WP 4 Caratterizzazione e gestione genetica di popolazioni zootecniche (Dr. Pizzi)

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1 WP 4 Caratterizzazione e gestione genetica di popolazioni zootecniche (Dr. Pizzi) WP4 Obiettivo 1: Tipizzazione high-throughput delle razze bovine per la diagnostica e la selezione. Obiettivo. Messa a punto e trasferimento alle PMI lombarde del settore biotecnologico di una metodologia innovativa, altamente automatizzata, di semplice esecuzione ed economica per la genotipizzazione simultanea di SNP nella specie bovina utilizzando la tecnologia dei DNA chip. In particolare si intende definire un panel di 50 SNP con dirette implicazioni sulla sintesi delle proteine e del grasso del latte, nella suscettibilità a malattie genetiche e per le indagini di parentela. Azioni svolte nel IX semestre (mesi 51-56): Negli ultimi anni è stata data molta importanza alla composizione in acidi grassi del latte sia per salute umana. Analisi genetiche condotte sul latte dei ruminanti hanno dimostrato una variabilità elevata e discretamente ereditabile per la composizione in acidi grassi. Individuando regioni genomiche o singoli geni che mostrano un effetto sui componenti del latte, è possibile impostare incroci selettivi che permettano di modificarne il contenuto. La stima di tali effetti deve però essere assistita da marcatori. Scopo del lavoro di questo semestre è stato pertanto quello di verificare sul latte di vacche di Frisona Italiana gli effetti dei 96 SNP (di cui 84 in geni responsabili della sintesi proteica o coinvolti nel metabolismo lipidico) che costituiscono il pannello da noi messo a punto precedentemente. Come descritto più in dettaglio nelle precedenti relazioni, sono stati raccolti 380 campioni individuali di sangue e di latte in 27 allevamenti di bovine di razza Frisona. Sono stati registrati i dati produttivi (Kg di latte, percentuale in grasso e proteina, cellule) ed è stata determinata la composizione acidica del latte. La genotipizzazione degli animali con il pannello dei 96 SNP selezionati è stata effettuata mediante la tecnologia Illumina Golden Gate. zo del software SAS/STAT (ANOVA) su un dataset finale che comprendeva 351 vacche figlie di oltre 220 tori. Dei 96 SNP selezionati, 8 avevano un Call Rate (CR) minore di 0,83, 8 sono risultati monomorfici, riore a 0,05 e 2 non erano in equilibrio di Hardysono stati utilizzati 59 SNP. Sono state trovate associazioni statisticamente significative (P<0.05) per quasi tutti i fenotipi considerati con un numero di SNP variabile da 1 a 11. Gli SNP risultati più interessanti (in grassetto nella tabella) sono: BTA-a, CSN2-c, CSN3-c, LTF-a e LTF-c, PPARGC1A-a ed PPARGC1A-f, SCD, STAT5 e TG. Lo SNP CSN2-c è responsabile del cambiamento aminocidico che distingue il gruppo di alleli A1/B/C da tutti gli altri alleli, mentre lo SNP CSN3-c permette di distinguere la variante E, per la quale è già noto un effetto negativo sulla caseificazione. Nella Tabella 1 sottostante sono riportati i risultati ottenuti per i fenotipi analizzati, ossia le informazioni relative agli SNP analizzati e la loro associazione con caratteri produttivi. ulterio 32

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8 WP4 Stoccaggio di materiale seminale ed eventualmente embrioni di: i.) bovini di razza Varzese, ii.) ovini di razza Brianzola, iii) tre razze caprine Azioni svolte nel IX semestre (mesi 51-56): Razza bovina Varzese I tre nuovi donatori della Banca delle Risorse Genetiche Animali Lombarde sono ancora in attesa Anagrafico. Non essendo disponibili nuovi soggetti da avviare al prelievo di materiale seminale, la costituzione della riserva genetica relativa alla razza bovina Varzese si considera conclusa. Risorse Genetiche Animali Lombarde sono stoccate 1222 dosi di materiale seminale raccolte da 5 tori (Tabella 2). Per ragioni di sicurezza le dosi di materiale seminale raccolte da ciascun riproduttore sono state suddivise in due differenti tanks di stoccaggio come indicato dalle Linee Guida Internazionali (FAO, 2012; ERFP, 2003). stoccato come illustrato nella precedente rendicontazione. Razza Animale Tipo di materiale Unita* Sito di stoccaggio Varzese Toro 1 Seme 406 IBBA - PTP Varzese Toro 1 Sangue 12 IBBA - PTP Varzese Toro 1 Peli 3 IBBA - PTP Varzese Toro 2 Seme 293 IBBA - PTP Varzese Toro 2 Sangue 8 IBBA - PTP Varzese Toro 2 Peli 3 IBBA - PTP Varzese Toro 3 Seme 100 IBBA - PTP Varzese Toro 4 Seme 37 IBBA - PTP Varzese Toro 5 Seme 360 IBBA - PTP Varzese Toro 5 Sangue 12 IBBA - PTP Varzese Toro 5 Peli 3 IBBA - PTP *unità: seme = n. dosi, sangue = ml e peli = gr. Tabella 2 Resoconto del materiale stoccato nella Banca delle Risorse Genetiche Animale Lombarde relativo alla razza bovina Varzese Razza ovina Brianzola Per quanto riguarda la razza brianzola, in seguito a quanto indicato nella precedente rendicontazione, è stato effettuato il prelievo di materiale seminale con vagina artificiale da (CO). In totale sono state raccolte 75 dosi di materiale seminale, 2.2 ml di sangue e campioni di pelo da un unico riproduttore resosi disponibile al prelievo tramite vagina artificiale. creazione della 39

9 Capitani. Per prossimo semestre si stanno pianificando ulteriori prelievi di materiale seminale direttamente in azi maschi si effettuerà la sincronizzazione dei calori in un gruppo di femmine al fine di poter disporre di almeno un paio di femmine in calore al momento del prelievo. Parallelamente al fine di poter ampliare la riserva genetica della razza brianzola, si effettueranno ulteriori raccolte e congelamento di spermatozoi epididimali dai testicoli di soggetti maturi avviati alla macellazione. ella Banca delle Risorse Genetiche Animali Lombarde sono stoccate 282 dosi di materiale seminale raccolte da 10 arieti brianzoli (Tabella 3). Per ragioni di sicurezza le dosi di materiale seminale raccolte da ciascun riproduttore sono state suddivise in due differenti tanks di stoccaggio come indicato dalle Linee Guida Internazionali (FAO, 2012; ERFP, 2003). Razza Animale Tipo di materiale Unità* Sede di stoccaggio Brianzola Ariete 1 Seme 38 IBBA - PTP Brianzola Ariete 1 Peli 3 IBBA - PTP Brianzola Ariete 1 Sangue 8 IBBA - PTP Brianzola Ariete 2 Seme 42 IBBA - PTP Brianzola Ariete 2 Peli 3 IBBA - PTP Brianzola Ariete 3 Seme 25 IBBA - PTP Brianzola Ariete 4 Seme 2 IBBA - PTP Brianzola Ariete 5 Seme 13 IBBA - PTP Brianzola Ariete 6 Seme 28 IBBA - PTP Brianzola Ariete 7 Seme 35 IBBA - PTP Brianzola Ariete 7 Peli 3 IBBA - PTP Brianzola Ariete 7 Sangue 30 IBBA - PTP Brianzola Ariete 8 Seme 12 IBBA - PTP Brianzola Ariete 8 Peli 3 IBBA - PTP Brianzola Ariete 8 Sangue 12 IBBA - PTP Brianzola Ariete 9 Seme 12 IBBA - PTP Brianzola Ariete 9 Peli 3 IBBA - PTP Brianzola Ariete 9 Sangue 2 IBBA - PTP Brianzola Ariete 10 Seme 75 IBBA - PTP Brianzola Ariete 10 Peli 3 IBBA - PTP Brianzola Ariete 10 Sangue 2 IBBA - PTP *unità: seme = n. dosi, sangue = ml e peli = gr. Tabella 3 Resoconto del materiale stoccato nella Banca delle Risorse Genetiche Animale Lombarde relativo alla razza ovina Brianzola Razze caprine Nera di Verzasca, Orobica e Frisa Valtellinese Per quanto riguarda la razza Nera di Verzasca, contestualmente alla sperimentazione prevista nel Progetto Interreg Italia-Svizzera , avente come obiettivo la valutazione della fattibilità 40

10 Verzasca, è stato raccolto il materiale seminale di 3 nuovi donatori. Il materiale seminale ottenuto da ciascun riproduttore durante queste sperimentazioni è stato prevalentemente destinato alle fecondazioni artificiali effettuate direttamente in allevamento. Facendo coincidere i prelievi di materiale seminale sia per le sperimentazioni sopra citate che per la costituzione di LABank, il materiale destinato alla costituzione della riserva genetica della razza Nera di Verzasca consisteva nel raccolto ottenuto dal terzo salto, caratterizzato per motivi fisiologici, da un ridotto volume e da iale seminale utilizzato per le fecondazioni artificiali. Quindi il numero di dosi di materiale seminale stoccato per ciascun riproduttore in alcuni casi è esiguo. In totale sono state raccolte 38 dosi di materiale seminale, dai tre riproduttori sopracitati. Relativamente alla razza Frisa, è stato aggiunto nelle Banca un nuovo riproduttore al quale è stato effettuato prelievo di materiale genetico (seme, sangue e pelo). Da questo soggetto sono state raccolte 16 dosi di materiale seminale, 5 ml di sangue e 3g di pelo. i rispettivi tecnici in particolare per la razza Frisa Valtellinese, Dott. Stefano Giovenzana, tecnico della sezione ovi- ione Provinciale Allevatori di Sondrio; per la razza Orobica, Matteo Pensa, tecnico della sezione ovidi Lecco e per la razza Nera di Verzasca, Associazione Regionale Allevatori della Lombardia e la Comunità Montana Valli del Verbano. Per le razze Frisa e Orobica tali attività potrebbero aver luogo durante la prossime fiere del settore in cui si raduna un elevato numero di potenziali nuovi riproduttori: XXII Mostra Regionale della Capra Orobica (18 novembre 2012, Casargo LC) e la XIX Mostra della Capra Frisa Valtellinese (2 dicembre 2012, Grosio SO). dosi di materiale seminale raccolte da 25 becchi delle tre razze caprine in questione (Tabella 4). Per ragioni di sicurezza le dosi di materiale seminale raccolte da ciascun riproduttore sono state suddivise in due differenti tanks di stoccaggio come indicato dalle Linee Guida Internazionali (FAO, 2012; ERFP, 2003). 41

11 Razza Animale Tipo di materiale Unita* Sito di stoccaggio Verzaschese Becco 1 Seme 103 IBBA - PTP Verzaschese Becco 2 Seme 222 IBBA - PTP Verzaschese Becco 3 Seme 34 IBBA - PTP Verzaschese Becco 4 Seme 317 IBBA - PTP Verzaschese Becco 5 Seme 7 IBBA - PTP Verzaschese Becco 5 Sangue 12 IBBA - PTP Verzaschese Becco 5 Pelo 3 IBBA - PTP Verzaschese Becco 6 Seme 8 IBBA - PTP Verzaschese Becco 6 Sangue 12 IBBA - PTP Verzaschese Becco 6 Pelo 3 IBBA - PTP Verzaschese Becco 7 Seme 4 IBBA - PTP Verzaschese Becco 7 Sangue 12 IBBA - PTP Verzaschese Becco 8 Seme 18 IBBA - PTP Verzaschese Becco 9 Seme 2 IBBA - PTP Verzaschese Becco 10 Seme 17 IBBA - PTP Verzaschese Becco 10 Sangue 6 IBBA - PTP Verzaschese Becco 10 Pelo 3 IBBA - PTP Orobica Becco 1 Seme 27 IBBA - PTP Orobica Becco 1 Sangue 12 IBBA - PTP Orobica Becco 1 Pelo 3 IBBA - PTP Orobica Becco 2 Seme 16 IBBA - PTP Orobica Becco 2 Sangue 12 IBBA - PTP Orobica Becco 2 Pelo 3 IBBA - PTP Orobica Becco 3 Seme 8 IBBA - PTP Orobica Becco 4 Seme 18 IBBA - PTP Orobica Becco 5 Seme 12 IBBA - PTP Orobica Becco 5 Sangue 15 IBBA - PTP Orobica Becco 6 Seme 11 IBBA - PTP Orobica Becco 7 Seme 11 IBBA - PTP Orobica Becco 7 Sangue 15 IBBA - PTP Orobica Becco 8 Seme 10 IBBA - PTP Orobica Becco 8 Sangue 8.5 IBBA - PTP Orobica Becco 9 Seme 5 IBBA - PTP Orobica Becco 9 Sangue 8.5 IBBA - PTP Frisa Becco 1 Seme 7 IBBA - PTP Frisa Becco 1 Sangue 12 IBBA - PTP Frisa Becco 1 Pelo 3 IBBA - PTP Frisa Becco 2 Seme 8 IBBA - PTP Frisa Becco 2 Sangue 12 IBBA - PTP Frisa Becco 2 Pelo 3 IBBA - PTP Frisa Becco 3 Seme 22 IBBA - PTP Frisa Becco 3 Sangue 12 IBBA - PTP Frisa Becco 3 Pelo 3 IBBA - PTP Frisa Becco 4 Seme 7 IBBA - PTP Frisa Becco 4 Sangue 12 IBBA - PTP Frisa Becco 4 Pelo 3 IBBA - PTP Frisa Becco 5 Seme 7 IBBA - PTP Frisa Becco 5 Sangue 12 IBBA - PTP Frisa Becco 5 Pelo 3 IBBA - PTP Frisa Becco 6 Seme 16 IBBA - PTP Frisa Becco 6 Sangue 5 IBBA - PTP Frisa Becco 6 Pelo 3 IBBA - PTP *unità: seme = n. dosi, sangue = ml e peli = gr. Tabella 4 Resoconto del materiale stoccato nella Banca delle Risorse Genetiche Animale Lombarde relativo alle razze caprine Verzaschese, Orobica e Frisa 42

12 Requisiti Sanitari Nelle specie ovina e caprina non essendo disponibile un protocollo standard riguardo la certificazione dello stato sanitario del donatore in caso di prelievo di materiale seminale imentale della Lombardia sanitaria del materiale genetico stoccato i donatori sono stati quindi testati per le seguenti patologie: Brucella abortus/melitensis, Chlamydophilas psittaci, Febbre Q da Coxiella burneti, Toxoplasma goondi, Brucellosi ovicaprina, CAEV (artrite encefalite), Visna medi, Mycobacterium avium subs paratubercolosis. Software Cryoweb Tutte le informazioni relative ai nuovi donatori, compreso il loro stato sanitario, al materiale genetico stoccato e alla localizzazione dei campioni conservati presso la Banca delle Risorse Genetiche Animali Lombarde sono state archiviate utilizzando il software CryoWeb illustrato nelle precedenti rendicontazioni. Attività di divulgazione Le attività relative alla creazione di LABANK e contestualmente al prelievo, al congelamento e allo stoccaggio del materiale sem della pubblicazione finale del Progetto Interreg in un capitolo intitolato: Costituzione della riserva e Risorse durante il Convegno Interreg Nera di Verzasca, che si terrà a Sogogno (Svizzera) il Pubblicazioni 1. Turri F, Madeddu M, Gliozzi TM, Gandini G, Pizzi F, 2012: Influence of recovery methods and extenders on bull epididymal spermatozoa quality. Reprod Dom Anim, Vol 47, pages Turri F, Madeddu M, Gliozzi TM, Gandini G, Pizzi F, Cryopreservation of buck (Capra hircus) epididymal spermatozoa as a tool to improve genebanking in local breeds: effects of testicles storage temperature and post-mortem time. SLTB (The Society for Low Temperature Biology) Conference Advances in Low Temperature Biology. London, ottobre

13 WP4 Obiettivo 3: Sviluppo di modelli per introdurre il miglioramento genetico nelle razze caprine locali lombarde. razze caprine locali, considerando la presenza o assenza di prove di pr performance test, l'eventuale introduzione di nuclei di selezione, la diffusione dei controlli funzionali, la dimensione della popolazione. Azioni svolte nel IX semestre (mesi 51-56): Il lavoro svolto nel corso dell'viii semestre era stato quello di sviluppare il software, detto SELCAPRE, posto sul web, per simulare, da parte di chiunque sia interessato, la selezione nel caso-popolazione specifico. Si ricorda che SELCAPRE deriva dai software sviluppati nel corso del progetto (per gli studi di simulazione delle diverse strategie di selezione) effettuati nei semestri precedenti ed è utilizzabile on-line tramite una interfaccia web da noi sviluppata. In questo semestre si è lavorato al miglioramento del software SELCAPRE, e della relativa interfaccia web, e parallelamente allo sviluppo del report generale, da finalizzare nell'ultimo semestre. Per quanto riguarda il software SELCAPRE: o è stato ampiamente collaudato, sono stati individuati alcuni piccoli problemi e imperfezioni che si è provveduto a correggere; o è' stata inserito all'interno dell'interfaccia un sistema che permette agli utenti di ricevere i risultati delle loro simulazioni via mail. I risultati sono costituiti da due file: Il primo riporta in forma grafica l'andamento della consanguineità e del miglioramento genetico durante i 25 anni di simulazione: questo consente non solo di stimare il progresso genetico atteso e gli incrementi di consanguineità a pieno regime di selezione, ma anche i loro andamenti nei primi anni di selezione dove la risposta è inferiore e spesso altalenante. (vedi fig.1) FIGURA 1: File 1 dei Risulta invia via . 44

14 Il secondo è un file excel che contiene informazioni più tecniche, in particolare: incremento genetico annuo, numero medio di padri di becco utilizzati ogni anno, numero medio di giovani becchi utilizzati ogni anno, consanguineità media e valore genetico medio dei nati per anno di simulazione e infine parametri e tempi di simulazione (vedi fig.2) FIGURA 2: File 1 dei Risulta invia via . Per quanto riguarda lo sviluppo di strategie di selezione da inserire nel report finale: o si è avviata la discussione per una analisi del caso capra Verzaschese (si ricorda che nel Tutorial di SELCAPRE era stato inserito un semplice esempio sulla capra Verzaschese) con i tecnici della ARAL. Nel corso dell'ultimo semestre di lavoro l'analisi verrà completata in stretta collaborazione con i tecnici dell'aral. 45

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