UNIVERSITA DEGLI STUDI DI SALERNO

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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DI SALERNO Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Corso di Laurea in Scienze Biologiche Tesi di laurea in Analisi Biochimico Cliniche L impiego del metodo del Reverse Dot Blot per la diagnosi molecolare della Fibrosi Cistica Relatore Ch.ma Prof.ssa Elizabeth Illingworth Candidata Angela Dello Buono Matr Anno Accademico 2011/2012

2 CAPITOLO 1 INTRODUZIONE Il lavoro intende approfondire la più comune delle malattie genetiche gravi, la fibrosi cistica, soffermando l attenzione su un importante metodo diagnostico, il Reverse Dot Blot (RDB). 1.1 STORIA DELLA FIBROSI CISTICA La fibrosi cistica (FC) é una patologia letale che colpisce principalmente le normali funzioni di pancreas, polmoni e apparato digerente. La fibrosi cistica è stata descritta per la prima volta nel 1938, in seguito agli studi condotti su bambini malnutriti da parte di Dorothy Andersen. Inizialmente si pensava fosse solo una malattia del pancreas e i bambini affetti non riuscivano a compiere il primo anno di vita. Nel 1989 è stato identificato il gene responsabile della FC, grazie a Lap-Chee Tsui, Francis Collins e Jack Riordan. Questo gene fu chiamato CFTR "regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica", in quanto la funzione principale della proteina codificata è di regolare il passaggio di ioni, in particolare del cloro, attraverso la membrana delle cellule epiteliali, regolandone la conduttanza. Questa scoperta ha permesso di individuare diversi tipi di mutazioni del gene CFTR. Oggi l età di sopravvivenza dei pazienti affetti da fibrosi cistica è in costante aumento ed ora la maggior parte dei bambini con la malattia diventano adulti, con aspettativa di vita media oltre i 40 anni. La situazione 1

3 è migliorata molto rispetto a 70 anni fa per una serie di ragioni, ma in particolare grazie alle migliori terapie per le infezioni respiratorie. 1.2 QUADRO CLINICO DELLA FIBROSI CISTICA ED EREDITA La fibrosi cistica è una malattia diffusa in tutto il mondo, in particolare nelle popolazioni di pelli bianche; meno frequente negli asiatici e africani. Ne sono colpite circa persone nel mondo; in Italia vengono diagnosticati circa 200 nuovi casi all anno con un incidenza di un neonato malato su circa 3000 nati sani. Inoltre, si ritiene che i malati nel nostro paese siano circa La fibrosi cistica altera principalmente la funzione delle ghiandole esocrine, che secernono sostanze quali saliva, muco, sudore, lacrime e succhi pancreatici. Colpisce quindi ghiandole sudoripare, salivari, lacrimali e la porzione esocrina del pancreas. A causa della malattia tali ghiandole producono secreti con elevata viscosità con conseguenze in particolar modo all apparato respiratorio e digerente. Il muco molto denso chiude i bronchi e porta ad infezioni respiratorie; inoltre, ostruisce i dotti del pancreas ed impedisce agli enzimi pancreatici di raggiungere l intestino: di conseguenza i cibi non possono essere digeriti e assimilati. Le persone affette da fibrosi cistica possono avere sufficienza pancreatica, ma anche insufficienza pancreatica o un pancreas solo in parte funzionante. Negli individui con sufficienza pancreatica però si può verificare pancreatite cronica ricorrente, in cui gli enzimi pancreatici si attivano nel pancreas e ne causano danni e infiammazione. La seguente figura (1) riassume tutte le principali manifestazioni della fibrosi cistica. 2

4 Figura 1 Manifestazioni cliniche della fibrosi cistica a livello dei vari organi. Il sintomo più comune che riguarda l apparato respiratorio è la tosse persistente, dovuta a bronchiti e polmoniti ricorrenti, sostenute da batteri, in particolare Stafilococco aureo e Pseudomonas aeruginosa. Questi batteri possono determinare infiammazioni e infezioni croniche dei polmoni, con progressivo deterioramento e declino graduale della funzione respiratoria. Nell 85% dei casi i sintomi sono soprattutto a carico dell apparato gastrointestinale (pancreas, fegato, intestino); tra essi ricordiamo diarrea, malnutrizione, pancreatite cronica e in alcuni casi anche diabete, solitamente di tipo II. Inoltre, in circa il 10-15% dei bambini che nascono con fibrosi cistica si ha fin dalla nascita un ostruzione intestinale, chiamata ileo da meconio. Il meconio è un materiale intestinale, presente in tutti i neonati, ma in questi casi è molto denso e non riesce quindi ad essere espulso, come avviene normalmente, e blocca l intestino. 3

5 Manifestazioni a carico di altri organi sono sudorazione abbondante, detta sindrome da perdita di sali, che provoca appunto perdita di sali, ma anche disturbi alle ossa, come osteoporosi. Negli uomini si può avere anche un ostruzione dei dotti che portano lo sperma all esterno, il che causa sterilità; nelle donne ci può essere irregolarità del ciclo mestruale e difficoltà ad avviare una gravidanza. La modalità di comparsa e l entità dei sintomi, così come il decorso della malattia sono molto variabili. Per questo motivo non è semplice fare una previsione sull evoluzione dei sintomi, anche se la durata della vita di una persona affetta da fibrosi cistica dipende sostanzialmente dall evoluzione della malattia polmonare. La FC è una malattia autosomica recessiva, cioè un individuo per essere malato deve avere due copie del gene malattia (CFTR) mutato. Se viene ereditata una sola copia del gene mutato abbiamo un portatore sano, che è un individuo non malato ma che può trasmettere la malattia ai propri figli. Quando i genitori sono entrambi portatori per ciascuna gravidanza hanno il 25% di probabilità di avere un figlio con FC. 1.3 STRUTTURA DEL GENE E FUNZIONI DELLA PROTEINA CFTR Il gene responsabile della fibrosi cistica è il CFTR che codifica la sintesi della proteina CFTR, Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator. Tale proteina in condizioni normali funge da canale per il passaggio transmembrana di ioni, in particolare il cloro, dall interno all esterno delle cellule secretive, presenti in particolare nell apparato respiratorio, nelle ghiandole sudoripare, nell apparato gastrointestinale e anche nell apparato riproduttivo. 4