Coltivazione dei Virus

Транскрипт

1 Coltivazione dei Virus I virus sono parassiti intracellulari obbligati = non possono moltiplicarsi all esterno di una cellula vivente. I virus vengono coltivati per tre motivi principali: - diagnosi dell infezione; - ricerca; - produzione di antigeni per vaccini. Fino al 1950 per coltivare i virus era necessario usare animali. o uova embrionate. Colture cellulari

2 Uova embrionate, di giorni Virus diversi crescono in parti diverse dell'uovo

3 Le uova embrionate vengono tuttora utilizzate soprattutto in ambiente industriale, es per la preparazione dei vaccini antiinfluenzali (es negli USA ogni anno per il vaccino si usano più di 140 milioni di uova)

4 Coltivazione dei Virus in vitro I virus sono parassiti intracellulari obbligati = non possono moltiplicarsi all esterno di una cellula vivente. I virus vengono coltivati in laboratorio per tre motivi principali: - diagnosi dell infezione; - ricerca; - produzione di antigeni per vaccini. Per crescere i virus in laboratorio è necessario impiegare animali, uova embrionate o colture di cellule. Adesso le colture cellulari hanno generalmente sostituito gli altri metodi eccezione uova embrionate per il vaccino antiinfluenzale. Gli animali sono utilizzati quasi esclusivamente a scopo di ricerca. NB Anche adesso, ci sono virus che non possono essere cresciuti in laboratorio Colture cellulari

5 Coltivazione dei Virus in colture cellulari Adesso le colture cellulari hanno generalmente sostituito gli altri metodi. Gli animali sono utilizzati quasi esclusivamente a scopo di ricerca. NB Anche adesso, ci sono virus che non possono essere coltivati in laboratorio 1949: prima volta che un virus, il poliovirus, è stato propagato con successo in colture di cellule eucariote. Enders, Weller, Robbins: premio Nobel, 1954 Colture cellulari

6 Colture cellulari Sono state sviluppate solo dopo l avvento degli antibiotici. Le cellule crescono in un opportuno terreno e devono essere preparate e mantenute in ambiente sterile, per evitare crescite di batteri e funghi. Negli ultimi anni ci sono stai notevoli progressi grazie alla messa a punto di terreni di coltura sempre più idonei Il terreno di coltura per cellule contiene una soluzione di sali a concentrazioni fisiologiche, glucosio, aminoacidi, vitamine essenziali e antibiotici; è tamponato a ph 7,2-7,4. Viene aggiunto siero fetale bovino a al 10-20% per fornire integratori necessari per l accrescimento delle cellule. La composizione del terreno varia a seconda del tipo di cellula, e vengon ospesso aggiunti specifici fattori di crescita. Al momento dell infezione, il terreno di coltura viene sostituito con un terreno di mantenimento con ~ 1-5% di siero, che permette soltanto una scarsa moltiplicazione delle cellule.

7 Colture cellulari in incubatore ad atmosfera controllata 5% CO2

8 Procedimento per ottenere una coltura di cellule di rene. Il tessuto di origine viene raccolto asetticamente (1) e suddiviso in piccoli frammenti (2). La digestione con enzimi proteolitici (tripsina) (3) lo riduce ad una sospensione di singole cellule (4), che vengono centrifugate per eliminare la tripsina (5) contate (6), e incubate a 37 C in fiasche di plastica nel terreno di coltura (7). In pochi giorni, le cellule formano uno strato continuo (8). A questo punto la crescita cellulare si arresta (inibizione da contatto) ed le cellule possono essere usate per coltivare i virus opossono venire tripsinizzate (9) ed espanse mediante diluizione e coltivazione in altre fiasche. Si formano così nuovi monostrati confluenti, che costituiscono le colture secondarie (10)

9 Colture cellulari Primarie Sono preparate a partire da un organo animale o umano. Sono normali cellule diploidi. Le cellule crescono formando uno strato continuo (confluente), dello spessore di una singola cellula (monostrato). Quando si raggiunge la confluenza, le cellule non crescono più (inibizione da contatto), e devono essere passate in altre fiasche (tripsinizzate). Le colture primarie hanno una vita finita (al massimo qualche decina di generazioni), dopo di che la capacità moltiplicativa si arresta e le cellule degenerano. Coltura di fibroblasti

10 Linee cellulari Le linee cellulari continue possono derivare da un tumore o da cellule normali che sono state trasformate (con virus o con sostanze chimiche) così da comportarsi come cellule derivate da un tumore, in grado di propagarsi indefinitamente, senza degenerare. Spesso sono poliploidi. Hanno tre caratteristiche principali: Sono immortalizzate Hanno perso l inibizione da contatto Hanno cambiato la morfologia. Foci di cellule trasformate da due diversi tipi di retrovirus tumorale degli uccelli (Rous Sarcoma Virus)

11 Diversi tipi di cellule usate in virologia Fibroblasti umani (primari) Fibroblasti di topo immortalizzati (linea continua) Linea di cellule umane tumorali (HeLa)

12 Colture in sospensione I linfociti non crescono in monostrato, ma in sospensione (galleggiando nel terreno), senza attaccarsi al recipiente. I linfociti maturi generalmente non possono propagarsi in vitro. I linfociti B possono però essere immortalizzati dal virus di Epstein-Barr, e allora si moltiplicano indefinitamente in vitro. I linfociti T possono accrescersi in vitro per un periodo di tempo limitato in presenza di interleuchina 2.

13 Effetti del virus sulle cellule L infezione virale può uccidere la cellula ospite ma l effetto citopatico non è una conseguenza necessaria della replicazione virale. Anzi, a volte, possono esserci effetti citopatici anche senza un ciclo produttivo completo Anche solo il legame fra virus e recettore può causare effetti evidenti come fusione fra cellule, apoptosi, ed alterazioni dei segnali Alcuni virus inducono una generale dowmregulazione della trascrizione cellulare. Altri virus upregolano alcuni geni e ne downregolano altri L infezione può ridurre la traduzione dei geni cellulari, mentre upregola quella dei geni virali, a causa di diversi meccanismi di inizio L infezione può alterare l espressione di alcune proteine di superficie, es. MHC di classe I

14 Effetto citopatico Effetto citopatico (CPE) = anomalie e cambiamenti degenerativi che si verificano nella cellula ospite e che spesso sono il risultato di una infezione virale. L infezione citolitica = causa la morte e la lisi della cellula ospite. I virus animali possono danneggiare le cellule che li ospitano in molti modi diversi che spesso portano alla morte cellulare. Di solito, i virus possono replicare solo in specifici tipi cellulari: la cellula deve essere sensibile (=permettere l infezione da parte del virus) e permissiva (=permettere al virus di replicare). Per molti virus non esistono sistemi di crescita in coltura cellulare. Infezione abortiva = il virus penetra nella cellula, ma esprime solo alcuni geni e non produce progenie infettante

15 Effetti citopatici di infezioni virali non infettate herpes simplex Citomegalovirus V. resp. sinciziale Morbillo infettate

16 Anche se l infezione virale può uccidere la cellula ospite, l effetto citopatico non è una conseguenza necessaria della replicazione virale. Anzi, a volte, possono esserci effetti citopatici anche senza un ciclo produttivo completo Alcuni fra i tanti possibili meccanismi virus-indotti che possono causare un danno cellulare sono: Molti virus inibiscono le sintesi cellulari Anche solo il legame fra virus e recettore può causare effetti evidenti come fusione fra cellule, apoptosi, ed alterazioni dei segnali Alcuni virus causano sincizi, o policariociti (glicoproteine virali con attività fusogena inserite sulla membrana cellulare promuovono la formazione di sincizi multinucleati) Alcuni virus causano rotture cromosomiche (es. herpes) La cellula può subire trasformazione in senso neoplastico Possono produrre vacuoli

17 Murray T 49.2

18 Inclusioni Durante l infezione virale con molti virus si verifica la formazione di corpi inclusi. Possono essere il risultato del raggruppamento di subunità o virioni all interno del nucleo o del citoplasma (es. corpi del Negri nell infezione da virus della rabbia; possono contenere componenti cellulari (es. ribosomi negli Arenavirus) o cromatina (Herpesvirus). I corpi inclusi possono causare la distruzione della cellula indipendentemente dalla loro composizione. Corpi del Negri

19 Rappresentazione schematica di effetti citopatici Inclusioni intracitoplasmatiche (es V. Rabbia), intranucleari (es. herpes simplex), entrambe (V morbillo), e i tre tipi principali di effetto citopatico

20 Quando un virus infetta una cellula, possono verificarsi diversi tipi di infezione: Murray T 49.1 T Si possono quindi verificare essenzialmente 3 tipi di infezione cellulare: - L infezione fallisce (Infezione abortiva) - La cellula muore (Infezione litica) - Infezione senza morte cellulare (Infezione persistente)

21 Titolazione dei virus In laboratorio, sia a scopo di ricerca che, per esempio,pr la preparazione di vaccini, è necessario titolare l attività infettante dei virus, cioè determinare quante particelle virali infettanti sono presenti. Si possono usare vari metodi, a seconda del virus. N.B. Il numero di particelle infettanti è sempre inferiore al numero totale di virioni. Infatti durante la replicazione virale la maggior parte delle particelle che si formano è defettiva, senza capacità di replicare. Il rapporto particelle infettanti/totali può essere anche 1:200

22 Titolazione dei virus - emoagglutinazione L emoagglutinazione sfrutta il fatto che molti virus hanno alla superficie proteine che si legano ai globuli rossi. Normalmente, i globuli gossi si depositano al fondo della provetta, formando un cerchio molto netto. Se c'è il virus, ogni particella virale si può legare a più cellule, formando una specie di rete, che si deposita sul fondo della provetta. Si fanno diluizioni del virus, ed il titolo è l ultima diluizione in grado di agglutinare Non si misura la capacità infettante/pfu, ma solo la presenza di particelle virali (che potrebbero anche non essere funzionali)

23 Titolazione dei virus conta delle placche Il virus viene diluito serialmente, ed ogni diluizione viene inoculata su cellule sensibili. Dopo l assorbimento, le cellule vengono ricoperte con un mezzo semisolido (agar) o vengono aggiunti al terreno anticorpi specifici contro il virus. Così si impedisce la diffusione delle particelle virali. Il virus può infettare solo le cellule contigue a quella infettata in origine, per cui la distruzione del monostrato si evidenzia con la formazione di placche di lisi. Il titolo viene espresso in PFU (plaque forming unit) Figura da lucidi

24 Titolazione dei virus conta delle placche Preparare diluizioni seriali del virus (di 10 in 10) Seminare le diluizioni su cellule suscettibili. Dopo l assorbimento, aggiungere terreno semi-solido, o con anticorpi, per impedire la diffusione del virus nel terreno La diffusione per contiguità dal virus causa la distruzione localizzata del tappeto cellulare, visibile come una placca

25 Diagnostica Virale in Laboratorio Negli ultimi anni ci sono stati importanti sviluppi nella diagnostica in generale, ma soprattutto in quella delle inf virali. Fino a pochi anni fa si era limitati alle colture cellulari e ad un pannello ristretto di reazioni sierologiche. L avvento di tecnologie molecolari estremamene sensibili (PCR e derivati), di reagenti ottenuti mediante biotecnologia e di MAbs ha consentito di ovviare alle carenze, consentendo una esecuzione molto più veloce, affidabile, in massima sicurezza. La diagnostica virale in laboratorio può essere eseguita in maniera: Diretta: ricerca ed identificazione del virus o dei suoi componenti nel materiale patologico Indiretta: dimostrando una riposta immunitaria specifica e significativa

26 Metodi diretti in diagnostica virologica Colture cellulari Rivelazione di proteine virali Microscopia Microscopia Elettronica Rivelazione del genoma effetto citopatico, isolamento virale immunofluorescenza, ELISA ecc. aspetto istologico corpi di inclusione morfologia delle particelle virali immunoelettromicroscopia ibridazione con sonde specifiche PCR, ecc. Si tratta di tecniche oggi scarsamente usate nella diagnostica

27 Esame citologico: tecnica ancora impiegata direttamente sul materiale patologico, per rivelare es. inclusioni da vius della rabbia (corpi del Negri) o coilocitosi (Pap test, infezione genitale da papillomavirus Coilocitosi da HPV nella mucosa cervicale

28 Microscopia elettronica Praticamente non usata per scopi diagnostici, ma tuttora importante per identificare virus sconosciuti!! Necessaria la presenza di alta carica virale (almeno 10 6 particelle virali per ml). Di solito, usati ingrandimenti di 50,000-60,000 X. NB: Le particelle virali sono mostrate a ingrandimenti diversi. diam. approx: Adenovirus 100 nm Coronavirus 130 nm Rotavirus 70 nm Adenovirus Coronavirus Rotavirus Svantaggi della Microscopia Elettronica Non consente l dentificazione precisa della specie, ma solo della famiglia Costi per l apparecchio Costi di manutenzione Personale specializzato Bassa sensibilità

29 Immuno-elettro microscopia Sensibilità e specificità della ME possono essere aumentate mediante immunoelettro microscopia: Il campione viene trattato con anticorpo specifico marcato con metalli pesanti elettron-opachi prima della ME. La ME diventa così specifica e più sensibile. Virus dell epatite C Herpesvirus umano 8

30 Colture cellulari I campioni da analizzare dovrebbero essere raccolti all inizio della fase acuta dei sintomi. Di solito il picco della replicazione virale precede di 2-3 giorni la sintomatologia, che permane anche con livelli replicativi del virus bassi o assenti. tab 11-2 dai lucidi Il materiale clinico viene diluito e risospeso in terreno per coltura (con aggiunta di antibiotici e antimicotici). Di solito viene prima centrifugato per eliminare cllule e batteri. Vine inoculato su opportune colture cellulari. La presenza del virus è rivelta dall effetto citopatico che compare, a seconda del tipo e della quantità di virus, fra 1 giorno e 2-3 settimane

31 Colture cellulari - effetto citopatico enterovirus 71 virus herpes simplex virus respiratorio sinciziale (alto) e morbillo (basso). Il CPE è indicativo del virus, ma virus diversi possono dare CPE simili La conferma dell identità del virus può essere poi eseguita con tests di neutralizzazione, inibizione dell emoassorbimento, o immunofluorescenza.

32 Svantaggi delle colture cellulari Fino a 4 settimane per avere il risultato Spesso bassa sensibilità, dipendente anche dalle condizioni del campione Possibilita di contaminazione batterica Sensibilità a sostanze tossiche presenti nel campione Molti virus non crescono in coltura: es epatite B, papillomavirus, parvovirus, ecc. Necessità di linee cellulari diverse e difficoltà nell approvvigionameno di cellule primarie Poco usate per la diagnosi routinaria, sono ancora necessarie per l isolamento virale

33 Rilevamento di proteine virali Enzimi ed altre proteine podotte durante la replicazione possono essere rilevate mediante test biochimici, immunologici e molecolari I parte del riquadro 51.4 Murray

34 Immunofluorescenza

35 La rilevazione di alcuni virus può essere migliorata usando una combinazione di colture cellulari e metodi immunologici. es. Shell Vial per citomegalovirus, in cui il campione clinico viene centrifugato su cellule cresciute su un vetrino, che poi possone essere analizzate in immunofluorescenza dopo poche ore.

36 Rilevamento di acidi nucleici virali Sono test specifici, sensibili e veloci, che permettono di rivelare anche virus che non stanno replicando devono quindi essere giustamente interpretati!! II parte Tab 51-4 Murray, * * Branched DNA = Basata sulla amplificazione del segnale, non del bersaglio

37 PCR Polymerase Chain Reaction

38 Tecniche di quantificazione Sono diventate molto importanti le tecniche di quantificazione degli acidi nucleici, non per la diagnosi, ma per stabilire prognosi e regime terapeutico. Basate su real-time PCR.

39 Cautele nella interpretazione dei risultati di PCR Nella diagnosi di malattie infettive è estremamente facile contaminare (introdurre sequenze estranee, che danno falsi positivi) Necessaria una elevata esperienza dell operatore La quantificazione è possibile solo in particolari condizioni A volte, i risultati positivi sono di difficile interpretazione, come nel caso di virus latenti - presenza di sequenze non associate a malattia in corso.

40 Sierologia Rivelazione di aumenti di titolo anticorpale fra stato acuto e convalescente, o rivelazione di IgM durante l infezione primaria. Tecniche Classiche Tecniche recenti 1. Fissazione del complemento 1. Saggio radioimmunologico (RIA) 2. Inibizione dell emoagglutinazione 2. Saggi immunoenzimatici (EIA, ELISA) 3. Immunofluorescenza 3. Western Blot (WB) 4. Test di neutralizzazione 4. ELISPOT

41 Tipico profilo sierologico dopo una infezione acuta Nella reinfezione, le IgM possono essere assenti o a bassi livelli

42 Sierologia Criteri per diagnosticare una infezione primaria: Aumento di almeno 4 volte del titolo di IgG Presenza di IgM Sieroconversione Alti titoli di IgG raramente sono diagnostici Criteri per diagnosticare una reinfezione: Aumento di almeno 1 volta delle IgG fra siero acuto e siero convalescente Assenza o lieve aumento di IgM

43 Saggi immunoenzimatici (EIA, ELISA)

44 Test ELISA - per rivelare antigeni (A) o anticorpi (B) I pozzetti colorati indicano reazioni positive

45 Western Blot Spesso utilizzato per confermare diagnosi ottenute con altre tecniche (es. ELISA per HIV) gp 160 = precursore env gp 120 = env p55 = gag gp 41 = env p31 = RT pol p24 = core gag HIV-1 Western Blot 1: Controllo positivo 2 Controllo negativo A = campione negativo B = campione incerto C = campione positivo NB: Non basta la presenza di bande per indicare la positività, ma deve verificarsi la presenza di tutte o di alcune bande, con diversi criteri di positività, a seconda dei kit e degli studi RISULTATO POSITIVO: Almeno due bande, di cui 1 verso glicoproteine OPPURE almeno 3 bande, con reattività verso SIA gag CHE pol CHE env Bande presenti, ma con pattern diverso = il risultato è INCERTO

46 ELISPOT ELISPOT è un saggio semplice e sensibile per analizzare specifiche risposte immuni ad antigeni o peptidi. A seconda delle citochine analizzate, il saggio può differenziare i diversi tipi di risposta T (es Th1e Th2).

47 Utilità dei risultati sierologici L utilità e la significatività dipendono dal patogeno in questione: Es, per virus come rosolia e epatite A, la comparsa di sintomi coincide con lo sviluppo di anticorpi. La presenza di IgM (ma nella riattivazione di herpesvirus vengono spesso prodotte anche IgM) o di aumenti nelle IgG indica infezione attiva. Molti altri agenti infettanti danno malattia prima della comparsa degli anticorpi. In questi casi, la diagnosi è retrospettiva e quindi non utile clinicamente. Ci sono virus che danno malattia mesi/anni dopo la sieroconversione (HIV, rabbia). In questi casi, la presenza di anticorpi è sufficiente per fare diagnosi definitiva.

48 Problemi della sierologia Tempo necessario per avere siero acuto e siero convalescente. Infezioni subcliniche o lievi non sempre danno risposte umorali rilevabili. Virus fra loro correlati possono dare reazioni crociate (es HSVe VZV, encefalite giapponese e Dengue), dando falsi risultati positivi. pazienti immunocompromessi spesso hanno risposte assenti o ridotte pazienti che hanno ricevuto di recente trasfusioni possono dare false risposte positive, per il trasferimento passivo di anticorpi. pazienti con mononucleosi infettiva, alcune malattie del connettivo ed autoimmuni possono dare falsi positivi

49 Raccolta, conservazione e trasporto dei campioni E fondamentale raccogliere, conservare e trasportare i campioni nel modo opportuno. Un aspetto importante è la scelta del campione. Per esempio, in caso di meningite da enterovirus, oltre al liquor è opportuno analizzare anche le feci. Un altro aspetto è QUANDO si effettua il prelievo. Di solito, bisogna farlo all inizio della fase acuta, l analisi di campioni presi più tardi potrebbe dare risultati negativi: - molti virus respiratori possono scomparire prima che finiscano i sintomi - virus varicella non è più presente in lesioni vecchie di 5 giorni - gli anticorpi prodotti potrebbero impedire l identificazione del virus Molti virus sono labili, e c è il problema della contaminazione da batteri e miceti, che potrebbero crescere, quindi è cruciale la velocità di trasporto. Di solito, è consigliabile farlo in ghiaccio. I virus con pericapside perdono di infettività se conservati a t. ambiente o -20 C

50 Murray tab 51.1