici sane di uno specifico difetto genico o cromosomico Coppie in cui uno dei partner è affetto da una specifica malattia genetica o è portatore di anomalia cromosomica (traslocazione bilanciata, reciproche e Robertsoniane).

18 Array CGH -piattaforma 1 2 PGS 24sure PGD 24sure+ (preimplantation genetic screening) (preimplantation genetic diagnosis) Piattaforma (BAC) completa, dall amplificazione all hardware, per l analisi della singola cellula Protocolli brevi 12 ore dal campione al referto risultati robusti e chiari Standard ampiamente accettato con numerose pubblicazioni/rcts e più di campioni clinici analizzati ad oggi

19 Karyomapping -piattaforma Caratteristiche Descrizione Numero di markers SNPs Numero di campioni 12 Concentrazione DNA 50 ng/µl Tipologia di saggio Infinium Karyomapping Strumento HiScanSQ, HiScan, iscan Piattaforma BeadChip completa HumanKaryomap-12, dall amplificazione all hardware, per l analisi della singola cellula Protocolli brevi 24 ore dal campione al referto risultati robusti e chiari

20 Processamento overview PB (day 0) Solo materno(80%) 8-16 per ciclo No mosaicismo Realizzata durante il ciclo No parte dell embrione Blastomero (day 3) Materno/paterno 6-8 per ciclo Mosaicismo Realizzata durante il ciclo Trofoectoderma (day 5) Materno/paterno 4-6 per ciclo Mosaicismo ma ad uno stadio più tardivo Analisi molto rapida Lo screeninggenetico preimpianto (PGS) ha lo scopo di superare l aneuploidia selezionando per l impianto solo gli embrioni euploidi. Dibattito aperto su quale biopsia cellulare è più informativa

21 Protocollo 24sure TM 24sure BAC microarray 3226 BAC: cloni scelti in duplicato e ottimizzati rispetto alle performancesu piùdi pazienti in analisi post-natali Cloni disegnati per minimizzare la rilevazione dei CNP utilizzando un database interno di più di casi di pazienti analizzati in acgh Amplification SurePlex (Rubicon Genomics technology) Labelling BlueGnome Fluorescence labelling kit Arrays 24sure Analysis software BlueFuse Multi Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

22 Protocollo 24sure TM Rapido risultati in ~ 12 ore dal ricevimento del campione Permette di determinare il copy number di ogni cromosoma Amplificazione (3 h) 2-5 µg DNA Singola Cellula lavaggi, asciugatura, scansione (1 h ) Marcatura (2 h) Ibridazione (3 h o O/N) Auto import e batch process nel BlueFuse Multi Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

23 Protocollo 24sure TM amplificazione 24sure -QC checkpoint Cellule 1, 2, 3, 4, 6 amplificate correttamente Cellula 5 non amplificata Controllo negativo (acqua) correttamente non amplificato Controllo positivo (100 pg di DNA genomico femminile) correttamente amplificato Tutti i campioni amplificati sono stati marcati e ibridati Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

24 Tecnologia CGH DNA dell embrione DNA diploide Trisomia Monosomia Normale Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

25 TM 24sure TM Single channel technology

26 24sure TM plus Dual channel technology 24sure +

27 Inputare Dettagli del Paziente Planner Sperimentale Step1

28 Planner Sperimentale Step2

29 Creazione automatica dell import file Batch import e analisi dei dati

30 24sure V3 risultati Campione vs riferimento maschile Campione vs riferimento femminile Campione mostrato come dye-swap notare sex-mismatch/match

31 Calling calling per le aneuploidie Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

32 Report Stima della confidencenelle calling per le aneuploidie Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist Calling automatiche

33 24sure + In quali casi? 24sure+ PGS dei prodotti derivati, conoscendo il cariotipo dei genitori 24sure+ array 0.5Mb copertura più alta nelle regioni sub-telomeriche / pericentromeriche

34 Applicazioni Il 24sure+ si applica preferenzialmente nei casi di aborti ripetuti dove si sospettano traslocazioni negli embrioni Genitori portatori di traslocazioni bilanciate che si sottopongono a cicli di IVF Rileva sia le traslocazioni che le aneuploidie per ogni embrione Utilizzabile per le traslocazioni reciproche / robertsoniane / complesse, per le inversioni e i cromosomi ad anello Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

35 Traslocazione Reciproca t(2:5)(q21;q31) Piùalta risoluzione del 24sure+ che permette lo screeningdei prodotti derivati dai genitori portatori di traslocazione Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

36 Risultati Concordanti I risultati sono concordanti con il cariotipo dei genitori portatori della traslocazione In questo caso le biopsie di 4 blastomeri al day 3 identifica lo stesso break point, coerente al cariotipo parentale t(2;22) Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

37 Validazione Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

38 ESHRE technical validation (2011) 5000 campioni, 500 cicli 6 centri RCT in progress

39 Secondo studio ESHRE A seguito del successo ottenuto con il primo studio ESHRE del 2011, il 24sure è stato selezionato per la fase successiva: trial clinico randomizzato, controllato, in doppio cieco che coinvolge 600 coppie 5 centri PGD in Europa Valutare l impatto della PGS su PB sui nati vivi L aneuploidia negli ovociti in un ciclo è predittiva dell aneuploidia nei cicli successivi? Giusy Stoico -Molecular Genetics Product Specialist

40 Allestimento Laboratorio

41 Allestimento Laboratorio

42 PGD -Karyomapping Analisi di linkage genomica ad alta densità dell aplotipo attraverso una piattaforma SNPs per la rilevazione dell ereditarietàdei difetti di singolo gene da una singola cellula embrionale. Utilizzabile per qualsiasi patologia monogenica I campioni di partenza sono gli stessi della metodica in acgh Analisi dei dati attraverso il software BlueFuseMulti Applicazione Coppie con precedente figlio affetto Coppie portatrici di difetto monogenico Handyside et al (2010) J Med Genet 47,

43 Karyomapping Padre (portatore) Madre (portatrice) Bambino (affetto) Embrione 1 (non affetto) Embrione 2 (portatore) Embrione 3 (portatore) Embrione 4 (affetto)

44 Karyomapping OBIETTIVO Determinare se gli embrioni ereditano gli stessi cromosomi dei genitori e del riferimento (precedente figlio affetto) ALGORITMO 1.Trovare i loci SNP informativi 2.Determinare la fase comparando il genotipo dell embrione al genotipo di riferimento 3.Analisi con BlueFuse Multi

45 Karyomapping Dalla letteratura Fino ad ora, la PGD è stata condotta esaminando l ereditarietà delle STR adiacenti a specifici loci. Ogni test STR per una patologia genetica deve essere sviluppato individualmente per ogni coppia che richiede l analisi e per ogni patologia, richiedendo settimane o mesi di lavoro e molta esperienza. La PGD delle malattie monogeniche attraverso il karyomapping non richiede lo sviluppo di un test specifico riducendo notevolmente il tempo impiegato per l analisi.

46 Come lavora il karyomapping? Recuperando il DNA dai genitori e da un parente stretto con uno stato noto di malattia (per esempio un precedente figlio affetto), il metodo opera una genotipizzazione degli SNPs. Per ogni embrione, gli SNPs sono utilizzati per identificare l origine parentale dei cromosomi per tutti i loci.

47 Come lavora il karyomapping? Una volta determinato il locus per la specifica malattia, può essere determinato se il tratto di DNA parentale che porta la mutazione combacia con il tratto del DNA embrionale e a quel punto si definisce l embrione affetto. Se il DNA parentale mutato non combacia con il DNA embrionale, allora l embrione sarà considerato sano e potrà essere un buon candidato per il transfer.

48 Karyomapping -Principio Analisi genomica del trio di un set di circa SNPs presenti sull array che possono assumere quattro valori: AA, AB, BB, o NC (no call). A = nucleotidi A e T B = nucleotidi G e C Identificazione degli SNPs informativi (circa 20-40%), cioè degli SNPs sicuramente ereditati da uno dei due genitori. A questo scopo, lo SNP di un genitore deve necessariamente avereun genotipo eterozigote mentre l altro dovrà essere omozigote. In una tipica analisi saranno presenti circa 60, ,000 misurazioni cosiddette phasing con una spaziatura di 15.5 kb 31 kb.

49 Karyomapping Esempio Padre Madre Informativo? 1 AB AA Informativo per il padre 2 AB BB Informativo per il padre 3 AA AB Informativo per la madre 4 BB AB Informativo per la madre 5 AA BB Non informativo 6 AA AA Non informativo 7 AB AB Non informativo 8 BB BB Non informativo 9 BB AA Non informativo L allele informativo è rappresentato in rosso ed è utilizzato per capire la fase dello SNPs dell embrione rispetto al riferimento

50 Karyomapping 1. Embrione E Riferimento ereditano o non ereditano l allele informativo, allora erediteranno lo stesso cromosoma del genitore. 2. Embrione eredita l allele informativo e il Riferimento non lo eredita (o viceversa), allora erediteranno diversi cromosomi parentali. Se l embrione eredita lo stesso cromosoma del riferimento è detto in fase, se l embrione eredita un cromosoma diverso rispetto al riferimento è detto non in fase (phasing relativo al riferimento) Il risultato del phasing descrive in che modo ogni embrione eredita lo stesso cromosoma del riferimento ad ogni localizzazione SNP informativa. Determina quali cromosomi sono ereditati dall embrione rispetto al riferimento.

51 Karyomapping -Tecnologia I STEP: amplificazione del DNA proveniente dal blastomero o dalla biopsia del trofoectoderma per ottenerne una quantità utilizzabile per il protocollo Infinium. II STEP: preparazione del DNA amplificato e di quello dei genitori e del riferimento per l ibridazione sul vetrino HumanKaryomap-12 BeadChip. Il protocollo completo comprensivo dell amplificazione del materiale di partenza necessita di 24 ore per essere completato.

52 Karyomapping

53 Karyomapping -Tecnologia

54 Human Karyomap12 Workflow

55 Analisi dei dati Riferimento Embrione M P M P Riferimento Embrione M P M P Scenario ideale Scenario reale

56 Diagnosi Riferimento Embrione M P M P AFFETTO

57 Diagnosi Riferimento Embrione M P M P PORTATORE PATERNO

58 Diagnosi Riferimento Embrione M P M P NON AFFETTO

59 BFM -Visualizzazione

60 BFM -Visualizzazione

61 BFM v4.3 -Karyomapping Fornito come modulo separato Casi allocati in un database dedicato Caratteristiche dell analisi: Rilevazione Automatica degli aploblocchi Karyotype view Visualizzazione dei dati nelle regioni di interesse Reports contenenti i dettagli del caso, la statistica dei dati nella regione e nel campione Inserimento guidato

62 Courtesy of Case View: monosomia

63 Courtesy of Case View: trisomia

64 Validazione del Karyomapping Analisi retrospettiva di 44 casi per 26 PGD sono stati condotti in collaborazione con sei laboratori Un totale di 218 embrioni (75% Blastomeri e23% biopsie TE) sono stati analizzati con il Karyomapping e confermati con l analisi STR. 179 (82%) embrioni con risultati confrontabili all analisi STR 18 (8%) embrioni con risultati migliori dell analisi STR 13 (6%) embrioni con risultati significativi al Karyomapping ma non significativi all analisi STR 3 (1%) embrioni con eventi di crossover vicino al gene di interesse e hanno dato risultati coerenti con l analisi Karyomapping

65 Grazie per l attenzione! giusy.stoico@technogenetics.it Dr.ssa G. Stoico Molecular Genetics Product Specialist Technogenetics s.r.l. (LO)