Dicembre 2006 Volume2, Numero 3

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1 Dicembre 2006 Volume2, Numero 3 L'obiettivo di questo documento è fornire una descrizione generale su come usare correttamente i dati di resistenza degli indicatori biologici per sviluppare, convalidare e controllare un processo di sterilizzazione a vapore di un prodotto farmaceutico. Sviluppo di un processo di sterilizzazione Lo scopo di un processo di sterilizzazione è quello di uccidere i microrganismi naturalmente presenti nel prodotto (chiamato bioburden). Questa prova è effettuata tipicamente per mezzo delle spore resistenti calibrate. Le spore sono tra i microrganismi più resistenti presenti in natura, si formano in risposta a condizioni ambientali sfavorevoli e squilibrate. Durante lo sviluppo di una endospora, l accrescimento vegetativo o la divisione cellulare, si bloccano. In questa forma la spora è in uno stato di dormienza e rimane tale fino a quando le condizioni esterne non diventano nuovamente favorevoli. Vengono solitamente impiegati due metodi comuni di sterilizzazione; il metodo di sterilizzazione basato sul Bioburden (BBS) ed il metodo di sterilizzazione basato sull Overkill (OS). Il metodo del BBS è definito come processo di sterilizzazione basato su parametri predeterminati e sulla concentrazione di bioburden presente sul materiale da sterilizzare. Il metodo di OS è definito come processo di sterilizzazione che è basato su una più alta concentrazione di spore iniziale arbitrariamente stabilita e la resistenza del bioburden che è realmente presente sul materiale da sterilizzare. Nel convalidare un ciclo per la sterilizzazione di un prodotto liquido farmaceutico, bisogna rispondere alle seguenti domande: 1

2 Che cosa è il naturale bioburden del prodotto? Il Bioburden è la popolazione di microrganismi vitali presente in un prodotto prima del processo di sterilizzazione. Essi possono essere virali, batterici e fungosi e possono provenire da tre fonti principali: l'ambiente di produzione, il personale della produzione, e le materie prime compresa l acqua. Alcuni organismi sono generatori di spore, che sono generalmente quelli più resistenti agli stress ambientali, compresi i processi di sterilizzazione. Il prodotto può avere poco o nessun bioburden secondo le fasi di produzione, o può contenere alte concentrazioni di organismi di specie diversa. È molto importante imparare il più possibile sul bioburden. Queste informazioni saranno utilissime quando dovranno essere determinati i parametri del ciclo di sterilizzazione. Le informazioni utili che caratterizzano il bioburden sono: - I numeri totali di microrganismi che si trovano nel prodotto prima della sterilizzazione - Tipi di microrganismi presenti - Numero di generatori di spore resistenti presenti - La resistenza del bioburden - Campionatura della frequenza ed analisi statistica. Che effetto ha il prodotto sul bioburden prima della sterilizzazione? Queste informazioni sono utili perché è importante sapere se e come il prodotto influenzerà il comportamento degli organismi presenti. Se il prodotto è capace di promuovere la crescita sporale, allora in poco tempo si potrebbe passare da una presenza minima di organismi ad un loro elevato aumento. Ciò rappresenta un problema se c è un tempo significativo che intercorre tra il momento della produzione e il momento della sterilizzazione. Un alto numero di microrganismi provocherà un aumento del tempo di sterilizzazione. Inoltre, se il prodotto in questione è un agente antimicrobico (antisetticida o disinfettante), si possono osservare tre diversi tipi di effetti: batteriostatico/ sporostatico, battericida/sporocida, batteriolitica. L effetto di un batteriostatico/ sporostatico è quello di inibire la crescita senza causare la morte del batterio. Gli agenti battericidi/sporocidi provocano la morte della cellula senza causare la lisi. Gli agenti batteriolitici determinano, infine, la morte della cellula provocandone la lisi. 2

3 La figura 1 visualizza le singole spore libere, mentre la figura 2 visualizza parecchi grandi gruppi, alcuni di loro che contengono centinaia di spore. Figura 1. Spore libere in etanolo Figura 2. Spore ragruppate in un prodotto Quanto resistente è bioburden al processo di sterilizzazione? (Studio del D-value). Nel migliore dei casi, una volta riconosciuti i microrganismi che caratterizzano il bioburden, si può procedere con lo studio del D-value usando proprio lo stesso tipo di microrganismo riconosciuto nel prodotto. Le caratteristiche del prodotto, quali la formazione di cristalli o la viscosità o il ph, possono influenzare la mortalità dell organismo durante il ciclo di sterilizzazione. Questi processi di sterilizzazione non possono essere fattibili o possibili a seconda delle circostanze, ma devono dare un risultato certo. Per rendere il processo certo e sicuro, un alternativa potrebbe essere quella di svolgere uno studio del D-value con il prodotto usando un microrganismo resistente al processo di sterilizzazione. Il Geobacillus stearothermophilus è un organismo generatore di spore ampiamente riconosciuto per il controllo del processo di sterilizzazione a vapore e può sostituirsi al bioburden nello studio del D-value. Quando si opta per questa sostituzione, è presupposto 3

4 che il microrganismo Geobacillus stearothermophilus sia più resistente degli organismi che vanno a formare il bioburden. Se per caso gli organismi del bioburden hanno una più alta resistenza rispetto al Geobacillus stearothermophilus, allora dovrebbe essere usato un elevato numero di spore Geobacillus stearothermophilus. Di conseguenza, il Kill Time per il Geobacillus stearothermophilus diventerebbe superiore al Kill Time del bioburden. La seguente tabella illustra questo punto. È accettabile basare i cicli di sterilizzazione sulla resistenza di altri organismi? Altri organismi come il Bacillus coagulans (atcc #7050), B. smithii precedentemente B. coagulans atcc #51232), B. subtilis 5230 (atcc #35021) e Clostridium sporogenes (atcc #11437) possono essere usati in alternativa al G. stearothermophilus in determinate situazioni. Questi organismi sono più sensibili alla sterilizzazione a vapore rispetto al G. stearotermofilus, ma generalmente, risultano comunque più resistenti del bioburden. Si ricorre ad uno di questi organismi quando il prodotto è sensibile al processo di sterilizzazione, quindi si è obbligati a limitare il tempo di sterilizzazione. Tuttavia quando si ha a che fare con un prodotto sensibile al calore, è suggerito vivamente analizzare il 4

5 bioburden prima di fissare i parametri di sterilizzazione e l organismo da utilizzare per la verifica dell efficacia del processo. Come queste informazioni possono aiutare a determinare la lunghezza di un ciclo? La lunghezza del ciclo è determinata in parte dallo Sterility Assurance Level desiderato (SAL), dalla popolazione iniziale e dalla resistenza del microrganismo. Per esempio, se il prodotto X contiene 100 microrganismi/unità con un D 121 -value di 3.0 minuti, allora un'esposizione di 24.0 minuti dovrebbe dare un SAL di La seguente tabella illustra questo punto. Sterility Assurance Level (SAL) Questo valore può essere calcolato in base all indicatore biologico selezionato. Per esempio, un IB con una popolazione di spore di 10 6 dovrà essere esposto ad un processo uguale a 12 D-value per ottenere un SAL di Questo valore può essere calcolato in base alla resistenza di un naturale bioburden. In questo caso dovrebbe essere scelto un IB con una popolazione molto più bassa di spore rispetto al numero di spore che formano il bioburden. Un altro metodo è di usare i valori di resistenza del bioburden e controllare il processo con un indicatore biologico conosciuto. Ciò renderà i livelli del SAL significativamente superiore a Per i prodotti abbastanza stabili con tempi di esposizione a 121 C meglio usare il metodo della BI Per prodotti sensibili al calore meglio usare la combinazione bioburden/bi per controllare il processo. 5

6 In che modo vengono svolti gli studi di D-value? Ogni lotto appartenente agli indicatori biologici varierà un po' nella popolazione, nella resistenza e nel kill time (tempo di esposizione nella quale zero unità testate risultano positive). Gli indicatori biologici usati per controllare un ciclo devono avere un kill time uguale o minore al tempo che fornisce la convalida del ciclo. Nella maggior parte dei casi, viene richiesto lo studio del D-value su un prodotto. Per questo tipo di studi viene utilizzato un particolare strumento, il B.I.E.R. vessels uno sterilizzatore in miniatura, controllato dal computer, le cui caratteristiche principali sono rappresentate da una estrema velocità delle fasi di riscaldamento e raffreddamento. I valori di D possono essere calcolati usando uno dei due metodi:la curva di sopravvivenza o il metodo della frazione negativa. Il metodo della curva di sopravvivenza si basa sullo studio della vitalità dei microrganismi e richiede che la popolazione di spore venga sottoposta a sterilizzazione parziale, garantendo la sopravvivenza di almeno 30 spore alla fine del ciclo. Si presume che l andamento della morte sporale segua una cinetica di primo grado, cioè che in una unità di tempo muoia sempre la stessa frazione di spore. Vengono poi confrontati in grafico, il logaritmo in base 10 del numero di microrganismi sopravviventi (in asse y) contro il tempo di esposizione in minuti (asse x). La curva di sopravvivenza così ottenuta è rappresentata da una linea retta, dalla quale viene estrapolato il valore di end-point di sterilità. Il valore D, in minuti, risulta infatti essere il reciproco della pendenza della retta. La difficoltà di questo metodo consiste nel fatto che in pratica è molto difficile far sopravvivere le 30 spore al processo di sterilizzazione. Il metodo della frazione negativa a volte citata come end-point sperimenta, si basa sui dati ricavati esponendo un minimo di indicatori biologici, ognuno per almeno 7-10 cicli, aventi diversi tempi di esposizione (es min di esp.). Gli intervalli di esposizione devono essere costanti ed inferiori al D-value. Di solito si usa un intervallo pari al 75% del valore D. Naturalmente più brevi sono gli intervalli, più preciso sarà il tempo prossimo al valore di zero indicatori biologici positivi. In seguito ad incubazione viene verificata la presenza o l assenza di crescita sporale e vengono registrati i dati in termini di numero di indicatori positivi e negativi e posti in un grafico ( dove l asse x riporta il tempo trascorso dall inizio del ciclo fino all ottenimento della completa sterilità mentre l asse y riporta la percentuale di crescita degli IB, otteniamo 6

7 l andamento che intercorre tra la totale crescita e la totale assenza di spore, quindi il tempo necessario per la totale efficacia del processo di sterilizzazione. Generalmente, il metodo della curva di sopravvivenza stabilisce la resistenza per le popolazioni sopravviventi al di sopra di 5 x 10 1, mentre il metodo della frazione negativa stabilisce la resistenza per le popolazioni sopravviventi inferiore a 5 x Ci sono due vantaggi per quanto riguarda il metodo della curva di sopravvivenza; uno è che può dimostrare una curva di regressione lineare del ceppo quando viene effettuata la prova del prodotto, e da questa, si può calcolare il SAL desiderato. L'altro è che il prodotto può essere rimosso attraverso filtrazione in modo da eliminare tutta l'inibizione potenziale del prodotto sulle spore danneggiate. La SGM ha assimilato anni di esperienza nello svolgere questi studi specializzandosi su un'ampia varietà di prodotti farmaceutici. Per avere uno studio di D-value in un prodotto farmaceutico il cliente dovrà fornire circa 100 ml di prodotto e isolare l andamento del bioburden. La SGM può fornire le spore (appartenente alla collezione della coltura di tipo americano) se non è richiesto lo studio del bioburden. Uno studio tipico consiste in: 1) Inoculo del prodotto con l organismo test 2) Riempire delle piccole ampolle di vetro con il prodotto da analizzare e sigillarle. 3) Sottoporre queste ampolle ad un determinato numero di esposizioni nel B.I.E.R. vessell 4) Analizzare le ampolle con il metodo della curva di sopravvivenza. I dati raccolti da queste esposizioni verranno usati per calcolare il D-value. Questi studi sul D-value possono essere usati per calcolare in seguito un SAL adatto per il processo di sterilizzazione. 7