UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO FACOLTÀ DI SCIENZE MM.FF.NN. Corso di Laurea Specialistica in Biotecnologie Molecolari e Bioinformatica Tesi svolta presso l Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria del Consiglio Nazionale delle Ricerche - Milano INTRASPECIFIC VARIABILITY AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF THE BETA-TUBULIN GENE FAMILY IN Linum usitatissimum Relatore: Dott. Piero Angelo Morandini Correlatore: Dott.ssa Laura Morello Tesi di Laurea di: GAIA PIGNA Matr Anno Accademico 2010/ 2011

2 RIASSUNTO Il lino (Linum usitatissimum L.) è una pianta da olio e fibra, coltivata dall uomo sin dal neolitico. In Italia, durante il medioevo, questa coltura era molto diffusa, soprattutto nelle regioni centro-settentrionali, per ricavare fibra tessile. A partire dal ventesimo secolo, il lino è stato soppiantato dal cotone e dalle fibre sintetiche. Negli ultimi anni, però, sono emersi nuovi impieghi del lino, suscitando nuovamente interesse per questa pianta. L olio di lino, infatti, si è rivelato di ottima qualità in particolar modo per il suo elevato contenuto in acidi grassi insaturi, e viene usato nell alimentazione umana. Attraverso la purificazione dell olio di lino è possibile isolare i componenti ω-3 e ω-6 dei quali è particolarmente ricco, ottenendo così prodotti preziosi dal punto di vista nutraceutico e farmaceutico. L olio può essere inoltre impiegato per la sintesi di prodotti industriali quali biodiesel, bio-lubrificanti e polimeri biocompatibili utilizzabili potenzialmente per il drug-delivery. La fibra che si ottiene da lino coltivato per la produzione di olio è fibra corta, detta anche fibra tecnica che può essere utilizzata nell edilizia, in materiali compositi con materie plastiche tradizionali, nell industria automobilistica e aereonautica, grazie alla sua resistenza e leggerezza. Anche il panello, residuo della spremitura dell olio, contiene un elevata quantità di proteine, ed è quindi utilizzabile per la produzione di alimenti a uso umano e mangimi animali. Dalle nuove potenzialità del lino scaturisce l interesse alla reintroduzione di questa coltura sul territorio lombardo. È molto importante conoscere la variabilità genetica allo scopo di sviluppare nuovi programmi di breeding finalizzati allo sviluppo di piante con nuovi caratteri agronomici rilevanti. La caratterizzazione genetica del lino è iniziata solo negli ultimi anni mediante l utilizzo di marcatori molecolari. Il primo scopo di questa tesi è proprio quello di effettuare una caratterizzazione molecolare di sette varietà di lino di origine italiana e francese, mediante due tipi di marcatori genetici: TBP (Tubulin Based Polymorphism); SSR (Sigle Sequence Repeat)

3 Il TBP (Tubulin Based Polymorphism) è un innovativo metodo di caratterizzazione molecolare basato sul polimorfismo di lunghezza degli introni dei geni di betatubulina di pianta, ideato e applicato dal laboratorio in cui ho svolto la tesi. Questo sistema ha tra i suoi vantaggi la capacità di genotipizzare specie vegetali anche in assenza di dati di sequenza. Utilizzando una sola coppia di primer universali si ottiene un amplificato in grado di fornire un profilo caratteristico di specie o varietà. Il metodo TBP si è rivelato utile per una semplice caratterizzazione molecolare delle sette varietà di lino fornendo un profilo distintivo per ognuna. L analisi dei risultati ci ha inoltre mostrato che i singoli individui non sono distinguibili mentre i profili delle sette varietà sono estremamente riproducibili. Dall esame del dendrogramma, basato sui coefficienti di similarità, abbiamo osservato che le sette varietà raggruppano in due gruppi distinti. I risultati ottenuti mediante analisi TBP sono stati confrontati con quelli ottenuti dell analisi mediante SSR. Sono stati scelti e testati 29 marcatori (15 Genomic- SSR e 14 EST-SSR) sulla base dei dati riportati in letteratura. Ventuno si sono rivelati polimorfici e ci hanno permesso di distinguere ogni varietà. Per ogni marcatore SSR sono stati calcolati i valori di PIC (Polymorphism Information Content), il numero di loci e di alleli individuati e questi valori sono stati confrontati con quelli riportati in letteratura. Abbiamo infine ottenuto e confrontato il dendrogramma, basato sui coefficienti di similarità, con quello ottenuto dall analisi TBP. Il secondo scopo di questa tesi, è stato quello di valutare come varia l espressione dei diversi isotipi di β-tubulina in varie parti della pianta e in particolare in relazione allo sviluppo della fibra. Infatti, il citoscheletro svolge un ruolo determinante nell accrescimento e sviluppo delle fibre. La composizione della parete, la lunghezza e la resistenza della fibra sono in buona misura fattori geneticamente determinati. La fibra di lino è una fibra estremamente allungata di tipo floematico (bast fibers), le cellule crescono per intrusione allungandosi tra i vasi del fascio fino a diversi centimetri. Nelle cellule la crescita anisotropica è determinata dalla deposizione delle microfibrille di cellulosa, perpendicolarmente all asse di allungamento della cellula. A sua volta l orientamento delle microfibrille di cellulosa è guidato

4 dall orientamento dei microtubuli corticali. Questi ultimi sono cilindri cavi dati dall associazione di monomeri di α e -tubuline e determinano la forma e la polarità cellulare. Quando i microtubuli si dispongono longitudinalmente rispetto alla fibra, cessa l allungamento e ha inizio la deposizione della parete secondaria. L allungamento e l ispessimento delle fibre sono in ultima analisi riconducibili alla modulazione della disposizione dei microtubuli. Le α e tubuline, nelle piante come negli animali, sono codificate da famiglie multigeniche. I singoli isotipi di tubulina di pianta presentano profili specifici di espressione nei diversi tessuti, in relazione allo sviluppo e in risposta a stimoli esterni o a segnali ormonali. Ad esempio in piante come cotone, pioppo ed eucalipto è stata osservata l espressione di particolari isotipi di α e β-tubulina associata alle fibre. Per studiare l espressione degli isotipi delle -tubuline di lino è stato innanzitutto necessario isolare i geni delle beta-tubuline da una delle sette varietà analizzate. Poiché alcune delle sequenze ottenute dal clonaggio si sono rivelate incomplete, siamo ricorsi all ausilio di alcune sequenze EST (Expressed Sequence Tag) di β- tubulina depositate in una banca dati canadese. In questo modo sono state ottenute 10 putative sequenze complete corrispondenti a 10 geni di β-tubulina. Le sequenze sono state quindi allineate ed è stato costruito un dendrogramma basato sulla similarità di sequenza. Abbiamo osservato la presenza di coppie di geni con elevata omologia di sequenza, Sibling genes, che possono indurci a pensare ad una duplicazione dell intero genoma. La lunghezza delle sequenze amminoacidiche dedotte oscilla tra 442 e 450, le differenze sono imputabili alla regione C-terminale. La porzione del trascritto a valle del codone di STOP (3 Untranslated Region), rappresenta la regione più variabile della sequenza nucleotidica, ed è proprio in questa regione che sono stati disegnati dei primer isotipo-specifici. Questi primer sono stati utilizzati per condurre un analisi di espressione mediante la reazione di reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) sugli RNA di due gruppi di tessuti. Il primo gruppo comprende diversi parti della pianta, il secondo è costituito da 3 sezioni distinte dello stelo. Entrambi i gruppi hanno mostrato dei profili distinti per ogni putativo isotipo di β-tubulina. Il primo gruppo ci ha permesso di osservare come sia modulata l espressione dei putativi geni di β-tubulina durante le fasi di crescita della

5 pianta, il secondo ci ha permesso di correlare l espressione delle β-tubuline putative con lo sviluppo della fibra. La Ricerca è stata finanziata dal Progetto VeLiCa Da antiche colture materiali e prodotti per il futuro Accordo Istituzionale n 14840/RCC