Differenziamento linfociti T effettori

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2 Linfociti T naive vs. effettori Linfociti T naive richiedono segnali costimolatori cellule presentanti l antigene professionali molecole costimolatorie [come B7.1 (CD80) e B7.2 (CD86)] Dopo la fase di intensa proliferazione indotta da IL-2 i linfociti T CD4 e CD8 differenziano rispettivamente in linfociti T effettori cooperanti e citotossici l espressione di diverse molecole cambia Linfociti T effettori non richiedono segnali costimolatori per lo svolgimento delle funzioni effettrici indotte dai successivi incontri con l antigene

3 Linfociti T CD4 T helper 1 (Th1) / T helper 2 (Th2) / T helper 17 / T follicular helper (T FH ) Differenziamento linfociti Th: acquisizione della capacità di produrre selettivamente citochine effettrici specifiche In base alle citochine prodotte i linfociti T CD4 possono essere divisi in sottopopolazioni Th1 producono IFN-g, IL-2, LT non producono le citochine di tipo Th2 Th2 producono IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 non producono le citochine di tipo Th1 Th17 producono IL-17, IL-22 T FH importanti per la risposta anticorpale T-dipendente Università di Roma (V. Tor Vergata lezione - Corso su di attivazione/risposta Laurea in Scienze Biologiche linfociti - Immunologia B) Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2012/2013

4 Citochine diverse inducono il differenziamento in T helper effettrici diverse Cellule CD4 naive Stimolazione TCR, CD28, IL-12 IFNg IL-4 IL-6+TGFb Th1 Th2 Th17

5 T helper effettrici diverse producono citochine diverse Cellule CD4 naive Stimolazione TCR, CD28, IL-12 IFNg IL-4 IL-6+TGFb Th1 Th2 Th17 IFN-g IL2 LT IL-4 IL-5 IL-13 IL-17 IL-21 IL-22

6 T helper effettrici diverse svolgono funzioni effettrici diverse Cellule CD4 naive Stimolazione TCR, CD28, IL-12 IFNg IL-4 IL-6+TGFb Th1 Th2 Th17 Protezione da patogeni intracellulari (virus, batteri) Protezione da patogeni extracellulari (parassiti, batteri) Protezione da patogeni extracellulari (funghi, batteri)

7 T helper effettrici diverse svolgono funzioni effettrici diverse Cellule CD4 naive Stimolazione TCR, CD28, IL-12 IFNg IL-4 IL-6+TGFb TGFb Th1 Th2 Th17 Treg Protezione da patogeni intracellulari (virus, batteri) Protezione da patogeni extracellulari (parassiti, batteri) Protezione da patogeni extracellulari (funghi, batteri) Immunoregolazione

8 Citochine espresse da linfociti Th1 and Th2 cells Citochina Th1 Th2 IFN-g + - LT (TNFb) + - IL IL GM-CSF + + TNF-a + + MIP-1a + + MIP-1b + + IL IL IL IL IL

9 IL- 4 staining Visualizzazione cellule Th1/Th2 al citometro IFN-g staining

10 Visualizzazione al citometro di cellule Th17 From Nasta et al J Immunol 2010

11 Cross-regolazione tra Th1 e Th2 APC T CD4 naive IL-12 T IL-2 IL-4 inibizione del differenziamento in fenotipo opposto Thp Thp Loop positivi: rinforzo del differenziamento IFN-g IL-4 Cellule effettrici Th1 Th1 Th2 Th2

12 Interleuchina 12 (IL-12) eterodimero IL-12 p35 (o IL-12a) IL-12 p40 (o IL-12b) omodimero IL-12 p40-p40, antagonista di p35/p40 nel topo recettore per IL-12 IL-12Rb1 + IL-12Rb2 omologhe a gp130

13 Espressione del recettore per IL-12 solo in cellule recentemente attivate (non ancora differenziate) e in cellule Th1 persa durante differenziamento in linfociti Th2 espressione è aumentata da IFNg diminuita da IL-4 topi Balb/c producono alti livelli di IL-4 hanno bassa espressione di IL-12Rb2

14 Proliferazione IFNg Proliferazione Citotossicità NK T Th2 B IgG2a Th1 IFNg IgE Proliferazione IL-12 macrofagi neutrofili cellule dendritiche Patogeni attraverso TLR o altri recettori Cellule T attivate mediante CD40L, IFNg, altri segnali Componenti della matrice extracellulare di tessuti infiammati

15 Influenza di diversi subset di cellule dendritiche su differenziamento Th1/Th2 Cellule dendritiche mieloidi producono molta IL-12 differenziamento Th1 Cellule dendritiche linfoidi producono bassi livelli di IL-12 consentono differenziamento Th2

16 Effetti di IL-4 Cambio di classe a IgG1 e IgE nel topo IgG4 e IgE nell uomo Inibizione attivazione macrofagi Differenziamento e proliferazione linfociti Th2

17 Fonti di IL-4 durante il differenziamento cellule Th2 cellule T NK1 + mastociti basofili eosinofili

18 Trasduzione segnale recettori citochine JAnus kinase (JAK) Jak1 Jak2 Jak3 Tyk1 Il dominio citoplasmatico delle catene dei recettori per citochine legano le chinasi JAK Il legame della citochina dimerizza il recettore; le JAK fosforilano i domini citoplasmatici delle catene del recettore

19 Trasduzione segnale recettori citochine Gli STAT legano i domini citoplasmatici fosforilati e vengono fosforilati dalle JAK Gli STAT fosforilati formano dimeri che entrano nel nucleo e attivano trascrizione IL-12 STAT4 IFN-g STAT1 IL-4 STAT6

20 Recettore per IFNg attiva STAT1 che induce trascrizione di Tbet Recettore per IL12 attiva STAT4 che induce espressione di IFNg Recettore per IL4 attiva STAT6 che induce espressione di GATA3

21 Altri fattori che influenzano il differenziamento Th1/Th2 (a) altre citochine IFN-g, IFN-a e IL-18 promuovono Th1 IL-10, IL-1 e IL-6 promuovono Th2 molecole costimolatorie costimolazione CD28 promuove differenziamento Th2 interazione CD40L/CD40 aumenta produzione IL-12 in DC

22 Altri fattori che influenzano il differenziamento Th1/Th2 (b) intensità del segnale del TCR dose e natura dell antigene affinità background genetico topi C57Bl/6 vs. Balb/c

23 Ruolo dell intensità del segnale del TCR nel differenziamento Th1/Th2 Cellule CD4 naïve stimolate con basse concentrazioni di peptide differenziano in Th2 Segnali TCR deboli favoriscono differenziamento Th2 differenziamento dipendente da CD28 richiesto per produzione IL-2, citochina essenziale nell induzione di IL-4 Segnali deboli inducono espressione di GATA-3 in modo indipendente da IL-4 Segnali TCR forti risultano in differenziamento Th1

24 Ruolo di ERK in intensità segnale TCR e differenziamento Th1/Th2 L attivazione di Erk (Extracellular signal-regulated kinase) in risposta ai segnali del TCR svolge un ruolo cruciale in differenziamento Th1/Th2 Basse concentrazioni di peptide inducono attivazione di ERK debole e transiente sufficiente per indurre quantità di IL-2 richiesta per polarizzazione Th2 insufficiente per reprimere l induzione di GATA-3 da parte del TCR Con alte concentrazioni di peptide, l attivazione di ERK è prolungata e intensa inibizione espressione di GATA3 inibizione attivazione di STAT5 L inibizione enzimatica di ERK permette il differenziamento Th2 anche con concentrazioni elevate di peptide

25 Diversi fattori promuovono il differenziamento delle diverse T helper effettrici Cellule CD4 naive Stimolazione TCR, CD28, Tbet GATA-3 RorgT Foxp3 Th1 Th2 Th17 Treg

26 T-bet e differenziamento linfociti Th1 T-bet è necessario per il differenziamento dei linfociti Th1 è indotto da IFNg attraverso l attivazione di STAT1 induce l espressione di HLX che promuove l espressione di T-bet stesso induce rimodellamento della cromatina rendendo il locus ifng accessibile ai fattori di trascrizione silenziando il locus il4 (il4,il5, il13) a seguito di fosforilazione sequestra GATA-3 e ne inibisce l azione

27 GATA-3 e differenziamento linfociti Th2 GATA-3 è necessario per il differenziamento dei linfociti Th2 è indotto da TCR/CD28, IL-4, Notch1 induce l espressione di gata-3 stesso quando la proteina gata3 supera un certo livello inibisce l espressione di STAT4 induce rimodellamento cromatina rendendo il locus il4 (il4, il5, il13) accessibile ai fattori di trascrizione silenziando il locus ifng

28 Diversi segnali inducono espressione di GATA-3 GATA3- è richiesta sia per eventi indipendenti che dipendenti da IL-4

29 NOTCH Espresso su superficie non covalentemente associato con polipeptide transmembrana A seguito di interazione con ligando (Delta-like o Jagged) taglio dominio intracitoplasmatico traslocazione in nucleo dove lega RBPJ rimuove co-repressore e recluta co-attivatore poliubiquitinazione invia NOTCH a proteasoma

30 Notch and Notch-ligands 4 diversi recettori Notch 5 diversi ligandi (Jagged 1 e 2; DLL1, 3, e 4)

31 DLL Notch in differenziamento Th1/Th2 Notch 3 Batteri, virus, o altri stimolazione PRR (TLR) inducendo espressione di DLL1 o DLL4 Notch3 stimolato da DLL1 o DLL4 induce differenziamento Th1

32 Notch in differenziamento Th1/Th2 Jagged Elminti, allergeni, PGE2 inducono espressione di Jagged Notch1/2 Notch 1 o 2 stimolato da Jagged, induce espressione GATA3 e differenziamento Th2

33 IL-4 Stat6 GATA-3 transcription GATA-3 Stat6 translation GATA-3 Locus Th2 (IL-5/IL-13/IL-4) Chromatin remodeling CNS IL-5 IL-13 IL-4

34 Ruolo di GATA-3 in sviluppo linfociti T

35 Differenziamento Th1/Th2 Fase iniziale: vengono attivati sia Tbet che GATA3 entrambi loci ifng e il4 sono accessibili co-espressione mrna per citochine Th1 e Th2 differenziamento dipendente da citochine polarizzanti avvio dei processi di rimodellamento della cromatina secondo i segnali che prevarranno

36 Differenziamento Th1/Th2 Fase successiva: il differenziamento diventa progressivamente meno dipendente dalle citochine polarizzanti prevale uno dei fattori, Tbet o GATA3 progressiva stabilizzazione dell espressione del locus rilevante (ifng o il4) e aumento dell espressione delle relative citochine progressiva repressione del locus non rilevante (il4 o ifng) alla successiva (sola) stimolazione del TCR la cellula risponde producendo citochine o Th1 o Th2

37 Mantenimento fenotipo / memoria epigenetica Massiccia riprogrammazione dell espressione genica durante il differenziamento centinaia di geni espressi differentemente in linfociti Th1 e Th2 La regolazione epigenetica conferisce una stabilizzazione ereditabile dei pattern di espressione genica ruolo fondamentale nel determinare e mantenere il differenziamento cellulare Meccanismi epigenetici liberano le cellule dalla necessità di citochine polarizzanti

38 NFAT e regolazione epigenetica di ifng / il4 NFAT è attivato da stimolazione TCR attraverso la via PLCg 1 / Ca 2+ / calcineurina Nelle cellule CD4 naïve sia il promotore di Il4 che di Ifng sono accessibili a NFAT Al contrario, NFAT si lega solo al promotore di Il4 nelle cellule Th2 attivate promotore di Ifng nelle cellule Th1 attivate Quindi nelle cellule Th1 e Th2, NFAT acquisisce la capacità di stimolare rispettivamente la produzione di Ifng e Il4 in conseguenza dei cambiamenti epigenetici che avvengono durante il differenziamento Th.

39 Funzioni effettrici delle cellule Th1 Proliferazione e differenziamento Attivazione macrofagi (aumentata capacità di uccidere batteri) Opsonizzazione e fagocitosi Attivazione linfociti T citossici Attivazione neutrofili (aumentata capacità di uccidere batteri)

40 Funzioni effettrici delle cellule Th2 M0 attivato IL-10 Ab neutralizzanti topo IgG1 uomo IgG4 Degranulazione mastociti Attivazione eosinofili Inibizione attivazione M0

41 Leismaniosi cutanea Leishmania major, protozoo parassita risiede e si replica obbligatoriamente nei macrofagi dell ospite Topi del ceppo C57Bl/6 geneticamente predisposti a sviluppare risposte Th1 sono resistenti a L. major Topi del ceppo Balb/c geneticamente predisposti a sviluppare risposte Th2 sono sucettibili a L. major IFN-g attiva inos, inducible nitric oxide synthase controllo del patogeno IL-10 e IL-4 inibiscono attivazione inos peggioramento patologia

42 Importanza della giusta scelta Th1/Th2 nella risposta immunitaria; l esempio del morbo di Hansen (lebbra) Gravità patologia Risposta cellulo-mediata Forma tubercolare Forma lepromatosa Infezione da M. leprae Linfociti Th1 IFN-g Attivazione macrofagi Eliminazione batteri intracellulari Malattia meno grave Sopravvivenza Infezione da M. leprae Linfociti Th2 non attivano (o inibiscono) i macrofagi Proliferazione dei batteri intracellulari non controllata Gravi danni ai tessuti Morte

43 Cellule T regolatorie (Treg) Cellule CD4 esprimenti CD25 (catena a recettore IL2) costitutivamente esprimono CTLA-4, PD1 e GITR Controllano l ampiezza della risposta immunitaria e assicurano la tolleranza inibiscono attivazione linfociti T e cellule dendritiche Foxp3 fattore di trascrizione richiesto per differenziamento e funzioni Treg

44 CD4 + CD25 + regulatory T cells Cell proliferation IL2 production Th cells Treg cells +/- - PD-1 CTLA-4 CD25 GITR Treg suppress inflammation: Autoimmunity arthritis, diabetes, MS, colitis Responses against pathogens Leishmania, C. albicans Responses against tumors Graft-versus-host disease 3 H-TdR uptake (cpm) Cell proliferation IL-2 production IL-2 (pg/ml) T-reg / Th cell ratio J Immunol 2005

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46 Visualizzazione al citometro di cellule Treg Nasta et al J Immunol 2010

47 Origine delle cellule T regolatorie (Treg) IL-2 TGFb? IL-2 TGFb Originano nel timo come popolazione CD4 + CD8 - CD25 + migrano in tessuti periferici dove mantengono tolleranza natural Treg Possono differenziare anche in tessuti periferici a partire da linfociti T CD4 naive in particolari condizioni di stimolazione induced Treg

48 FOXP3 N C PROLINE-RICH DOMAIN ZINC-FINGER LEUCINE ZIPPER FORKHEAD DOMAIN Repressore trascrizionale a livello di diversi promotori di citochine La sua espressione è ristretta principalmente alla popolazione CD4 + CD25 + nel timo e in periferia: TIMO PERIFERIA

49 Cross-regolazione del differenziamento Foxp3 inibisce l attivazione dei fattori che inducono il differenziamento dei linfociti effettori promuove la propria espressione

50 Foxp3 agisce sia come repressore che attivatore trascrizionale Zheng et al, Nature 445: 936, a large number of Foxp3- bound genes are up- or downregulated in Foxp3 + T cells Foxp3 acts as both a transcriptional activator and repressor Foxp3 regulates, among others, genes encoding nuclear factors that control gene expression and chromatin remodelling

51 Foxp3, forkhead box P3 Mutazioni in Foxp3 provocano fenotipo scurfy nel topo IPEX (immunodysregulation, polyendocrinopathy and enteropathy, X-linked syndrome) nell uomo mancanza di Treg rottura tolleranza processi autoimmuni

52 Cellule CD4 CD25 in IPEX

53 Scurfy Mouse Wild type Scurfy X-linked recessive inheritance Lethality at days Wasting syndrome Exfoliative dermatitis Small, thickened ears

54 IPEX Clinical Findings First described in 1982 by Powell et al. as a syndrome of diarrhea, polyendocrinopathy, and fatal infection in infancy. Neonatal onset diabetes mellitus Hypothyroidism Enteritis (diarrhea/villous atrophy) Hemolytic anemia & thrombocytopenia. Dermatitis Death by 1-2 years of age

55 IPEX (Autopsy Findings) Pancreas: islets of Langerhans absent with lymphocytic infiltrates Intestine: villous atrophy with lyphocytic infiltrates Liver: Cholangitis Spleen: enlarged Lymph nodes: Follicular hyperplasia Thyroid: Lymphocytic infiltrates Lungs: Consolidation/Inflammation Thymus: Atrophy