Biotecnologie applicate all ispezione degli alimenti di origine animale

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1 Prof.ssa Tiziana Pepe Identificazione di specie mediante tecniche biomolecolari Biotecnologie applicate all ispezione degli alimenti di origine animale Dip. di Medicina Veterinaria e Produzioni animali tiziana.pepe@unina.it

2 Cosa sono i prodotti della pesca preparati? Prodotti della pesca non trasformati sottoposti ad una operazione che ne abbia modificato l integrità anatomica, quale l eviscerazione, la decapitazione, l affettatura, la sfilettatura, la tritatura Prodotti della pesca decapitati e decaudati Reg. CE 853/2004 (All. 1, 3.6) Tranci di prodotti della pesca

3 Cosa sono i prodotti della pesca trasformati? Prodotti della pesca risultanti dalla trasformazione dei prodotti della pesca o dall ulteriore trasformazione di detti prodotti trasformati Reg. CE 853/2004 (All. 1, 7.4) Prodotto della pesca trasformato: zuppa di pesce Prodotto della pesca trasformato: surimi

4 Prodotti della pesca freschi Sia per i prodotti della pesca preparati che per quelli trasformati, non si può parlare di pesce fresco. Infatti: Prodotti della pesca freschi sono i prodotti non trasformati, interi o preparati, compresi i prodotti imballati sotto vuoto o in atmosfera modificata che, ai fini della conservazione non hanno subito alcun trattamento diverso dalla refrigerazione, inteso a garantirne la conservazione Reg. CE 853/2004 (All. 1, 3.5 )

5 Prodotti ittici preparati - Accertamento della qualità La qualità di un prodotto ittico preparato è assicurata da una serie di controlli: Accertamento che un prodotto scongelato non venga venduto come fresco (Si effettuano le prove del potenziale dielettrico e dell emolisi) Accertamento dello stato di freschezza (Si effettuano esame sensoriale, chimico e microbiologico) Controllo della specie ittica dichiarata in etichetta

6 Prodotti trasformati - Accertamento della qualità La qualità di un prodotto ittico trasformato è assicurata da altri controlli: Accertamento dello stato di conservazione (si usano metodi chimici e microbiologici) Valutazione della qualità igienica (si ricercano microrganismi non strettamente legati al prodotto fresco) Controllo della specie ittica dichiarata in etichetta

7 Prodotti ittici preparati e trasformati Sia nei prodotti preparati che trasformati è necessario effettuare il controllo di specie per: Motivazioni di carattere sanitario Le specie ittiche nocive sono indicate nel Reg. CE 854/2004. La detenzione e vendita di sostanze alimentari pericolose, adulterate o nocive è punibile ai sensi del Codice Penale e della Legge n. 283/1962. Motivazioni di carattere commerciale La vendita di aliud pro alio (o frode in commercio) è punibile ai sensi del Codice Penale.

8 Motivazioni di carattere sanitario I controlli devono essere effettuati affinchè non siano immessi sul mercato: a) pesci velenosi delle famiglie Tetraodontidae, Molidae, Diodontidae e Canthigasteridae b) prodotti della pesca contenenti biotossine quali la ciguatossina o le tossine che paralizzano i muscoli (taluni pesci tropicali) Reg. CE 854/2004, All. 3, Capo II.

9 Motivazioni di carattere sanitario I controlli devono essere effettuati per evitare che si verifichino decessi causati dal consumo di specie tossiche vendute al posto di specie commestibili (frode aliud pro alio). Nel 1977 si verificarono 3 decessi dovuti alla vendita di filetti di pesce palla (probabilmente Lagochephalus lunaris della famiglia tetraodontidae) in luogo di rana pescatrice (Lophius piscatorius) (Palese e Palese, 1992)

10 Motivazioni di carattere commerciale Le frodi più comuni sono la vendita di Halibut venduto al posto di sogliola o platessa Palamita venduta al posto del Tonno Alaccia venduta al posto della Sardina Eglefino o pollak venduto al posto di nasello o merluzzo In ognuno dei quattro esempi le specie ittiche meno pregiate sono vendute al posto di quelle con maggiore valore commerciale.

11 Nasello, merluzzo, eglefino o pollak Controllo visivo dei pesci Immagini da Tepedino et al., 2000 Le specie presentano caratteri morfologici utili per la distinzione anche ad un occhio non esperto

12 Controllo di specie in prodotti preparati Nei prodotti ittici preparati si è in presenza di modificazione parziale dell integrità anatomica dei pesci. Quindi i controlli visivi macro e microscopici prevedono: - Valutazione della forma del filetto e del trancio - Osservazione della conformazione dei miosetti e dei miomeri

13 Nasello, merluzzo, eglefino o pollak Controllo visivo dei filetti Immagini da Tepedino et al., 2000 I filetti hanno caratteri morfologici che ne permettono la distinzione solo ad un occhio esperto

14 Controllo visivo di miomeri e miosetti Forma dei miomeri in alcuni prodotti della pesca

15 Controllo di specie in prodotti preparati Nei prodotti ittici preparati, in cui si ha la modificazione parziale dell integrità anatomica, il controllo di specie si può effettuare anche tramite analisi di laboratorio con lo studio dei: Quadri proteici caratteristici ottenuti attraverso - Elettroforesi - Elettroforesi capillare - Elettroisofocalizzazione (IEF) Oppure con: Reazioni antigene-anticorpo - Saggi immunoenzimatici

16 Controllo di specie in prodotti trasformati Nei prodotti trasformati alla modificazione dell integrità anatomica delle specie ittiche si aggiungono i trattamenti (chimici e termici) che inducono parziale denaturazione delle proteine. Per questi prodotti il controllo di specie può essere effettuato tramite: Controllo di quadri proteici caratteristici - Elettroisofocalizzazione (IEF) di proteine acide e specie-specifiche, termoresistenti come le parvalbumine.

17 Controllo di specie in prodotti trasformati Nei prodotti trasformati alla modificazione dell integrità anatomica delle specie ittiche si aggiungono i trattamenti (chimici e termici) capaci di indurre una completa denaturazione delle proteine. Per questi prodotti il controllo di specie può essere effettuato tramite: Controllo di tratti caratteristici del DNA (l acido nucleico è più termostabile delle proteine) Si usa la Polymerase Chain Reaction (PCR).

18 PCR per il controllo di tratti caratteristici del DNA Il DNA indagabile può essere DNA nucleare che è - di derivazione paterna e materna - diploide DNA mitocondriale e plasmidico che è - di derivazione unicamente materna - aploide - non ricombinante - con tasso di mutazione più elevato

19 Vantaggi dello studio del DNA mitocondriale Il DNA mitocondriale è più facilmente indagabile in quanto Ha minori dimensioni rispetto al DNA nucleare Vi è la presenza di più copie di mt-dna nella cellula Per numerose specie ittiche vi è una conoscenza già avanzata della sequenza di mt-dna In mt-dna sono assenti grandi frammenti non codificanti (introni)

20 DNA mitocondriale (mt-dna) umano Ridisegnato da Beckenbach, 1991 Rappresentazione schematica del DNA mitocondriale umano

21 DNA mitocondriale (mt-dna) - Geni studiati Di tutti i geni presenti nella sequenza del DNA mitocondriale ai fini del riconoscimento di specie si studiano: Gene per il citocromo b (cyt b) Di cui si effettua l analisi del gene completo e di frammenti Gene per la subunità ribosomiale 16S Analisi del gene completo e di frammenti Gene per la subunità ribosomiale 12S Analisi del gene completo e di frammenti

22 Gene citocromo b (cyt b) Presenta alcune peculiarità: Presenza di regioni altamente conservate alternate a regioni variabili Notevoli variazioni inter e intraspecifiche nella sequenza nucleotidica Minore variazione intraspecifica Maggiore variazione interspecifica Risulta quindi idoneo all identificazione di specie di differenti organismi mediante lo studio delle sue sequenze nucleotidiche.

23 Subunità ribosomiale 16S e 12S del DNA mitocondriale Presentano regioni altamente conservate alternate a regioni variabili caratteristiche di una specie o di sottogruppi di una stessa specie. Si conoscono numerosi enzimi di restrizione per l applicazione dell RFLP a tali subunità. Risultano quindi idonei all identificazione di specie di differenti organismi mediante studio dei profili di restrizione.