Analisi qualitativa e quantitativa delle proteine e degli acidi nucleici attraverso indagini spettroscopiche

Transcript

1 Analisi qualitativa e quantitativa delle proteine e degli acidi nucleici attraverso indagini spettroscopiche

2 TECNICHE SPETTROSCOPICHE Sono le tecniche che usano l'interazione delle radiazioni elettromagnetiche con la materia La luce, il calore,le radioonde, le microonde, i raggi X sono radiazioni elettromagnetiche che si propagano come onde elettromagnetiche. Un'onda elettromagnetica è costituita da un campo elettrico e uno magnetico che viaggiano insieme l'uno perpendicolarmente all'altro.

3 CARATTERISTICHE DELLE ONDE ELETTROMAGNETICHE LUNGHEZZA D ONDA (l): rappresenta la distanza tra due massimi FREQUENZA (n): numero di oscillazione che avvengono nell unita di tempo (Hertz= 1 ciclo/secondo)

4 Tutte le onde elettromagnetiche (indipendentemente dalla loro l e n) si propagano nel vuoto con la stessa velocità.la velocità della luce: ~ 3 x 10 8 m sec -1 La radiazione elettromagnetica trasporta una quantità di energia inversamente proporzionale alla sua lunghezza d onda (l) Ē = h u = h c u= c/l l La l della radiazione è in relazione con l Energia contenuta in un quanto Ē = energia in un quanto (espresso in Kcal) h = cost. di Plank = 6.62 x erg sec u = freq. della radiazione (in Hertz) c = veloc. luce nel vuoto (~ 3 x 10 8 m sec-1) l = lunghezza d onda

5 Le radiazioni elettromagnetiche possono essere descritte non solo come fenomeni ondulatori, ma anche come particelle, FOTONI a cui è associata ENERGIA. L energia associata a ciascun fotone è proporzionale alla frequenza della radiazione elettromagnetica secondo la costante h (costante di Plank) Spettro delle radiazioni elettromagnetiche E=hn n= c/l E=h (c/l) c =velocità della luce nel vuoto La lunghezza d onda è inversamente correlata alla frequenza (n) L energia è inversamente proporzionale alla lunghezza d onda (l)

6 Le radiazioni elettromagnetiche sono onde caratterizzata da una lunghezza d onda (l), da un ampiezza e da una frequenza (u). Si possono considerare come un treno di particelle chiamati quanti o fotoni. Il fotone rappresenta l unità particolata delle radiazioni. Il quanto è la quantità di E contenuta in un singolo fotone.

7 Le tecniche spettroscopiche sono basate sullo scambio di energia che si verifica fra l energia radiante e la materia. In particolare, la spettrofotometria di assorbimento è interessata ai fenomeni di assorbimento delle radiazioni luminose della regione dello spettro elettromagnetico appartenenti al campo del visibile ( nm) e del vicino ultravioletto ( nm).

8 Spettrofotometria- tecnica di assorbimento UV-VIS Quando la radiazione elettromagnetica interagisce con una molecola verrà trasferita energia che determinerà una transizione elettronica per far passare la molecola da uno stato fondamentale ad uno eccitato.

9 L assorbimento di questi tipi di radiazioni da parte delle molecole è in grado di produrre delle transizioni energetiche degli elettroni esterni della molecole, sia impegnati che non impegnati in un legame. Questi elettroni possono essere: di tipo sigma (σ), costituiti da una nube elettronica addensata lungo l'asse di unione dei nuclei degli atomi interessati al legame (i legami semplici sono di tipo σ); di tipo π, costituiti da coppie di elettroni la cui maggior densità elettronica è situata al di fuori dell'asse di unione dei nuclei (come accade nei legami doppi o tripli). Gli elettroni π sono 'meno legati' e risultano perciò più facilmente eccitabili rispetto ai σ

10 Assorbimento dell Energia (E) delle radiazioni Nell atomo e nelle molecole allo stato fondamentale gli elettroni occupano i livelli energetici più bassi previsti dalle leggi della quantomeccanica. Assorbendo E essi passano a livelli energetici più alti: si ha cioè una transizione elettronica. Le variazioni di E provocate dall assorbimento delle radiazioni non avvengono con andamento regolare e continuo, ma secondo multipli interi di una unità discreta di E chiamata quantum caratteristica di ogni sostanza assorbente. Affinché una radiazione induca una transizione elettronica in un atomo o in una molecola, la sua Ē deve corrispondere esattamente alla differenza tra i 2 stati energetici dell atomo (o della molecola). DĒ = h u = h c/ l 1) In un atomo gli ē possono compiere salti di Ē solo tra i diversi livelli di orbitali

11

12 Di solito sono gli elettroni delocalizzati ad entrare in gioco, ad esempio quelli che partecipano al legame π nel doppio legame carbonio carbonio

13 CROMOFORI Si intende per cromoforo un raggruppamento chimico insaturo che risulta responsabile di un assorbimento caratteristico situato nella regione di lunghezza d onda compresa tra 180 e 1000 nm. I cromofori piu semplici sono costituiti da gruppi organici quali l etilenico, l acetilenico, il carbonilico, il carbossilico, il nitrico, il nitroso,

14 CHROMOPHORIC STRUCTURE Group Structure nm Carbonyl > C = O 280 Azo -N = N- 262 Nitroso -N=O 270 Thioketone -C =S 330 Nitrite -NO Conjugated Diene -C=C-C=C- 233 Conjugated Triene -C=C-C=C-C=C- 268 Conjugated Tetraene -C=C-C=C-C=C-C=C- 315 Benzene 261

15 L assorbimento della luce ad una data lunghezza d onda di una molecola dipende dai suoi gruppi funzionali (cromofori) Gruppo cromoforo Lunghezza d onda (nm) Triptofano 280 Tirosina 273 Fenilalanina 257 Legame peptidico 190, Eme (deossiemoglobina) 430,555 Eme (ossiemoglobina) 415, 541, 577 NADH

16 Cromofori nelle proteine Il legame peptidico (210 nm) W Centrato a 280 nm Ponte disolfurico (250 nm) F 257nm Y 274nm

17 Interazioni luce-materia (scattering) La spettrofotometria utilizza l energia associata alle radiazioni UV e VIS della luce che determina il fenomeno dell assorbimento

18 SPETTROFOTOMETRO

19 Funzionamento di spettrofotometri Lo spettrofotometro misura l intensità luminosa (O.D.) trasmessa da una sostanza in funzione della lunghezza d onda SORGENTE DI LUCE Per strumenti UV/VIS ci sono due lampade: 1 al tungsteno -----> VIS 1 all idrogeno o deuterio > UV La lunghezza d onda di 350 nm è il punto di switch fra l una e l altra.

20 - Monocromatore -----> seleziona la lunghezza d onda con prismi(rifrazione) o mediante reticoli (diffrazione). Viene definito potere risolutivo la capacità di separare radiazioni con lunghezza d onda molto vicine -Fessura di uscita (slit) della radiazione luminosa diretta verso il campione da analizzare - Cuvette: Il materiale usato dipende dalla lunghezza d onda usata. UV: cuvette in quarzo o polimetil metacrilato ( polistirene ) sopra i 350 nm vetro borosilicato o plastica -Rilevatori: misurano l assorbanza convertendo l energia luminosa in energia elettrica. (Fototubi, Fotomoltiplicatori, Fotodiodi)

21 Sia i fototubi che i fotomoltiplicatori si basano sull effetto fotoelettrico: Il materiale colpito (metallo) da un fascio di luce emette elettroni in maniera proporzionale al numero di fotoni incidenti. Il fototubo è formato da due placche metalliche alle quali è applicata una differenza di potenziale. Se una delle due placche viene colpita da un fascio di fotoni vengono emessi elettroni e quindi viene generata una corrente che è proporzionale all intensità del raggio di luce I fotodiodi sono micro-circuiti posti su chip di silicio che emettono segnali elettrici quando colpiti da una radiazione luminosa

22 Fotomoltiplicatore Un quanto di luce che entra nel fotomoltiplicatore estrae un elettrone dal fotocatodo. Questo viene accellarato verso un elettrodo, dinodo, da dove vengono liberati da 2 a 5 elettroni secondari. Questi a loro volta sono inviati a successivi dinodi (10-14) in modo da ottenersi successive moltiplicazioni di elettroni. Infine gli elettroni sono raccolti sull anodo generando una corrente che viene misurata mediante uno strumento di registrazione.

23 Spettrofotometro a singolo raggio Spettrofotometro a doppio raggio

24 SPETTROSCOPIA NELL'ULTRAVIOLETTO E NEL VISIBILE I principi teorici alla base della spettrofotometria correlano l'assorbimento della luce, alla Concentrazione di una sostanza assorbente, con il cammino ottico percorso dalla luce. Il rapporto tra la luce trasmessa (I) e quella incidente I 0 ( T ) è chiamato trasmittanza T=I/I o T=0 sostanza competamente opaca T=100% sostanza trasparente che non assorbe alcuna radiazione L'Assorbanza è uguale al logaritmo del reciproco della trasmittanza: A= log (1/T)= logi o /I

25 La luce assorbita da una soluzione può essere quantizzata e correlata alla sua concentrazione utilizzando la legge di Lambert-Beer A=ecl A= Assorbanza = log(1/t) = logi 0 /I e= coefficiente di estinzione molare Costante di proporzionalità dipende dalla natura del campione ed è pari all assorbanza di una soluzione 1M misurata in una cella di spessore di 1cm ad una determinata lunghezza d onda C = concentrazione l= cammino percorso dalla luce (cammino ottico) Secondo la legge di Lambert-Beer l assorbanza è proporzionale sia alla concentrazione della sostanza assorbente che allo spessore dello strato attraversato, per cui maggiore è la concentrazione delle molecole che passa dallo stato fondamentale a quello stato eccitato maggiore sarà l assorbanza

26 Andamento della assorbanza e della trasmittanza T A La trasmittanza è correlata alla concentrazione in maniera non lineare mentre assorbanza cresce linearmente con la concentrazione pertanto la concentrazione di un campione viene misurata come C= A/el

27 ANALISI QUALITATIVA Per effettuare analisi qualitative si fa uso di raggi policromatici a spettro continuo, poi separati tramite monocromatori nelle varie componenti (radiazioni monocromatiche). Riportando perciò i valori registrati in un grafico lunghezza d'onda-assorbimento, si ottiene lo spettro di assorbimento della sostanza esaminata. Per il fatto che ogni sostanza ha il suo spettro di assorbimento, l'esame di tali spettri permette di identificare una sostanza (per confronto diretto con campioni noti o tramite banche dati di spettri) o di controllarne il grado di purezza.

28 SPETTRO D'ASSORBIMENTO UNO SPETTRO D'SSORBIMENTO RAPPRESENTA L' ASSORBIMENTO DI UNA SOSTANZA IN FUNZIONE DELLA LUNGHEZZA D'ONDA Spettro di assorbimento della forma ossidata e ridotta del NAD

29 Le proprietà d assorbimento e quindi la distribuzione elettronica dei cromofori può variare in base: - allo stato di ionizzazione - alla polarità del solvente - al diverso stato di ossido-riduzione - alla interazione con altre molecole...un cambiamento dell intorno molecolare di un cromoforo può influenzare la l max Spettri di assorbimento della triptofano sintasi da S. typhimurium in presenza di L-serina a diversi valori di ph

30 CROMOFORI I cromofori possono avere degli spostamenti dello spettro verso: -lunghezze d onda maggiori, e in questo caso si parla di effetto batocromo o red shift; -Lunghezze d onda minori, e in questo caso si parla di effetto ipsocromo o blue shift. Oppure, si possono osservare: -aumento dell intensita, e in questo caso si parla di effetto ipercromico; -diminuzione dell intensita, e in questo caso si parla di effetto ipocromico.

31 EFFETTO IPSOCROMO (Blue Shift). Consiste nello spostamento a lunghezze d onda più basse (verso il blu) della λmax. Tale effetto dipende dalla presenza di gruppi funzionali, detti appunto ipsocromi, nelle adiacenze del cromoforo, che ne diminuiscono la delocalizzazione elettronica. EFFETTO BATOCROMO (Red Shift) Consiste nello spostamento a lunghezze d onda più alte (verso il rosso) della λmax. Tale effetto dipende dalla presenza di gruppi funzionali, detti appunto batocromi, nelle adiacenze del cromoforo, come può essere un doppio legame in α a un carbonile.

32 Effetto dei solventi sugli spettri di assorbimento EFFETTO SOLVENTE Il solvente può indurre una significativa variazione dei livelli energetici della molecola..

33 (H 2 O) Perturbazione da solvente Il cambiamento dello spettro d assorbimento fornisce informazioni sull accessibilità dei residui amminoacidici al solvente Effect of solvent polarity on the spectrum of tyrosine. Solvents: H 2 O (solid line) and 20% ethylene glycol (dashed line). Notice the increase in l max in the less polar solvent. Lo spettro di assorbimento di un cromoforo è solo parzialmente determinato dalla sua natura chimica L ambiente del cromoforo influenza le proprietà dello Difference spectra for tyrosine and tryptophan in 80% H 2 O, 20% ethylene glycol. Differente spectra can have negative values or De. spettro: - - ph - - polarità del solvente - - effetti di orientamento

34 Effetto del ph sullo spettro di assorbimento

35 Alcune applicazioni della spettofotometria UV-VIS Determinazione di conc. di sostanze che assorbono nell UV Determinazione di conc. di sostanze che non assorbono nell UV tramite reazione colorimetrica Spettri di assorbimento Determinazione di l max Spettri differenziali Cinetiche enzimatiche

36 MISURAZIONE DELL ASSORBANZA AD UNA LUNGHEZZA D ONDA PREFISSATA DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI UNA PROTEINA MEDIANTE LA LEGGE DI LAMBERT-BEER A= e c Determinazione della concentrazione proteica Dosaggio della Albumina Serica Bovina (BSA) purificata: metodo diretto a.misurare l assorbanza della soluzione di BSA a 280 nm b.utilizzare la legge di Lambert-Beer per calcolare la concentrazione (C) in base al coefficiente di estinzione della BSA espresso in mg/ml BSA: ε mg/ml a 280 nm = 0.67 OD

37 DETERMINAZIONE INDIRETTA DELLA CONCENTRAZIONE DELLE PROTEINEATTRAVERSO METODI COLORIMETRICI Numerose sostanze non hanno un coefficiente d'estinzione significativo nel visibile, ma possono reagire quantitativamente con un'altra sostanza a formare un prodotto colorato. Questa proprietà viene sfruttata per la determinazione quantitativa di tali sostanze..

38 Criteri di scelta di un metodo colorimetrico Specificità della reazione Campo di proporzionalità A/[C] Stabilità del colore Riproducibilità Limpidità della soluzione Sensibilità Convenienza (tempo/costo)

39 1 Metodo del Biureto - il reattivo del biureto consiste in una soluzione alcalina di solfato di rame contenente tartato di sodio e potassio. Gli ioni rameici formano un complesso di coordinazione con 4 gruppi NH ed ha un picco di assorbimento a 540 nm. 2-Metodo di Lowry (Folin-Ciocalteau) - il reattivo di Folin consiste in una soluzione di Sali di sodio degli acidi tungstico, molibdico e fosforico, che reagisce con I gruppi fenolici delle tirosine e produce, in presenza di ioni rameici, una colorazione porpora che ha un picco di assorbimento a 660 nm. 3-Metodo dell acido Bicinconinico(BCA)simile al Lowry 4- Metodo di Bredford (Blu Brillant comassie) - il blu di comassie è uno dei tanti coloranti che sono capaci di legarsi alle proteine. Esso produce un complesso colorato che assorbe la luce a 595 nm.

40 Metodo del biureto Peptide Chains ( color Biuret Complexes (purple Il reattivo del biureto è costituito da una soluzione alcalina di solfato di rame contenente tartrato di sodio e potassio In condizioni alcaline gli ioni rameici Cu 2+ formano un complesso di coordinazione con quattro gruppi NH presenti in altrettanti legami peptidici Il complesso che si forma assorbe luce nel visibile, con un picco a 540 nm

41 Metodo del biureto H2-CO-NH-CO- NH2 peptidicilegamiduealmenocontenentisostanzealcalinasoluzionein formano complessi blu (540 nm)con il rame 1mg/ml >sensibilepoco, selettivometodo (ottimo per campioni ad alta concentrazione:proteine del siero, negli alimenti)

42 Il metodo utilizza il REAGENTE DI FOLIN, una soluzione di Sali di sodio degli acidi tungstico, fosforico e molibdico. Questo reattivo reagisce con i gruppi aromatici di tirosina presenti nella proteina producendo in presenza di ioni rameici un colore blu/porpora. Il prodotto della reazione ha un massimo di assorbimento a circa 660 nm Sensibilità: inferiore a 10mg/ml Tris e tamponi Zwitterionici (PIPES, HEPES) interferiscono

43 Sensibile; subisce molte interferenze 660nm

44 Metodo dell acido bicinconinico (BCA). Simile al Lowry, dipende dalla conversione di Cu ++ in Cu + in condizioni alcaline che viene poi rilevato mediante reazione con il BCA per ottenere un color porpora letto a 562 nm. E più sensibile rispetto al Lowry (qtà inferiori a 0.5mg/ml) e più tollerante per la presenza di altri composti. Biuret reaction schematic. bicinchoninic acid Reaction schematic for the bicinchoninic acid (BCA) containing protein assay

45 Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976) Tale colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi amminici e carbossilici e tramite forze di van der Waals Il colorante è preparato come soluzione stock in acido fosforico Il metodo è un semplice procedimento costituito da un unico passaggio in cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina l assorbanza a 595 nm

46 OCH 2 CH 3 Coomassie Brilliant Blu R HN N SO 3 Na N+ SO 3 Na La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteina presente in soluzione. Pertanto l intensità del colore blu (e dunque l assorbimento) è proporzionale alla concentrazione proteica. In genere quantità uguali di proteine differenti legano la stessa quantità di colorante il saggio è indipendente dal tipo di proteina

47 Metodo di Bradford (1976) BlueCoomassiecoloranteilUtilizza interferenzepochesubisce; Sensibile (detergenti)

48 Dosaggio della concentrazione proteica in una miscela: metodo indiretto Quando la soluzione è una miscela di proteine diverse, non è possibile applicare la spettrofotometria diretta per determinarne la concentrazione. Le varie specie proteiche avranno, infatti, ciascuna coefficienti di estinzione diversi. In questo caso si procede per via indiretta tramite metodo colorimetrico. la BSA rappresenta la proteina di riferimento in quanto è stato possibile determinarne la concentrazione esatta per via spettrofotometrica.

49 Reazione Colorimetrica di Bradford Coomassie Blu in soluzione acida si lega alle proteine sviluppando una colorazione misurabile mediante uno spettrofotometro. Il massimo valore di assorbanza presentato dal colorante in soluzione è di 465 nm (λ max del colorante) ma quello del complesso colorante proteina (blu) subisce uno spostamento a 595 nm (λ max del complesso). Lo sviluppo di colore quindi si accompagna ad un aumento dell assorbanza del campione a 595 nm che è proporzionale alla quantità di proteine totali presenti nel campione. Per conoscere i valori di assorbanza a 595 nm dei complessi colorante-proteine (funzione della concentrazione proteica poiché il colorante è in largo eccesso) è necessario procedere alla costruzione della cosidetta retta di taratura del saggio. Essa si costruisce facendo reagire il reattivo di Bradford con quantità note e crescenti ( mg) di una soluzione di BSA di cui si è determinata la concentrazione con il metodo diretto.

50 Determinazione della concentrazione sconosciuta di proteine mediante metodo di Bradford A 595 Bradford 1)Costruzione di retta di taratura con proteina a concentrazione nota (BSA) colorata con il metodo di Bredford 2) Lettura allo spettrofotometro (O.D. 595nm) della soluzione proteica colorata con il metodo di Bradford 3)Determinazione della concentrazione proteica dalla retta di taratura

51 Altre applicazioni dell UV-VIS Spettri d assorbimento Spettri differenziali Cinetiche enzimatiche

52 SPETTRO D'ASSORBIMENTO UNO SPETTRO D'SSORBIMENTO RAPPRESENTA L' ASSORBIMENTO DI UNA SOSTANZA IN FUNZIONE DELLA LUNGHEZZA D'ONDA Spettro di assorbimento della forma ossidata e ridotta del NAD

53 Spettri d assorbimento Lo spettro d assorbimento può aiutare ad identificare una molecola

54 Spettri di assorbimento di singoli amminoacidi l max a nm l max a 278 nm l max a 274 nm l max a 295 nm

55 Spettri di assorbimento di proteine Spettro di assorbimento di quattro proteine: La tripsina ha un alto contenuto in tirosina, l albumina in fenilalanina, il chimotripsinogeno in triptofano e la gelatina (collagene) ha un basso contenuto in tutti e tre questi aminoacidi. Derivata prima dello spettro di assorbimento dell albumina, che ne mette in risalto il pattern a 5 bande tipico della fenilalanina.

56 Cromofori degli acidi nucleici

57 L assorbimento nell UV degli acidi nucleici dipende da transizioni elettroniche delle basi purine e pirimidiche e dal legame glicosidico C-N. Lo spettro di assorbimento varia da 230 nm a 280 nm con un massimo a 260 nm Determinazione della concentrazione DNA e RNA A 260nm =1 soluzione 50mg/ml di DNA 40mg/ml di RNA o DNA a singolo filamento

58 Per determinare la concentrazione degli acidi nucleici si usa anche il coefficiente di estinzione specifico (K) che sostituisce ε. K è stato determinato sperimentalmente ed esprime l assorbanzadi una soluzione a concentrazione 1mg/ml alla lunghezza d onda di 260 nm K = 21 (DNA nativo a doppia elica ds) K = 23 (DNA denaturato a singola elica ss) K = 25 RNA Quindi (a 260 nm): c =A/ K

59 DETERMINAZIONE PUREZZA DEGLI ACIDI NUCLEICI L'interferenza dovuta a contaminanti può essere evidenziatamediante il calcolo dei "rapporti". Il rapporto A260/A280 è usato per stimare la purezza degli acidi nucleici, dal momento che le proteine assorbono a 280 nm. Un DNA puro dovrebbe avere un rapporto di circa 1.8 Un RNA puro dovrebbe dare un valore di circa2.0. L'assorbanza a 230 nm riflette la contaminazione del campione dovuta a sostanze come carboidrati, fenoli, peptidi o composti aromatici. Per campioni puri il rapporto A260/A230 dovrebbe essere circa 2.2.

60 Spettro di assorbimento agli UV di DNA di E.coli nativo e denaturato. La denaturazione non cambia la forma complessiva della curva di assorbimento ma solo la sua intensità

61 Curva di fusione del DNA L assorbimento relativo è il rapporto dell assorbimento alle temperature indicate con quello a 25 C. La temperatura di fusione, T m, è la temperatura a cui si raggiunge la metà dell incremento massimo dell assorbimento.

62

63 Variazione delle temperature di fusione,t m, di vari DNA in funzione del loro contenuto in G+C

64 SPETTRI DIFFERENZIALI UNO SPETTRO DIFFFERENZIALE è LA DIFFERENZA TRA DUE SPETTRI DI ASSORBIMENTO SI POSSONO OTTENERE SOTTRAENDO UNO SPETTRO DI ASSORBIMENTO ASSOLUTO DA UN ALTRO OPPURE DIRETTAMENTE METTENDO UNA DELLE DUE SOSTANZE NELLA CUVETTA DI RIFERIMENTO NEGLI SPETTRI DIFFERENZIALI CI SONO PUNTI AD ASSORBANZA ZERO (PUNTI ISOBESTICI) IN CUI I DUE SPETTRI COINCIDONO. TALI PUNTI POSSONO ESSERE UTILI PER RIVELARE SOSTANZE INTERFERENTI

65 Spettro differenziale di citocromi

66 Dosaggi spettrofotometrici substrati artificiali

67 saggi accoppiati ETANOLO +NAD ALCOL DEIDROGENSI (ADH) ACETALDEIDE +NADH+H+