MANUALE DI LABORATORIO MICROBIOLOGIA DEGLI ALIMENTI. Francesco Villani

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1 MANUALE DI LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA DEGLI ALIMENTI Francesco Villani

2 PREFAZIONE Questo manuale è stato realizzato per fornire agli studenti uno strumento utile a comprendere in maniera più proficua gli argomenti di analisi microbiologica degli alimenti trattati durante le lezioni formali e le esercitazioni di microbiologia. Si tratta pertanto di una guida in cui sono riportate attività interattive ed esperimenti da svolgere, sotto la guida del docente, durante le esercitazioni di laboratorio. Tali attività pratiche saranno più proficue per quegli studenti che partecipano attivamente alle lezioni teoriche e alle relative esercitazioni in laboratorio. Nel primo capitolo sono riportate informazioni importanti sulla sicurezza nel laboratorio di microbiologia. Si raccomanda di leggere attentamente queste norme e rispettarle scrupolosamente. Nel manuale sono descritte procedure, metodi e substrati nutritivi. Talvolta si tratta solo di esempi adattati alla specifica realtà delle esercitazioni e quindi non necessariamente vanno utilizzati al di fuori di questo contesto nel modo in cui sono descritti. Nel caso di metodi analitici prescritti da normative nazionali o comunitarie, le procedure analitiche proposte in questo manuale potranno costituire un utile base di principi e criteri generali. Va ricordato inoltre che ogni riferimento a substrati, reagenti e Kit diagnostici è solo a titolo di esempio e non esclude l impiego di altri materiali che potrebbero essere adatti e che non sono qui citati. Sicuri di aver commesso errori, ringraziamo in anticipo tutti coloro che avranno la pazienza di segnalarceli. Laboratorio di microbiologia degli alimenti 2006 a cura di Francesco Villani con la collaborazione di A. Casaburi e C. Pennacchia 1

3 INDICE Capitolo Pagina 1 La sicurezza nel laboratorio di microbiologia 4 2 L analisi microbiologica degli alimenti Introduzione La domanda dell analisi microbiologica di un campione alimentare Campionamento: considerazioni ecologiche e principi Raccolta del campione I criteri microbiologici per gli alimenti Piani di campionamento 10 3 Metodi analitici per la numerazione dei microrganismi negli alimenti Conteggio standard di cellule vitali su piastra (Standard Plate Counts, SPC) Preparazione del campione per l analisi Preparazione delle diluizioni decimali seriali Tecniche di semina delle piastre Condizioni di incubazione delle piastre Numerazione delle colonie in piastra Considerazioni sui limiti di rilevamento del numero di microrganismi con la 24 tecnica di conteggio in piastra 3.4 Conteggio dei microrganismi in substrato liquido: tecnica di stima del numero più probabile di microrganismi (MPN, Most Probable Number) 25 4 Presupposti teorici sui metodi di ricerca e numerazione di batteri patogeni trasmessi con gli alimenti Principi di microbiologia selettiva e differenziale Fasi per la ricerca di specifici patogeni negli alimenti Resuscitazione o prearricchimento non selettivo Arricchimento selettivo Piastramento o isolamento su substrato selettivo e differenziale Conferma dell isolato: introduzione all identificazione dei batteri Principi sui metodi di identificazione dei batteri isolati dagli alimenti Principi generali Coltura pura Identificazione dei batteri Fasi per l identificazione dei batteri Descrizione delle condizioni colturali Morfologia cellulare Colorazione di Gram Reazione di Gram con KOH 3% Presenza di endospore Saggio della catalasi Saggio dell ossidasi Saggio di motilità 44 6 Metodi di ricerca e identificazione di batteri patogeni negli alimenti Ricerca di Salmonella spp. negli alimenti Ricerca di Shigella spp. negli alimenti Ricerca di Escherichia coli O157:H7 negli alimenti Ricerca di Yersinia enterocolitica negli alimenti Ricerca di Brucella spp. negli alimenti Ricerca di Aeromonas spp. negli alimenti Ricerca di Campylobacter spp. negli alimenti Ricerca di Vibrio cholerae negli alimenti Ricerca di Vibrio parahaemolyticus e altre specie di Vibrio negli alimenti Ricerca di Bacillus cereus negli alimenti Ricerca di Listeria monocytogenes negli alimenti Ricerca di Listeria monocytogenes nel latte e derivati del latte Numerazione di Listeria monocytogenes con la tecnica MPN Numerazione di Staphylococcus aureus negli alimenti 67 7 Popolazioni microbiche specifiche degli alimenti: presupposti teorici, significato e 69 metodi di ricerca e numerazione 7.1 Organismi Marker 69 2

4 7.2 Indicatori della qualità microbiologica degli alimenti Numero di Microrganismi Aerobi o Conta Batterica Totale Procedura di numerazione dei microrganismi aerobi mesofili negli alimenti Famiglia delle Enterobacteriaceae Procedura di numerazione delle Enterobacteriaceae totali negli alimenti Indicatori della sicurezza microbiologica degli alimenti Coliformi Procedura di numerazione dei coliformi e di E. coli negli alimenti Determinazione dei coliformi (totali) con il metodo di inclusione in terreno 73 nutritivo selettivo e differenziale agarizzato Determinazione dei coliformi totali con il metodo del Numero più Probabile 73 (MPN) Determinazione dei coliformi fecali (Escherichia coli presuntivo) con il metodo 75 del Numero più Probabile (MPN) Conferma del numero di Escherichia coli Esempio di numerazione dei coliformi, dei coliformi fecali e di Escherichia coli 76 con il metodo MPN Numerazione di Escherichia coli su substrati cromogenici o fluorogenici Il Kligler Iron Agar (KIAgar) Streptococchi fecali (enterococchi) Procedura di numerazione degli enterococchi negli alimenti Clostridi solfito riduttori Procedura di numerazione delle spore di clostridi solfitoriduttori negli alimenti Parametri microbiologici per la potabilità dell acqua 82 8 Schemi generali delle operazioni di laboratorio 85 A Fasi per la numerazione dei microrganismi 85 B Preparazione delle diluizioni di campioni alimentari solidi 86 C Preparazione delle diluizioni di campioni alimentari liquidi 87 D Semina per inclusione (Pour plate) e distribuzione superficiale (Spread plate) 88 E Determinazione del numero di microrganismi su terreno nutritivo solido 89 E1 Esempio di numerazione dei microrganismi (determinazione delle UFC/g o ml) 90 F Numerazione dei microrganismi in terreno nutritivo liquido (MPN di un campione 91 alimentare) F1 Esempio di determinazione del Most Probable Number e tavola MPN 92 G Fasi per la ricerca qualitativa di microrganismi patogeni 93 9 Esperimenti di laboratorio 94 1 Numerazione dei microrganismi aerobi mesofili totali e delle Enterobacteriaceae 94 in vegetali di IV gamma Diagramma 1 Fasi per la numerazione delle Enterobacteriaceae su terreno 95 nutritivo agarizzato selettivo e differenziale 2 Numerazione di coliformi e di Escherichia coli in carne macinata 96 Diagramma 2 Fasi per la numerazione dei coliformi e di Escherichia coli su 97 terreno nutritivo agarizzato selettivo e differenziale 3 Numerazione di coliformi in latte pastorizzato con il metodo MPN 98 Diagramma 3 Fasi per la numerazione dei coliformi in latte pastorizzato con il 99 metodo MPN 4 Numerazione di coliformi totali, coliformi fecali, streptococchi fecali, clostridi 100 solfito-riduttori e della microflora totale in acqua destinata al consumo umano 5 Controllo microbiologico delle superfici 101 Diagramma 5 Fasi per l analisi microbiologica delle superfici con tampone sterile Controllo microbiologico dell aria e degli ambienti di produzione degli alimenti 104 Appendici A Principali substrati nutritivi e diluenti usati per l analisi microbiologica degli 105 alimenti B Schede di rilievo dei risultati delle analisi microbiologiche e limiti microbiologici 114 per alcuni alimenti C Notazione scientifica e diluizioni in microbiologia 116 D Problemi di analisi microbiologica degli alimenti 118 E Risoluzione dei problemi di analisi microbiologica degli alimenti 120 3

5 1 La sicurezza nel laboratorio di microbiologia La sicurezza degli ambienti di lavoro deve rappresentare un obiettivo fondamentale per garantire la salute umana. Tra i diversi luoghi di lavoro, nei laboratori didattici o di ricerca, numerose possono essere le possibilità di infortuni come conseguenza della molteplicità delle operazioni che vi si compiono e delle apparecchiature, sostanze e agenti pericolosi usati. Risulta pertanto di fondamentale importanza conoscere in maniera dettagliata tutto ciò che è oggetto del proprio lavoro (apparecchiature, operazioni da compiere, organismi e sostanze da manipolare ecc.), dei possibili pericoli che lo caratterizzano e delle relative norme messe in atto per evitarli o prevenirli. In particolare, nei laboratori di microbiologia, le persone coinvolte nelle varie operazioni possono essere esposte ad una serie di pericoli microbiologici le cui probabilità di comparsa (rischio) e le conseguenze per la salute (gravità del rischio) sono strettamente dipendenti dal tipo di organismo manipolato. Pertanto, è buona norma, al fine di garantire la sicurezza degli operatori, condurre, per ogni microrganismo e per le operazioni correlate alla sua manipolazione, un analisi del rischio, in maniera da stabilire le procedure di corretta prassi da adottare. Di norma, le tecniche e le attività che si svolgono nel laboratorio didattico di microbiologia degli alimenti e i microrganismi che si manipolano, suggeriscono la presenza di rischio limitato allorquando tutte le operazioni sono condotte secondo buone pratiche di laboratorio. E dunque essenziale che tutte le norme siano rigorosamente rispettate in ogni passaggio quando si lavora con microrganismi. Di seguito sono descritte alcune norme e regole basilari di comportamento nel laboratorio di microbiologia: Considerare il laboratorio come un ambiente in cui si è esposti a pericoli di varia natura: è dunque importante esibire comportamenti ispirati dalla consapevolezza del lavoro da svolgere. Una buona organizzazione, un approccio disciplinato, attenzione e buon senso assicurano che ogni operazione e attività siano svolte in sicurezza e con successo. Una volta nel laboratorio di microbiologia: Seguire sempre le istruzioni dell istruttore o del docente; Prima di compiere qualsiasi operazione o utilizzare qualsiasi strumentazione chiedere sempre istruzioni; Non depositare sui banchi di lavoro oggetti personali (vestiario, borse, libri); Indossare e abbottonare il camice; Lavarsi le mani; Non conservare o consumare alimenti e bevande; Non fumare; Munirsi di dispositivi di protezione personale come guanti, occhiali, mascherine e altri quando particolari operazioni lo richiedono; Ponete particolare attenzione nell'uso di gas, della fiamma del becco Bunsen (proteggere, 4

6 raccogliendoli, i capelli lunghi per evitare il rischio di bruciarli) e degli apparecchi elettrici; Segnalate agli istruttori qualsiasi malfunzionamento o situazione non comune; Nessuna procedura microbiologica deve essere applicata senza aver ricevuto appropriate istruzioni e dimostrazioni dal personale istruttivo; Per minimizzare le possibilità di contaminazione degli operatori e dell ambiente le coltura microbiche vanno maneggiate secondo Buone Norme di Laboratorio e quindi considerate come se fossero patogene; Trasportare le provette contenenti microrganismi sempre nell apposito portaprovette; Non pipettare a bocca colture di microrganismi (salvo specifica indicazione); Al termine di ogni sessione di lavoro pulire i banchi di lavoro con una soluzione disinfettante (alcol denaturato o altra soluzione disinfettante messa a disposizione); Non asportate nessun materiale dal laboratorio (soluzioni, vetreria, piastre, pipette, colture batteriche etc.); Seguite le istruzioni che vi saranno fornite al termine della sessione di lavoro per eliminare qualsiasi materiale di scarto. Il materiale biologico deve essere smaltito in appositi contenitori; Lavatevi accuratamente le mani prima di lasciare il laboratorio. 5

7 2 L analisi microbiologica degli alimenti 2.1 Introduzione L analisi microbiologica degli alimenti, cioè la determinazione del numero e/o della presenza di specifiche popolazioni microbiche e/o di uno specifico microrganismo e/o di specifici metaboliti microbici (enzimi, tossine), è una disciplina scientifica abbastanza recente. Le prime analisi di prodotti lattierocaseari risalgono al 1930, mentre quelle relative al controllo dei molluschi al A partire dal 1950 incomincia a crescere l interesse analitico per tutti gli altri alimenti. L'analisi microbiologica degli alimenti trova la sua maggiore efficacia quando è intesa e utilizzata come strumento di supporto alla implementazione di sistemi di gestione della qualità e sicurezza microbiologica degli alimenti (come ad esempio l analisi dei pericoli e dei punti critici di controllo -HACCP ) e alla verifica della loro efficacia. Quando il controllo microbiologico degli alimenti è retrospettivo, cioè basato sul prelievo di un campione di alimento pronto per il consumo e sua analisi per la presenza di microrganismi patogeni, alterativi o marker, esso assume il carattere di una ispezione e quindi è inappropriato per principio. L ispezione, infatti, consente di misurare un effetto senza però identificare il meccanismo che lo ha generato. Allo stesso modo di come la misura della temperatura o della pressione di un paziente non consente di controllare la febbre o l ipertensione. Il controllo microbiologico degli alimenti dovrebbe essere orientato a: i) valutare le reali condizioni igieniche di produzione di un alimento al fine di identificare le fasi del processo in corrispondenza delle quali si verificano i rischi maggiori di contaminazione da parte di microrganismi pericolosi, di una loro sopravvivenza o di una loro incontrollata proliferazione; i risultati forniranno indicazioni utili per l'implementazione del sistema HACCP per la specifica realtà produttiva; ii) analisi dei prodotti finiti a conferma e verifica dell'efficacia del sistema HACCP implementato e per stabilire se le norme di buona fabbricazione, di conservazione e di distribuzione sono state strettamente seguite. Il piano dei controlli microbiologici va definito preventivamente. Esso deve essere strutturato in modo tale che anche minime variazioni all interno di un lotto (quantità di prodotto ben definita) di un singolo prodotto possano essere facilmente rilevate, consentendo di apportare le dovute correzioni prima che esso venga immesso sul mercato. E necessario stabilire la frequenza e il tipo di analisi in funzione degli obblighi legislativi, della tipologia e quantità dei prodotti e della storia analitica. I controlli microbiologici, secondo le finalità perseguibili, devono riguardare le materie prime, gli intermedi di lavorazione, i coadiuvanti tecnologici, il personale gli ambienti di trasformazione e il prodotto finito. 6

8 2.2 La domanda dell analisi microbiologica di un campione alimentare. La maggior parte dei controlli di qualità sono fatti o richiesti dal produttore, il cui interesse è quello di dimostrare al compratore la qualità del suo prodotto. In ogni modo, l analisi microbiologica di un campione alimentare è richiesta per diversi motivi, tra i quali ricordiamo: la verifica dell efficacia dei sistemi di garanzia della qualità e della sicurezza implementati; per provare a livello internazionale la buona qualità microbiologica del prodotto; quando un alimento è sospettato di essere stato causa di malattia alimentare; per l identificazione dei pericoli potenziali durante le fasi di un processo produttivo; per l identificazione dei Punti Critici di Controllo; per stabilire la shelf life di un prodotto ai fini dell etichettatura (data di scadenza). Il tipo di indagine microbiologica da condurre su un determinato campione alimentare può riguardare: a) la determinazione del numero di specifiche popolazioni microbiche (Microrganismi totali «aerobi, anaerobi, microaerofili, sporigeni, non sporigeni, psicrotrofici, mesofili, termofili»; Lieviti e Muffe; Enterobacteriaceae; Coliformi; Batteri lattici; Micrococcaceae, ecc.); b) la determinazione del numero di specifici microrganismi (Protecnologici, Probiotici, Patogeni, Alterativi); c) la determinazione della presenza o assenza (ricerca) di specifici microrganismi patogeni veicolati dagli alimenti; d) la ricerca di determinati metaboliti prodotti dai microrganismi (enzimi, tossine). Nell analisi microbiologica di un alimento si devono prendere in considerazione diversi punti: il piano di campionamento e i criteri microbiologici; il prelievo e trasporto dei campioni in laboratorio; la scelta dei metodi analitici per il rivelamento, la numerazione e l identificazione di specifici microrganismi o di gruppi di microrganismi e delle loro tossine. Questi aspetti saranno trattati in dettaglio nei prossimi paragrafi. 2.3 Campionamento: considerazioni ecologiche e principi A differenza dell analisi chimica degli alimenti, in cui le sostanze chimiche dannose sono il più delle volte distribuite uniformemente e, nella maggioranza dei casi, la loro concentrazione rimane più o meno costante nel tempo, l analisi microbiologica di un alimento deve tener conto dell ecologia microbica dello stesso. Infatti, la distribuzione dei microrganismi negli alimenti è imprevedibile e nella maggioranza dei casi essi sono distribuiti in maniera casuale, con stratificazioni microscopiche e spaziali. Inoltre, la microflora di un alimento presenta un carattere dinamico, potendo aumentare o diminuire di numero durante le varie fasi di un processo produttivo in funzione delle condizioni ecologiche che si realizzano. Queste considerazioni richiedono una scelta adeguata del piano di campionamento. Ogni campione preso per l analisi può essere considerato come una perdita per il produttore. In alcuni casi, l intera unità da cui è prelevato il campione da sottoporre ad analisi (ad es: da una bottiglia sigillata o da una confezione sigillata) è in pericolo di andare incontro ad alterazione. Per questa ragione e per motivi di igiene l intera unità va scartata dopo il prelivo (ovvero non deve immessa in commercio o consumata). 7

9 Per minimizzare le perdite, solo la porzione più piccola possibile è presa come campione. Se una particolare proprietà dell alimento varia all interno dell alimento nella sua interezza, ogni conclusione rispetto a quella proprietà é di limitato valore se essa é basata su un campione piccolo; inoltre, prendere delle decisioni sulla base di tali conclusioni potrebbe comportare considerevoli rischi sullo stato di sicurezza del prodotto. In ogni modo incertezza e rischio sono inevitabili nel liberare un lotto (cioè definirlo accettabile) sulla base di test a campione. 2.4 Raccolta del campione Il campione deve essere costituito da uno specificato numero di unità campionarie (in genere 5; vedi piani di campionamento per la definizione di unità campionaria) prelevate a random da ogni lotto di prodotto. Ogni unità campionaria dovrebbe consistere di almeno 100 g o ml e, in ogni caso, dovrebbe essere in quantità tale da rispettare i criteri stabiliti nel piano. Quando è possibile, prelevare sempre campioni da contenitori perfettamente sigillati. Se il prodotto da analizzare è costituito da grosse masse, prelevare diverse sottounità che andranno a costituire l unità campionaria finale. Le unità campionarie totali non devono provenire dallo stesso contenitore della massa del campione, ma da contenitori diversi. I campioni di alimento vanno raccolti in contenitori sterili, avendo cura di adottare tutte le precauzioni di asepsi per evitare contaminazioni. Inoltre, i campioni vanno conservati e trasportati in condizioni refrigerate (0-4 C) o allo stato congelato, in funzione della natura del prodotto. In alcuni casi, la legislazione nazionale e comunitaria fornisce indicazioni specifiche sulle modalità operative da seguire per il campionamento di alimenti da analizzare da un punto di vista microbiologico. Alcune di queste normative sono: O.M riguardante i Limiti di cariche microbiche tollerabili in determinate sostanze alimentari e bevande (G.U. n. 346 del ); Decisione 471/2001 CE riguardante i controlli generali delle condizioni igieniche di produzione delle carni fresche; Circolare Ministero della Sanità del 28/08/2002 riguardante la ricerca di L. monocytogenes in prosciutti crudi stagionati; Regolamento (CE) n. 2073/2005 della Commissione, del 15 novembre 2005, sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari. Nel capitolo 3.1 dell allegato 1 al Regolamento sono riportate Norme generali per il campionamento e la preparazione dei campioni da analizzare. In assenza di norme più specifiche in materia di campionamento e di preparazione dei campioni da analizzare, si utilizzano come metodi di riferimento le norme pertinenti dell ISO (International Organisation for Standardization) e gli orientamenti del Codex alimentarius. Nel capitolo 3.2 sono invece riportate le norme specifiche per il Campionamento batteriologico nei macelli e nei luoghi di produzione di carne macinata e preparazioni a base di carne. Tali norme riguardano il di campionamento per le carcasse di bovini, suini, ovini, caprini ed equini e di pollame. 8

10 2.5 I criteri microbiologici per gli alimenti La determinazione della presenza o del numero di microrganismi indicatori o patogeni può essere utilizzata per giudicare la qualità e la sicurezza microbiologica di un alimento. È evidente che per esprimere un giudizio obiettivo si deve far riferimento a specifici e ben definiti criteri microbiologici. Le analisi microbiologiche degli alimenti mirano fondamentalmente ad accertare che l alimento rispetti specificati criteri microbiologici. Un criterio microbiologico stabilisce i limiti della presenza o assenza di specifici microrganismi o loro tossine negli alimenti. Un criterio microbiologico deve fornire le seguenti informazioni: le caratteristiche per identificare l alimento; il tipo, la specie o il gruppo di organismi da ricercare; i metodi analitici da usare; il piano di campionamento; i limiti microbiologici applicabili per lo specifico prodotto. Essi sono usati per accertare la sicurezza microbiologica di un alimento, il rispetto dell applicazione di norme di Buona Fabbricazione e Distribuzione degli alimenti (GMPD), l effetto della conservazione sulla qualità degli alimenti, l adattabilità di un ingrediente o alimento per usi particolari. I criteri microbiologici possono essere stabiliti da apposite leggi nazionali o Europee, da accordi di tipo commerciale, da organizzazioni specifiche (organizzazioni scientifiche, Codex alimentarius). I criteri microbiologici possono essere sia obbligatori che consigliati. I criteri obbligatori non possono essere superati e l alimento che non rispetta i limiti specificati deve essere sottoposto ad alcune azioni come il ritiro dal consumo, la distruzione o destinato alla produzione di alimenti diversi da quello a cui era destinato. I criteri consigliabili consentono di esprimere un giudizio di accettabilità e servono come campanello di allarme per mettere in evidenza anomalie di processo, distribuzione, di conservazione o vendita. Per scopi applicativi sono utilizzati tre tipi di criteri: Standard microbiologico: criterio microbiologico stabilito per legge. È quindi un criterio obbligatorio il cui mancato rispetto costituisce una violazione punibile. Esso può contenere limiti per microrganismi patogeni o per microrganismi indicatori. Linee guida microbiologiche: sono criteri spesso usati dall industria alimentare per il controllo di processo. Esse funzionano come un segnale d allarme per indicare se le condizioni microbiologiche esistenti ad un CCP o in un prodotto finito rientrano nei limiti normali. Sono quindi usati per valute l efficienza di un processo ad un CCP e la conformità con le GMPD. Le linee guida sono consigliate ed intese ad aumentare la garanzia della sicurezza igienica. Specificazioni microbiologiche: criteri microbiologici usati come requisito per l acquisto di una materia prima o di un prodotto. In pratica le specifiche sono in genere dettate dal trasformatore al produttore o fornitore di materie prime e specificano le condizioni di fornitura. A partire dal 1 gennaio 2006, i criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari sono stabiliti dal «Regolamento (CE) n. 2073/2005 della Commissione, del 15 novembre 2005, sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari». Di seguito sono riportati alcuni punti tratti dal regolamento, rimandando quanti fossero interessati alla sua lettura per esteso. Nelle considerazioni introduttive, il Regolamento riporta: «. (2) I prodotti alimentari non devono contenere microrganismi, né loro tossine o metaboliti, in quantità 9

11 tali da rappresentare un rischio inaccettabile per la salute umana.. (3) Il regolamento (CE) n. 178/2002 stabilisce requisiti generali di sicurezza dei prodotti alimentari, in base ai quali i prodotti a rischio non possono essere immessi sul mercato. Gli operatori del settore alimentare hanno l obbligo di ritirare dal mercato gli alimenti a rischio.. (4) I criteri microbiologici indicano inoltre come orientarsi nello stabilire l accettabilità di un prodotto alimentare e dei relativi processi di lavorazione, manipolazione e distribuzione. L applicazione dei criteri microbiologici deve costituire parte integrante dell attuazione delle procedure HACCP e di altre misure di controllo dell igiene». Il campo di applicazione del Regolamento è riportato nell Articolo 1, che recita: «Il presente regolamento stabilisce i criteri microbiologici per taluni microrganismi e le norme di attuazione che gli operatori del settore alimentare devono rispettare nell applicazione delle misure di igiene generali e specifiche di cui all articolo 4 del regolamento (CE) n. 852/2004. L autorità competente verifica il rispetto delle norme e dei criteri di cui al presente regolamento conformemente al regolamento (CE) n. 882/2004, senza pregiudizio del suo diritto di procedere a ulteriori campionamenti ed analisi per la rilevazione e la misura della presenza di altri microrganismi, delle loro tossine o dei loro metaboliti, o come verifica dei processi, per i prodotti alimentari sospetti, o nel contesto dell analisi del rischio». Il Regolamento riporta, inoltre, definizioni importanti alcune delle quali si riportano di seguito: «a) «microrganismi», i batteri, i virus, i lieviti, le muffe, le alghe, i protozoi parassiti, gli elminti parassiti microscopici, le loro tossine e i loro metaboliti; b) «criterio microbiologico», un criterio che definisce l accettabilità di un prodotto, di una partita di prodotti alimentari o di un processo, in base all assenza, alla presenza o al numero di microrganismi e/o in base alla quantità delle relative tossine/metaboliti, per unità di massa, volume, area o partita; c) «criterio di sicurezza alimentare», un criterio che definisce l accettabilità di un prodotto o di una partita di prodotti alimentari, applicabile ai prodotti immessi sul mercato; d) «criterio di igiene del processo», un criterio che definisce il funzionamento accettabile del processo di produzione. Questo criterio, che non si applica ai prodotti immessi sul mercato, fissa un valore indicativo di contaminazione al di sopra del quale sono necessarie misure correttive volte a mantenere l igiene del processo di produzione in ottemperanza alla legislazione in materia di prodotti alimentari;... j) «campione», una serie composta di una o più unità o una porzione di materia selezionate tramite modi diversi in una popolazione o in una quantità significativa di materia e destinate a fornire informazioni su una determinata caratteristica della popolazione o della materia oggetto di studio e a costituire la base su cui fondare una decisione relativa alla popolazione o alla materia in questione o al processo che le ha prodotte; k) «campione rappresentativo», un campione nel quale sono mantenute le caratteristiche della partita dalla quale è prelevato, in particolare nel caso di un campionamento casuale semplice, dove ciascun componente o aliquota della partita ha la stessa probabilità di figurare nel campione; l) «conformità ai criteri microbiologici», l ottenimento di risultati soddisfacenti o accettabili di cui all allegato I nei controlli volti ad accertare la conformità ai valori fissati per i criteri mediante il prelievo di campioni, l effettuazione di analisi e l attuazione di misure correttive, conformemente alla legislazione in materia di prodotti alimentari e alle istruzioni dell autorità competente». 2.6 Piani di campionamento I criteri microbiologici sono strettamente connessi al piano di campionamento. Infatti, quando si esamina un alimento per la presenza di un microrganismo, i limiti che esso deve rispettare fanno riferimento ad un campione rappresentativo del lotto produttivo (o unità campionaria). Dunque, i criteri microbiologici che definiscono l accettabilità di un determinato prodotto alimentare, dettano il piano di campionamento da adottare, con particolare riferimento al numero di campioni da sottoporre ad analisi. Esistono piani di campionamento a due e a tre classi. Piani di campionamento a due classi. In questo piano il campione può ricadere in una di due classi: accettato o rifiutato. Dunque questi piani vengono usati per decisioni presenza/assenza. Gli attributi ideali per questi piani sono: 10

12 n: numero di unità da campionare e da sottoporre ad analisi; per unità campionaria (u.c.) deve intendersi una porzione singola o confezione di prodotto alimentare scelta a caso su cui si eseguiranno le analisi; m: numero limite di batteri che determina l inaccettabilità del lotto; c: numero massimo di unità campionarie che possono superare il valore di m accettate per esprimere l idoneità del lotto. Di seguito viene riportato un esempio per illustrare come si interpretano i risultati di un piano a 2 classi. Es. n=5 c=2 m=0 Il lotto è fuori dai criteri se più di 2 u.c. presentano il microrganismo. In genere in questi piani c=0, per cui il campione è accettato solo se tutte le u.c. non superano il limite m. Piani di campionamento a tre classi. Il campione può ricadere nelle seguenti tre classi: da 0 a m; da m a M; al di sopra di M. Le tre classi qualitative per le n unità campionarie sono identificabili con le seguenti lettere: m: valore limite del numero di batteri; il risultato è considerato soddisfacente se il numero di batteri in tutte le unità campionarie analizzate è inferiore ad m; M: valore massimo del numero di batteri tollerato; il risultato è considerato insoddisfacente se il numero di batteri in una o più delle unità campionarie analizzate è superiore ad M; c: numero delle unità campionarie il cui valore può essere compreso tra m ed M; il campione viene considerato ancora accettabile se il numero di batteri delle altre unità campionarie è pari o inferiore ad m. Il piano di campionamento a tre classi consente una maggiore flessibilità nell interpretazione di risultati positivi, ammettendo la possibilità che una piccola proporzione dei campioni analizzati (c) possa superare, entro un certo limite, il valore massimo consentito (m). Si considerino i seguenti esempi: Esempio 1. Supponiamo che per un dato alimento sono fissati i seguenti criteri microbiologici: n=5; c=2; m=5x10 3 ; M=2x10 4. L analisi microbiologica su ciascuna delle cinque unità campionarie analizzate fornisce i seguenti risultati: UFC/g= (1) 9,5x10 2 ; (2) 3,5x10 3 ; (3) 1,5x10; (4) 2,1x10; (5) 4,3x10 5. Giudizio di accettabilità dell alimento: l alimento non è accettabile in quanto una delle u.c. (la n 5) supera il valore massimo del numero di batteri tollerato (M=2x10 4 ). Esempio 2. Esprimiamo il giudizio di accettabilità di un alimento che deve rispettare i seguenti criteri per il numero di Staphylococcus aureus: Parametri microbiologici n m M c Staphylococcus aureus (UFC/ml) Il campione è accettabile quando in tutte le u.c. il numero di S. aureus è uguale o inferiore a 500/ml ovvero se non più di 2 u.c. presentano un valore compreso tra 500 e 2000; Il campione è inaccettabile quando una sola delle u.c. presenta un valore superiore a 2000 oppure quando più di due u.c. presentano valori compresi tra 500 e

13 Esempio 3. Se sono analizzati 10 campioni di un lotto (n=10) e i criteri stabiliscono che solo due u.c. possono superare i valori di accettabilità (m<valore<m) allora l intero lotto viene considerato non conforme quando più di 2 u.c. presentano questi valori. E evidente che maggiore è n e minori sono i rischi di esprimere dei giudizi non corretti sull intero lotto. In ogni modo al crescere di n il campionamento e le analisi diventano lunghe e costose. Il piano di campionamento specificato in un criterio microbiologico deve tenere conto del potenziale rischio associato al consumo di uno specifico alimento. E stato proposto dall ICMSF (International Commission on the Microbiological Specification for Foods) un sistema di classificazione degli alimenti in funzione della gravità del rischio (cioè in base alle conseguenze determinate dal pericolo sulla salute umana) che essi comportano. Sono state individuate 15 categorie di pericoli, suggerendo per ogni caso il piano di campionamento più appropriato (Tabella 2.1). Tabella Piani di campionamento consigliati in funzione della severità dei pericoli Grado di severità del pericolo Nessun pericolo diretto Pericolo per la salute: Basso, indiretto (indicatore) Moderato, diretto, diffusione limitata Moderato, diretto, diffusione potenzialmente vasta Grave Condizioni in cui l alimento é trasformato, conservato e consumato riduzione pericolo nessun cambio aumento pericolo CASO 1 CASO 2 CASO 3 3 classi n=5, c=3 3 classi n=5, c=2 3 classi n=5, c=1 CASO 4 CASO 5 CASO 6 3 classi n=5, c=3 3 claasi n=5, c=2 3 classi n=5, c=1 CASO 7 CASO 8 CASO 9 3 classi n=5, c=2 3 classi n=5, c=1 3 classi n=10, c=1 CASO 10 CASO 11 CASO 12 2 classi n=5, c=0 2 classi n=10, c=0 2 classi n=20, c=0 CASO 13 CASO 14 CASO 15 2 classi n=15, c=0 2 classi n=60, c=0 2 classi n=60, c=0 Come si può notare nella Tabella 1.1, la stringenza (severità) del campionamento aumenta all aumentare della gravità del pericolo (ad esempio la presenza di particolari microrganismi patogeni come Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7). Come riportato nel paragrafo precedente, il Regolamento (CE) n. 2073/2005 distingue i criteri microbiologici in «criteri di sicurezza alimentare» (definiscono l accettabilità di un prodotto o di una partita di prodotti alimentari) e «criteri di igiene del processo» (definiscono il funzionamento accettabile del processo di produzione). Nel Capitolo 1 dell allegato I al Regolamento sono riportati i criteri microbiologici e i criteri di igiene del processo che vanno applicati ai singoli prodotti alimentari. Per ogni categoria alimentare, sono riportati: i microrganismi e/o loro tossine e metaboliti da ricercare; il numero di unità campionarie da analizzare; i limiti m ed M massimi che vanno rispettati per l accettabilità del campione; il metodo di analisi da applicare; la fase a cui si applica il criterio di accettabilità. A titolo di esempio, nella Tabella 2.2 si riportano i limiti e i piani di campionamento relativi ai criteri di sicurezza per le categorie di alimenti indicate nel Regolamento 2073/

14 Tabella 2.2 Criteri di sicurezza alimentare Categoria alimentare Alimenti pronti per lattanti e alimenti pronti a fini medici speciali Alimenti pronti che costituiscono terreno favorevole alla crescita di L. monocytogenes, diversi da quelli destinati ai lattanti e a fini medici speciali. Alimenti pronti che non costituiscono terreno favorevole * alla crescita di L. monocytogenes, diversi da quelli destinati ai lattanti e a fini medici speciali. * I prodotti con ph 4,4 o aw 0,92, i prodotti con ph 5,0 e aw 0,94, i prodotti con un periodo di conservabilità inferiore a 5 giorni sono automaticamente considerati appartenenti a questa categoria. Anche altri tipi di prodottipossono appartenere a questa categoria, purché vi sia una giustificazione scientifica. Microrganismo/loro tossine, metaboliti Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Piano di Limiti campionamento n c m M 10 0 Assente in 25 g 100 ufc/g Questo criterio si applica se il produttore è in grado di dimostrare, con soddisfazione dell autorità competente, che il prodotto non supererà il limite di 100 ufc/g durante il 5 0 periodo di conservabilità. L operatore può fissare durante il processo limiti intermedi sufficientemente bassi da garantire che il limite di 100 ufc/g non sia superato al termine del periodo di conservabilità. 5 0 Assente in 25 g ufc/g Carne macinata e preparazioni a base di carne destinate ad essere consumate crude. Salmonella 5 0 Assente in 25 g Carne macinata e preparazioni a base di carne di pollame destinate ad essere consumate cotte. Salmonella 5 0 Carne macinata e preparazioni a base di carne di animali diversi dal pollame destinate ad essere consumate cotte. Salmonella 5 0 Dall Assente in 10 g Dall Assente in 25 g Assente in 10 g Carni separate meccanicamente (CSM). Salmonella 5 0 Assente in 10 g Prodotti a base di carne destinati ad essere consumati crudi, esclusi i prodotti per i quali il procedimento di lavorazione o la composizione del Salmonella 5 0 Assente in 25g prodotto eliminano il rischio di salmonella. Prodotti a base di carne di pollame destinati ad essere consumati cotti. Dall Salmonella 5 0 Assente in 10 g Dall Assente in 25 g Gelatina e collagene. Salmonella 5 0 Assente in 25 g Formaggi, burro e panna ottenuti da latte crudo o da latte sottoposto a trattamento termico a temperatura più bassa della pastorizzazione. Salmonella 5 0 Assente in 25 g Latte in polvere e siero di latte in polvere. Salmonella 5 0 Assente in 25 g Gelati, esclusi i prodotti per i quali il procedimento di lavorazione o la composizione del prodotto eliminano il rischio di salmonella. Salmonella 5 0 Assente in 25 g Prodotti a base di uova, esclusi i prodotti per i quali il procedimento di lavorazione o la composizione del prodotto eliminano il rischio di Salmonella 5 0 Assente in 25 g salmonella. Alimenti pronti contenenti uova crude, esclusi i prodotti per i quali il procedimento di lavorazione o la composizione del prodotto eliminano il Salmonella 5 0 Assente in 25 g o ml rischio di salmonella. Crostacei e molluschi cotti. Salmonella 5 0 Assente in 25 g Molluschi bivalvi vivi ed echinodermi, tunicati e gasteropodi vivi. Salmonella 5 0 Assente in 25 g Semi germogliati (pronti al consumo). Salmonella 5 0 Assente in 25 g o ml Frutta e ortaggi pretagliati (pronti al consumo). Salmonella 5 0 Assente in 25 g Succhi di frutta e di ortaggi non pastorizzati (pronti al consumo). Salmonella 5 0 Assente in 25 g Formaggi, latte in polvere e siero di latte in polvere, come indicati nei Enterotossine criteri relativi agli stafilococchi coagulasi positivi nel capitolo 2, punto 2, del presente allegato. stafilococciche 5 0 Non rilevabili in 25 g Alimenti in polvere per lattanti e alimenti dietetici in polvere a fini medici speciali destinati ai bambini di età inferiore ai 6 mesi, come indicati nel criterio relativo alle enterobatteriacee nel capitolo 2, punto 2, del presente allegato. Salmonella 30 0 Assente in 25 g Alimenti in polvere per lattanti e alimenti dietetici in polvere a fini medici speciali destinati ai bambini di età inferiore ai 6 mesi, come indicati nel criterio relativo alle enterobatteriacee nel capitolo 2, punto 2, del presente allegato. Molluschi bivalvi vivi ed echinodermi, tunicati e gasteropodi vivi durante il loro periodo di conservabilità. Enterobacter sakazakii Escherichia coli (utilizzato come indicatore di contaminazione fecale) Assente in 10 g MPN/100 g di carne e liquido intravalvare Prodotti della pesca ottenuti da specie ittiche associate con un tenore elevato di istidina. Istamina mg/kg 200 mg/kg Prodotti della pesca che hanno subito un trattamento di maturazione enzimatica in salamoia, ottenuti da specie ittiche associate con un tenore elevato di istidina. Istamina mg/kg 400 mg/kg 13

15 Il Regolamento 2073/2005 riporta inoltre, nel Capitolo 2, i criteri di igiene dei processi di produzione delle seguenti categorie di alimenti: 2.1 Carni e prodotti a base di carne - Carcasse di bovini, ovini, caprini ed equini. - Carcasse di suini. - Carcasse di bovini, ovini, caprini e equini. - Carcasse di pollame (broilers e tacchini). - Carne macinata. - Carni separate meccanicamente (CSM). - Preparazioni a base di carne. Sono riportati limiti per i seguenti microrganismi o popolazioni di microrganismi: Conteggio delle colonie aerobiche; Enterobacteriaceae; Salmonella; Escherichia coli. In caso di risultati insoddisfacenti sono indicate anche le azioni da mettere in atto per riportare i valori nei limiti prefissati (ad esempio: Miglioramento delle condizioni igieniche della macellazione e revisione dei controlli del processo, dell origine degli animali e delle misure di biosicurezza nelle aziende di origine ). 2.2 Latte e prodotti lattiero-caseari - Latte pastorizzato e altri prodotti lattiero-caseari liquidi pastorizzati. - Formaggi a base di latte o siero di latte sottoposto a trattamento termico. - Formaggi a base di latte crudo. - Formaggi a base di latte sottoposto a trattamento termico a temperatura inferiore a quella della pastorizzazione e formaggi stagionati a base di latte o siero di latte sottoposto a pastorizzazione o a trattamento termico a temperatura più elevata. - Formaggi a pasta molle non stagionati (formaggi freschi) a base di latte o siero di latte sottoposto a pastorizzazione o a trattamento termico a temperatura più elevata. - Burro e panna a base di latte crudo o di latte sottoposto a trattamento termico a temperatura inferiore a quella della pastorizzazione. - Latte in polvere e siero di latte in polvere. - Gelati e dessert a base di latte congelati. - Alimenti in polvere per lattanti e alimenti dietetici in polvere a fini medici speciali destinati ai bambini di età inferiore ai 6 mesi. I microrganismi o le popolazioni di microrganismi prese in considerazione sono: Enterobacteriaceae; Salmonella; Escherichia coli; Stafilococchi coagulasi positivi. Le azioni da mettere in atto in caso di risultati insoddisfacenti variano in funzione della tipologia di prodotto. Ad esempio per il latte pastorizzato l azione riguarda il Controllo dell efficacia del trattamento termico e prevenzione della ricontaminazione, nonché verifica della qualità delle materie prime. Nei prodotti, come i formaggi a base di latte crudo, in cui è riscontrato un numero di stafilococchi coagulasi positivi superiore al limite (n=5; m 10 4 ufc/g; M>10 5 ufc/g; c=2) le azioni correttive proposte sono: Miglioramento delle condizioni igieniche durante la produzione e della scelta delle materie prime. Se si rilevano valori >10 5 ufc/g, la partita di formaggio deve essere sottoposta alle prove sulle enterotossine stafilococciche. 2.3 Prodotti a base di uova - Prodotti a base di uova. Limiti: Enterobacteriaceae (n=5; m 10 ufc/g o ml; M>10 0 ufc/g o ml; c=2). Azioni in caso di risultati insoddisfacenti: Controllo dell efficacia del trattamento termico e prevenzione della 14

16 ricontaminazione. 2.4 Prodotti della pesca - Prodotti sgusciati di crostacei e molluschi cotti. 2.5 Ortaggi, frutta e prodotti derivati - Frutta e ortaggi pretagliati (pronti al consumo). - Succhi di frutta e di ortaggi non pastorizzati (pronti al consumo). 15

17 3 Metodi analitici per la numerazione dei microrganismi negli alimenti 3.1 Introduzione L accertamento del numero di organismi presenti nelle materie prime, negli intermedi di lavorazione, negli ambienti di processo e nei prodotti alimentari pronti per il consumo, viene largamente impiegato per il controllo della qualità microbiologica nelle industrie alimentari. Diversi sono i metodi utilizzati per la numerazione dei microrganismi presenti in un campione alimentare. Quelli maggiormente utilizzati sono: conteggio standard di cellule vitali su piastra (Standard Plate Counts, SPC); metodo del numero più probabile di microrganismi (Most Probable Numbers, MPN) per la determinazione statistica delle cellule vitali; conteggio diretto microscopico, per cellule vitali e non; tecniche che sfruttano la riduzione di coloranti per stimare il numero di microrganismi che possiedono capacità riduttive. Tutti i metodi di conteggio presentano una serie di limitazioni, per cui i risultati vanno interpretati tenendo conto di una serie di fattori, quali: il metodo di campionamento e sottocampionamento; la distribuzione e dinamicità dei microrganismi nel campione; il tipo e la natura dell alimento e della microflora in esso presumibilmente presente; la storia analitica dell alimento; il metodo di analisi, il tempo, la temperatura e l atmosfera di incubazione, la composizione, il ph, l attività dell acqua (a w), il potenziale di ossido-riduzione (Eh) del diluente e del terreno nutritivo utilizzato. 3.2 Conteggio standard di cellule vitali su piastra (Standard Plate Counts, SPC) La quantificazione del numero di batteri presenti in o su un alimento mediante il conteggio in piastra, si fonda sul principio che le cellule vive presenti in una determinata aliquota del campione (grammo o millilitro), una volta trasferiti (seminati, inoculati) in o su un adatto substrato nutritivo agarizzato, dopo incubazione a temperatura e atmosfera idonee, si moltiplicheranno (in tempi variabili a seconda del loro tasso di crescita nelle condizioni usate per la loro coltivazione), dando origine a colonie visibili che possono essere contate. I metodi colturali di numerazione dei microrganismi prevedono una serie di fasi che vanno seguite nell ordine predefinito, al fine di ridurre al minimo le limitazioni descritte precedentemente. Le fasi sono: a. Preparazione del campione e delle diluizioni seriali (scelta del diluente); b. Semina in o su terreno nutritivo agarizzato (scelta del substrato adatto); 16

18 c. Incubazione alla temperatura e per tempi appropriati alla microflora da numerare; d. Conteggio delle colonie e interpretazione dei risultati Preparazione del campione per l analisi Le cellule microbiche imbrigliate nelle matrici alimentari, per essere contate devono essere trasferite nell adatto substrato nutritivo. I campioni alimentari liquidi possono essere trasferiti in piastra tal quali (eventualmente previa diluizione). I campioni solidi, invece, prima di essere analizzati, vanno omogeneizzati in un adatto diluente, al fine di disperdere i microrganismi nella fase liquida che può essere facilmente manipolata per l analisi. Preparazione dell omogenato o diluizione madre. L aliquota di campione destinata alla preparazione dell omogenato deve essere sufficientemente grande in modo da essere rappresentativa della complessa composizione microbica del campione. In genere vengono omogenate da un minimo di 10 g ad un massimo di 40 g. L omogenato del campione alimentare viene preparato diluendolo nel rapporto 1:10 in un adatto diluente. Tale sospensione-diluizione, detta anche prima diluizione o diluizione madre, usualmente viene realizzata aggiungendo 90 ml di diluente a 10 g di campione. Tale metodo, dato il diverso grado di solubilità degli alimenti, potrebbe comportare errori nel calcolo finale del numero di microrganismi realmente presenti nel campione iniziale. Un metodo più accurato di preparazione della prima diluizione è quello di pesare 10 g di campione, aggiungere circa ml di diluente, omogeneizzare, trasferire l omogenato in un cilindro graduato da 100 ml, quindi portare a volume con lo stesso diluente. Scelta del diluente. Sono stati proposti diversi diluenti per la preparazione della diluizione madre di un campione alimentare (Vedi Appendice A M1). La scelta del diluente è una fase molto importante dell analisi, in quanto diluenti non adatti, come ad esempio l acqua, possono causare danneggiamenti delle cellule microbiche, con conseguente sottostima del numero di microrganismi. Il diluente più utilizzato è la soluzione sale-peptone (0,85% NaCl + 0,1% peptone). Speciali diluenti possono essere necessari per particolari analisi (soluzioni con basso potenziale redox per la numerazione di germi anaerobi o con concentrazioni del 15-20% di NaCl o saccarosio per l analisi di alimenti con bassa a w). Metodo di omogeneizzazione del campione. Per la preparazione dell omogenato, la sospensione dell alimento deve essere omogeneizzata per favorire il passaggio dei microrganismi nel diluente. L omogeneizzazione deve avvenire in maniera tale da evitare il danneggiamento delle cellule microbiche. A tale scopo si utilizza un omogeneizzatore peristaltico a pale (Stomacher) che massaggia il campione facilitando la liberazione dei microrganismi dall alimento. Il tempo di omogeneizzazione va standardizzato in funzione della natura del campione alimentare. In genere tempi di 1-2 minuti sono ritenuti sufficienti per liberare i microrganismi dalla matrice alimentare senza loro danneggiamento. Procedura di preparazione del campione per l analisi Iniziare le operazioni il più presto possibile dopo il prelievo del campione. I campioni liquidi vanno miscelati invertendo più volte il contenitore prima di essere prelevati con una pipetta sterile ed eventualmente diluiti; i campioni solidi vanno pesati e omogeneizzati con un adatto diluente. I campioni congelati vanno fatti 17

19 scongelare nel loro contenitore di origine mantenendoli per circa 18 ore in frigorifero alla temperatura di +2/+5 C. Conservare in condizioni refrigerate la parte in eccesso del campione avanzata dall analisi per eventuali ulteriori indagini. Le fasi delle operazioni per la preparazione della diluizione madre sono schematizzate nella Figura 3.1. Materiale occorrente Bilancia; Apparecchiatura e sacchetti di plastica sterili per omogeneizzazione; Attrezzi per la manipolazione del campione: coltelli, forbici, spatole, cucchiai, pinze, cilindri graduati, pipette, ecc. sterili; Diluente sterile. Procedura FASE OPERAZIONE Esempio 1 2 a) Campione solido: pesare esattamente una data quantità (n) di campione alimentare (da 10 a 25 g) in un sacchetto di plastica sterile per omogeneizzazione. b) Campione liquido: misurare in un cilindro sterile o prelevare con una pipetta sterile una data quantità (n) di campione (da 10 a 25 ml), trasferendola in una bottiglia vuota sterile. Aggiungere un adatto diluente in quantità nove volte superiore alla quantità di alimento (9xn). 3 Omogeneizzare. Pesare con una bilancia 9 g di alimento in una busta sterile per stomacher. Prelevare, con una pipetta sterile, 9 ml di liquido e trasferirli in una bottiglia sterile con tappo a vite della capacità di 250 ml. Aggiungere 81 ml di diluente (ringer, peptone-sale o soluzione fisiologica). a) per 1 o 2 minuti in stomacher. b) per 1 o 2 minuti manualmente. In questo modo è stata realizzata una diluizione 1/10 (o 10-1 ) del campione. Tale diluizione è detta anche diluizione madre. Prima di utilizzare tale diluizione per la preparazione delle diluizioni decimali successive, lasciare a riposo per un massimo di 15 minuti a temperatura ambiente per rivivificare i microrganismi. Tempi maggiori sono da evitare, soprattutto se si utilizza come diluente la soluzione peptone-sale, in quanto i microrganismi presenti possono incominciare a moltiplicarsi. Alimento (solido o liquido) n g o ml di alimento 9xn diluente Omogeneizzare per 1 min diluizione 1:10 Figura Schema delle operazioni per la preparazione della diluizione madre 18

20 Preparazione delle diluizioni decimali seriali In microbiologia quantitativa si mira a determinare il numero di microrganismi o, più precisamente, il numero di Unità Formanti Colonie (UFC) per ml o g in un determinato campione. Il numero di microrganismi presenti in un dato campione alimentare, in genere, è così alto da non poter essere contato se non dopo essere stato sottoposto a diluizioni seriali. Consideriamo i seguenti esempi. ESEMPIO 1: se noi seminiamo su un adatto terreno nutritivo 1 ml di latte e troviamo, dopo incubazione delle piastre, che si sono sviluppate 15 colonie, siamo in grado di concludere che il campione di latte conteneva 15 UFC/ml. Più realisticamente, la concentrazione di microrganismi in un campione di latte è considerevolmente più elevata, per cui il conteggio delle colonie su una piastra inoculata con 1 ml del campione potrebbe risultare impossibile. ESEMPIO 2: supponiamo che il nostro campione di latte presenti una concentrazione di microrganismi pari a UFC/ml. In questo caso ci aspettiamo di avere una piastra con colonie contabili (100 UFC/ml) solo seminando 0,001 ml di latte. Come appare evidente questa procedura è poco praticabile, soprattutto per la difficoltà, con gli attrezzi disponibili, di trasferire in piastra inoculi così piccoli; inoltre, inoculi così piccoli rendono il campione poco rappresentativo. La stessa procedura è resa praticabile applicando la tecnica delle diluizioni seriali. Infatti, facendo delle diluizioni decimali seriali del campione di latte (ad es. 1 ml di campione in 9 ml di diluente sterile, 1 ml di questa diluizione in altri 9 ml di diluente sterile e, ancora, 1 ml di quest ultima diluizione in altri 9 ml di diluente sterile), operiamo una diluizione del numero di microrganismi inizialmente presenti in esso, realizzando così una procedura equivalente a quella descritta precedentemente nell esempio 2, in cui 0,001 ml di latte sono corrispondenti a 1 ml della diluizione 1:1000. In definitiva, allestendo delle diluizioni decimali (1:10) seriali di un campione, operiamo una diluizione del numero di microrganismi inizialmente presenti in esso. Il numero di diluizioni da realizzare è determinato dai criteri adottati per accertare se un campione risulta accettabile oppure si basa su precedenti esperienze di analisi condotte su prodotti simili considerando la natura del campione, il tipo di processo tecnologico cui è stato sottoposto, le condizioni in cui viene conservato, ecc. Nella realtà, noi non conosciamo mai l esatto numero di microrganismi presenti in un grammo o ml di campione. Al momento dell analisi dobbiamo dunque decidere quante volte diluire il campione per fare in modo che le piastre petri, contenenti l adatto terreno nutritivo, una volta seminate con aliquote delle diluizioni del campione possano contenere, dopo incubazione in adatte condizioni (tempo, temperatura e atmosfera) un numero di colonie facilmente contabili (considerando che il diametro standard di una piastra petri è di 90 mm, al massimo colonie si svilupperanno separatamente per essere contate). Dunque, la domanda che ci si pone è: quante diluizioni realizzare? Il numero di diluizioni da realizzare può scaturire da una serie di considerazioni: a) può essere dettato dai criteri microbiologici da soddisfare per accertare se un campione risulta accettabile: se ad esempio è stabilito che in una unità campionaria il numero di UFC/g o ml non deve superare 100, allora è sufficiente diluire una sola volta il campione nel caso sia solido ovvero usare 1 ml del campione indiluito nel caso esso sia liquido, per accertare se il criterio è soddisfatto. Infatti, se il campione contiene meno di 100 cellule per g o ml, dopo la semina in piastra della diluizione 10-1 siamo in 19

21 grado di contare l esatto numero di colonie presenti; qualora il numero di cellule fosse maggiore di 100, seminando 1 ml della prima diluizione o del campione liquido indiluito, siamo allo stesso modo in grado di soddisfare il criterio, in quanto ci basta conoscere solo se il campione supera il limite prefissato, non essendo necessario conoscere di quanto questo limite è superato. b) può essere dettato da precedenti esperienze di analisi condotte su prodotti simili considerando la natura del campione, il tipo di processo tecnologico cui è stato sottoposto, le condizioni in cui viene conservato, ecc. c) quando non si hanno notizie sufficienti sul campione per poter prevedere il numero potenziale di microrganismi in esso contenuto, allora è necessario diluire il campione almeno fino alla , considerando che 1 ml o 1 g di alimento contiene in genere non più di microrganismi. E evidente che in questo caso l analisi diventa molto dispendiosa sia in termini di tempo che di denaro. ESEMPIO 3: Diluiamo 1:10 serialmente, fino alla diluizione 1: (10-6 ), una sospensione microbica che contiene 1x10 6 microrganismi per ml. Diluizione 1:10 (10-1 ): ottenuta trasferendo 1 ml del campione iniziale in 9 ml di diluente sterile. 1 ml di tale diluizione conterrà 0,1 ml di campione e 10 5 microrganismi; Diluizione 1:100 (10-2 ): ottenuta trasferendo 1 ml della diluizione precedente in 9 ml di diluente sterile. 1 ml di tale diluizione conterrà 0,01 ml di campione e 10 4 microrganismi; Diluizione 1:1.000 (10-3 ): ottenuta trasferendo 1 ml della diluizione precedente in 9 ml di diluente sterile. 1 ml di tale diluizione conterrà 0,001 ml di campione e 10 3 microrganismi; Diluizione 1: (10-4 ): ottenuta trasferendo 1 ml della diluizione precedente in 9 ml di diluente sterile. 1 ml di tale diluizione conterrà 0,0001 ml di campione e 10 2 microrganismi; Diluizione 1: (10-5 ): ottenuta trasferendo 1 ml della diluizione precedente in 9 ml di diluente sterile. 1 ml di tale diluizione conterrà 0,00001 ml di campione e 10 1 microrganismi; Diluizione 1: (10-6 ): ottenuta trasferendo 1 ml della diluizione precedente in 9 ml di diluente sterile. 1 ml di tale diluizione conterrà 0, ml di campione e 10 0 microrganismi. Procedura di preparazione delle diluizioni decimali seriali Il diluente utilizzato deve avere una temperatura prossima a quella del campione, per evitare danni termici ai microrganismi. La prima diluizione può essere lasciata a riposo, per favorire la decantazione di particelle grossolane e la dispersione di microrganismi nel diluente. In ogni modo l intervallo di tempo tra la preparazione della prima diluizione e quelle successive non dovrebbe mai superare i 15 minuti mentre la semina in piastra delle diluizioni preparate deve avvenire al massimo entro minuti dalla preparazione della diluizione iniziale. Utilizzare sempre una nuova pipetta per ogni diluizione da realizzare. Le fasi delle operazioni per la preparazione delle diluizioni decimali seriali sono schematizzate nella Figura 3.2. Materiale occorrente - Pipette sterili da 1 e ml; - Tubi contenenti 9 ml di diluente sterile. 20

22 Procedura Prelevare, con una pipetta sterile, 1 ml della prima diluizione (1:10) e trasferirlo in 9 ml di diluente sterile evitando il contatto tra la pipetta e il diluente; in tal modo si realizza una diluizione 1/100 (10-2 ) del campione. Omogeneizzare con cura mediante agitatore automatico per 5-10 min ed eventualmente ripetere le operazioni per ottenere diluizioni decimali successive (10-3, 10-4 etc.). 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml Diluizioni seriali Figura Schema delle operazioni per la preparazione delle diluizioni decimali seriali Tecniche di semina delle piastre Una volta preparate le diluizioni decimali seriali del campione (e dunque dei microrganismi in esso presenti) è necessario trasferire loro aliquote sul o nell adatto terreno nutritivo. Tali aliquote in genere sono di 1 ml o di 0,1 ml in funzione del metodo di inoculo utilizzato. L obiettivo è di inoculare in piastra, con le aliquote delle diluizioni scalari, un numero sempre minore di microrganismi, in maniera tale che almeno 1 o 2 piastre abbiano, dopo incubazione in condizioni ottimali, colonie ben isolate, in numero compreso tra 30 e 300, in maniera da essere agevolmente contate. Esistono due tecniche principali di piastramento (semina delle piastre con aliquote delle diluizioni del campione): a)tecnica per inclusione dell inoculo in substrato solidificabile (Tecnica Pour Plate ) Questa tecnica prevede l uso di agar a temperatura di 45 C che potrebbe danneggiare le cellule di alcuni microrganismi; inoltre, la crescita delle colonie avviene sia in superficie che in profondità. Le colonie inglobate nella matrice del substrato, in alcuni casi, possono essere difficili da numerare, soprattutto alle diluizioni più basse dove si possono confondere con le particelle del campione alimentare. Le fasi delle operazioni necessarie sono schematizzate nella Figura

23 Procedura di semina per inclusione dell inoculo in terreno solidificabile Materiale occorrente Diluizioni decimali seriali del campione; Pipette sterili da 1 ml; Substrato nutritivo sterile e mantenuto fuso a 45 C; Piastre Petri sterili; Procedura In una piastra petri sterile vuota, si versa 1 ml della diluizione del campione da analizzare (inoculo) quindi si aggiunge il substrato agarizzato (12-15 ml) mantenuto in fusione a C. Dopo l aggiunta del substrato, si rotea delicatamente la piastra, in modo da descrivere un 8 per circa 30 sec., al fine di miscelare l inoculo (i microrganismi) con il substrato. Dopo solidificazione del substrato, le piastre vengono incubate capovolte (per evitare che l accumulo di eventuale vapore condensato sotto il coperchio possa ricadere sulla superficie dell agar disturbando lo sviluppo delle colonie e dunque il conteggio) in termostato all adatta temperatura ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml aggiunta substrato Figura Schema delle operazioni di semina per inclusione. b) Tecnica di semina per distribuzione (spatolamento) superficiale dell inoculo su substrato solido (Tecnica Spread plate ). La crescita delle colonie avviene in superficie, facilitando la loro numerazione. Procedura di semina per distribuzione superficiale dell inoculo su terreno solido Materiale occorrente Diluizioni decimali seriali del campione; 22

24 Pipette sterili da 0,1 ml; Piastre Petri contenenti il substrato nutritivo solidificato; Procedura Le piastre contenenti l adatto substrato nutritivo solidificato (circa 15 ml per piastra) sono preparate prima dell operazione di inoculo. Le piastre una volta preparate possono essere conservate a 4 C anche per una settimana prima dell uso. L inoculo, costituito da aliquote da 0,1 ml delle diluizioni seriali, è depositato con una pipetta sulla superficie dell agar e distribuito su di essa con una bacchettina di vetro sterile a forma di L. Si lascia adsorbire l inoculo per circa 5 min, quindi le piastre sono trasferite capovolte in termostato. Lo schema delle operazioni di semina per spatolamento superficiale è simile a quello per la semina per inclusione. La differenza sostanziale risiede nel fatto che si fa uso di piastre contenenti il substrato già pronto, che vengono inoculate con volumi di 0,1 ml di ciascuna diluizione. Inoculando ogni piastra con 0,1 ml di ciascuna diluizione e quindi con 1/10 del numero di UFC che sono presenti in 1 ml di inoculo, è necessario moltiplicare il n di UFC/g o ml determinato per un fattore 10. Lo stesso risultato si ottiene etichettando le piastre con la diluizione virtuale piastrata. Ad esempio, una piastra inoculata con 0,1 ml di una diluizione 10-1 è equivalente ad una piastra inoculata con 1 ml della diluizione Dunque scriveremo: 10-2 sulla piastra che inoculiamo con 0,1 ml della diluizione 10-1 ; 10-3 sulla piastra che inoculiamo con 0,1 ml della diluizione 10-2 ; e così via. ESEMPIO: supponiamo di inoculare una piastra con 0,1 ml della diluizione 10-2 di un alimento solido. Dopo incubazione contiamo sulla piastra 100 UFC. Siccome piastrare 0,1 ml di una diluizione 10-2 equivale a piastrare 1 ml della diluizione 10-3, il nostro campione conteneva 100x 10 3 UFC/g Per entrambe le tecniche di semina, al fine di ottenere conteggi più accurati, è consigliabile inoculare almeno due piastre con ciascuna diluizione, facendo la media del numero di colonie ottenute sulle due piastre Condizioni di incubazione delle piastre Le piastre una volta inoculate con una delle tecniche descritte precedentemente, devono essere incubate in termostato a temperature, tempi e atmosfera gassosa che dipendono dal tipo di popolazioni microbiche che si vuole numerare. Tali condizioni saranno discusse nella presentazione delle tecniche di numerazioni di microrganismi o popolazioni microbiche specifiche Numerazione delle colonie in piastra Al termine dell incubazione delle piastre, se l inoculo è stato distribuito omogeneamente nel substrato, teoricamente ogni cellula presente nel campione iniziale ha dato origine, in seguito a moltiplicazione, ad una colonia singola visibile ad occhio nudo. Per il conteggio delle colonie si selezionano solo le piastre che sono contabili, cioè quelle che presentano un numero di colonie comprese tra 30 e 300. Tale intervallo é scelto perché considerato statisticamente significativo. Quando su una piastra ci sono meno di 30 colonie, anche piccoli errori nella tecnica di diluizione del campione o la presenza di poche cellule di contaminati 23

25 (derivanti, ad esempio, da contaminazioni durante le operazioni di conteggio) potrebbero avere effetti significativi sul conteggio finale. Invece, una piastra con un numero di colonie superiore a 300 potrebbe risultare difficile da contare. Infatti, quando sul substrato sono deposte con l inoculo molte cellule, queste tenderanno a svilupparsi in maniera confluente, dando origine a colonie non isolate a sufficienza per essere contate. Per il conteggio, il numero di colonie contato su una piastra viene moltiplicato per il numero di volte in cui è stato diluito il campione iniziale. Ad esempio, se due piastre che sono state inoculate ciascuna con 1 ml della diluizione 1:1000 del campione iniziale presentano mediamente 50 colonie, allora 50 rappresenta 1/1000 del numero di colonie presenti in 1 g o 1 ml del campione iniziale. Dunque, il numero di colonie per g o ml del campione sarà calcolato moltiplicando 50x1000 (1000 rappresenta il fattore della diluizione 1/1000, che, si ricorda, rappresenta l inverso della diluizione. Vedi APPENDICE D), come mostrato nella seguente formula: N (Numero di colonie)/ g o ml = n (N di colonie nelle piastre considerate) / p (N di piastre considerate) V (Volume dell inoculo in ml) x d (diluizione considerata) (50+50)/2 N (UFC)/g o ml= = 50x10 3 = 5x x 10-3 Che cos è una Unita Formante Colonia (UFC)? Se l inoculo è distribuito omogeneamente nel substrato, teoricamente ogni cellula presente nel campione iniziale dovrebbe dare origine, in seguito a moltiplicazione, ad una colonia singola visibile ad occhio nudo. In realtà, cellule aggregate in coppia, in catene o in ammassi, quando sono depositate sul substrato si moltiplicheranno dando origine ad una singola colonia. Per tale motivo è più corretto esprimere il risultato di un conteggio microbico come numero di Unità (cellula/e) in grado di formare una colonia singola (Unità Formanti Colonie: UFC/g o ml) piuttosto che come cellule/g o ml Considerazioni sui limiti di rilevamento del numero di microrganismi con la tecnica di conteggio in piastra Campione alimentare solido. Il numero minimo di microrganismi teoricamente rilevabili nel caso dell analisi microbiologica di un campione alimentare solido è pari a: 10 UFC/g con la tecnica per inclusione; 100 UFC/g con la tecnica di inoculo superficiale. Tali limiti risultano ovvi se si fa riferimento alla quantità massima di campione alimentare analizzabile con le due tecniche. Infatti, con la tecnica Pour plate la quantità massima di alimento analizzato è pari a 0,1 g (la diluizione più bassa piastrabile è la 10-1 che contiene 0,1 g/ml) e quindi se l alimento contiene meno di 10 cellule queste, per effetto della diluizione del campione non possono essere rilevate. Per lo stesso motivo, se il campione alimentare presenta in partenza almeno 10 cellule, l unica cellula teoricamente presente nella prima diluizione del campione (1/10), una volta che essa è deposta nel substrato nutritivo, darà origine, dopo crescita alla temperatura ottimale di incubazione ad una colonia visibile e quindi contabile. Tenendo conto della diluizione, il numero di UFC/g sarà pari a 10 (1/10-1 =10). 24

26 Utilizzando per il conteggio la tecnica spread plate, la quantità massima di alimento analizzato è pari a 0,01 g (contenuti in 0,1 ml della diluizione 10-1 piastrata) e quindi, utilizzando le stesse assunzioni fatte in precedenza, il numero minimo di cellule rilevabili sarà pari a 100 UFC (1/10-2 = 100). Campione alimentare liquido. Il numero minimo di microrganismi teoricamente rilevabile nel caso dell analisi microbiologica di un campione alimentare liquido è pari a: 1 UFC/ml con la tecnica dell inclusione; 10 UFC/ml con la tecnica dell inoculo superficiale. Infatti con le due tecniche di conteggio, pour plate e spread plate la quantità massima di campione analizzata è pari a 1 ml e a 0,1 ml rispettivamente. Come appare ovvio, il numero minimo di microrganismi rilevabile mediante conteggio in substrato solido, sia con la tecnica pour plate sia con la tecnica per inclusione può essere elevato, se necessario, di un fattore 10, variando i volumi di inoculo. Di seguito sono riportati alcuni esempi. Campione solido: Tecnica pour - seminare 1 ml della diluizione 10-1 in ciascuna di 10 piastre. Complessivamente la quantità di campione analizzata sarà pari ad 1 g, per cui numerando tutti i microrganismi che si sviluppano nelle 10 piastre, il numero minimo teoricamente rilevabile di microrganismi sarà pari ad 1 UFC/g. (In ogni modo l operazione va fatta in doppio, cioè su 20 piastre). Tecnica spread - seminare 0,5 ml della diluizione 10-1 su ciascuna di due piastre (complessivamente 0,1 g di campione inoculato nelle due piastre, con limite pari a 10 UFC/g) o su ciascuna di 20 piastre (complessivamente 1 g di campione inoculato nelle 20 piastre, con limite pari a 1 UFC/g). L operazione va effettuata in doppio (4 o 40 piastre rispettivamente). Campione liquido: Tecnica spread - seminare 0,5 ml di campione non diluito su ciascuna di due piastre (complessivamente 1 ml di campione inoculato nelle due piastre con limite di rilevamento pari a 1UFC/ml) Conteggio dei microrganismi in substrato liquido: tecnica di stima del numero più probabile di microrganismi (MPN, Most Probable Number) La tecnica di conteggio MPN o tecnica di conteggio con tubi multipli, è una procedura di conteggio utilizzata per stimare la densità di una popolazione di microrganismi vitali in un dato campione. Si tratta di un metodo statistico basato sulla probabilità di rilevare sviluppo microbico dopo coltura in tubi multipli di substrato liquido di diluizioni seriali del campione. Lo sviluppo microbico dopo incubazione dei brodi inoculati può essere valutato osservando eventuale intorbidamento della coltura oppure valutando particolari attività metaboliche del microrganismo o della popolazione microbica da numerare (produzione di gas, di acidi ecc.). La tecnica è utilizzata in associazione con una tavola statistica che fornisce il valore del numero più probabile di microrganismi per varie combinazioni di tubi positivi. Il campione dovrebbe essere diluito in maniera tale che le diluizioni più spinte non presentino microrganismi ( diluizione all estinzione ). I migliori risultati si hanno quando tutti i tubi inoculati con le diluizioni più basse risultano positivi e tutti i tubi inoculati con le diluizioni più alte risultano negativi. 25

27 Basi teoriche Prepariamo una serie di diluizioni decimali di un campione di acqua e inoculiamo 1 ml di ciascuna diluizione in un tubo contenente un appropriato substrato nutritivo, come riportato nella Figura 3.4: 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 1 ml ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Figura Schema di inoculo di tubi contenenti terreno nutritivo liquido Teoricamente, se fosse presente almeno una cellula in ogni uno degli inoculi si dovrebbe osservare crescita visibile nel substrato corrispondente inoculato; quindi, nell esempio, se il brodo inoculato con la diluizione 10-4 mostra crescita mentre il brodo inoculato con la diluizione 10-5 non mostra crescita possiamo dedurre che il campione presentava più di 1x10-4 organismi per ml ma meno di 1x10-5 per ml. Ad esempio, se un campione di 10 ml di acqua contiene in totale 200 organismi non sempre aliquote di 1 ml conterranno 20 organismi; alcune ne conterranno di più altre di meno, sebbene la media degli organismi presenti in tutte e 10 le aliquote dell intero campione di 10 ml sarà di 20. Per aumentare l accuratezza statistica dell MPN è necessario inoculare con ciascuna diluizione del campione più tubi di brodo nutritivo. Le procedure standard per la determinazione dell MPN usano un minimo di 3 diluizioni e 3, 5 o 10 tubi di brodo inoculati con ciascuna diluizione La variabilità statistica della distribuzione batterica é meglio stimata al crescere dei tubi inoculati o che sono praticamente inoculabili con ogni diluizione. Come già accennato la stima del MPN/ml o g di campione é letta su apposite tavole MPN in base al 26

28 numero di tubi positivi per ciascuna serie inoculata con una data diluizione. Esistono tavole MPN per inoculi di 3, 5 e 10 tubi. Una prima tavola statistica per la determinazione del MPN fu proposta da Mc Crady nel 1915 (Tabella 6.2). Una versione più recente delle tabelle MPN è stata proposta da de Man nel 1983 (Tabelle 6.3, 6.4, 6.5, 6.6). In queste tavole, oltre al numero più probabile di microrganismi é riportato l intervallo, con il valore massimo e minimo, entro il quale cade il 95% degli altri valori possibili per una specifica combinazione di risultati. Procedura di determinazione del MPN Materiale occorrente Bilancia; Apparecchiatura e sacchetti sterili per omogeneizzazione; Attrezzi per la manipolazione del campione: coltelli, forbici, spatole, cucchiai, pinze, cilindri graduati, ecc. sterili; Diluente sterile; Pipette da 10, 1 e 0,1 ml; Tubi contenenti l adatto substrato nutritivo liquido; Procedura Preparare la diluizione madre e le diluizioni seriali decimali del campione (Vedi i paragrafi e 3.1.2) Seminare 1 ml di ciascuna diluizione in 3, 5 o 10 tubi contenenti il substrato nutritivo; Annotare il numero di tubi positivi per ciascuna diluizione; Ricavare il MPN dalle apposite tavole. Per la lettura del MPN con le tavole di Mc Crady (tabella 3.1) si procede come segue: si annota per ciascuna diluizione il numero di provette positive (torbidità o produzione di un particolare metabolita che indica l avvenuta crescita microbica), quindi si calcola il numero caratteristico che è costituito da 3 cifre, la prima delle quali è data dal numero di tubi che alla diluizione più spinta (detta anche diluizione limite) presentino la più elevata positività, la seconda e la terza cifra rappresentano, rispettivamente, il numero di tubi positivi nelle due successive diluizioni. Sulle tavole, in corrispondenza del numero caratteristico determinato, si legge il MPN che moltiplicato per il reciproco della prima diluizione considerata (diluizione limite) indicherà il numero più probabile di microrganismi per g o ml di campione. La lettura del MPN con le tavole riportate nelle tabelle 3.2, 3.3, 3.4 e 3.5, avviene leggendo, per ogni schema di inoculo (quantità in g o ml inoculati in ciascun tubo), direttamente in corrispondenza della combinazione dei risultati (numero di tubi positivi ). 27

29 Tabella Tavola di Mc Crady per la determinazione del MPN (3 tubi per diluizione) Numero caratteristico MPN/ g o ml Numero caratteristico MPN/g o ml

30 Tabella Indice MPN (3 tubi per diluizioni, per inoculi di 10; 1 e 0,1 g o ml) Combinazione tubi positivi ,1g Indice MPN per g o ml Limiti di confidenza (95%) Inferiore Superiore ,000 0,000 0, ,030 0,002 0, ,031 0,002 0, ,061 0,012 0, ,062 0,012 0, ,036 0,002 0, ,072 0,013 0, ,074 0,013 0, ,112 0,036 0, ,114 0,036 0, ,154 0,045 0, ,092 0,014 0, ,143 0,036 0, ,147 0,037 0, ,205 0,045 0, ,211 0,045 0, ,276 0,087 0, ,348 0,087 0, ,286 0,087 0, ,360 0,087 0, ,231 0,046 0, ,385 0,087 1, ,636 0,168 1, ,427 0,090 1, ,749 0,169 2, ,150 0,370 4, ,933 0,181 4, ,490 0,370 4, ,150 0,400 4, ,400 0,420 10, ,620 0,900 20, ,000 1,800 41, >11,000 4,250-29

31 Tabella Indice MPN (3 tubi per diluizioni, per inoculi di 1; 0,1 e 0,01 g o ml) Limiti di confidenza (95%) Combinazione tubi positivi Indice MPN per g o ml Inferiore Superiore 1-0,1-0,01g ,00 0,00 0, ,30 0,02 0, ,31 0,02 1, ,61 0,12 1, ,62 0,12 1, ,36 0,02 1, ,72 0,13 1, ,74 0,13 2, ,12 0,36 3, ,14 0,36 4, ,54 0,45 4, ,92 0,14 3, ,43 0,36 4, ,47 0,37 4, ,05 0,45 4, ,11 0,45 4, ,76 0,87 9, ,48 0,87 9, ,86 0,87 9, ,60 0,87 9, ,31 0,46 9, ,85 0,87 10, ,36 1,68 18, ,27 0,90 18, ,49 1,69 20, ,50 3,70 42, ,33 1,81 42, ,90 3,70 42, ,50 4,00 42, ,00 4,20 100, ,20 9,00 200, ,00 18,00 410, >110,00 42,50-30

32 Tabella Indice MPN (3 tubi per diluizioni, per inoculi di 0,1; 0,01 e 0,001 g o ml) Combinazione tubi positivi 0,1 0,01-0,001g Limiti di confidenza (95%) Indice MPN per g o ml Inferiore Superiore ,0 0,0 9, ,0 0,2 9, ,1 0,2 10, ,1 1,2 18, ,2 1,2 18, ,6 0,2 18, ,2 1,3 18, ,4 1,3 20, ,2 3,6 38, ,4 3,6 42, ,4 4,5 42, ,2 1,4 37, ,3 3,6 42, ,7 3,7 42, ,5 4,5 42, ,1 4,5 42, ,6 8,7 94, ,8 8,7 94, ,6 8,7 94, ,0 8,7 94, ,1 4,6 94, ,5 8,7 105, ,6 16,8 183, ,7 9,0 183, ,9 16,9 200, ,0 37,0 425, ,3 18,1 425, ,0 37,0 425, ,0 40,0 427, ,0 42,0 1000, ,0 90,0 2000, ,0 180,0 4100, >1100,0 425,0-31

33 Tabella Indice MPN (3 tubi per diluizioni, per inoculi di 0,01; 0,001 e 0,0001 g o ml) Limiti di confidenza (95%) Combinazione tubi positivi Indice MPN per g o ml 0,01-0,001-0,0001 g Inferiore Superiore ,0 0,0 95, ,0 2,0 96, ,0 2,0 107, ,0 12,0 181, ,0 12,0 181, ,0 2,0 181, ,0 13,0 182, ,0 13,0 203, ,0 36,0 380, ,0 36,0 420, ,0 45,0 420, ,0 14,0 375, ,0 36,0 420, ,0 37,0 420, ,0 45,0 420, ,0 45,0 425, ,0 87,0 945, ,0 87,0 945, ,0 87,0 945, ,0 87,0 945, ,0 46,0 945, ,0 87,0 1050, ,0 168,0 1830, ,0 90,0 1830, ,0 169,0 2000, ,0 370,0 4250, ,0 181,0 4250, ,0 370,0 4250, ,0 400,0 4270, ,0 420, , ,0 900, , ,0 1800, , >11000,0 4250,0-32

34 Alcuni esempi di lettura del MPN sono riportati nella Tabella 3.6. Tabella Esempi di lettura di conteggi microbici eseguiti con la tecnica del MPN ESEMPIO 1 (1/1) quantità di campione (g o ml) e (diluizione) 0,1 (1/10) 0,01 (1/100) 0,001 (1/1000) 0,0001 (1/10000) Combinazione tubi positivi o numero caratteristico MPN g o ml a 3/3 2/2 0/3 0/3 0/ ,33 b 3/3 3/3 2/3 0/3 0/ ,3 c 3/3 3/3 3/3 2/3 0/ d 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 333 >11000 e 3/3 3/3 2/3 1/3 1/

35 4 Presupposti teorici sui metodi di ricerca e numerazione di batteri patogeni trasmessi con gli alimenti Gli alimenti possono essere veicoli di microrganismi patogeni in grado di compromettere la salute umana. L analisi microbiologica mirata alla ricerca e/o alla numerazione di specifici microrganismi patogeni negli alimenti fa ricorso all impiego di substrati nutritivi selettivi e differenziali che favoriscono elettivamente la crescita dello specifico organismo, facilitando al tempo stesso il suo isolamento dalla restante popolazione microbica che inevitabilmente contamina l alimento Principi di microbiologia selettiva e differenziale Spesso nasce l esigenza di isolare (separare) specifici microrganismi o gruppi di microrganismi dalla complessa microflora che popola un campione alimentare. Specifici microrganismi o gruppi di microrganismi possono essere isolati dal loro habitat naturale creando in laboratorio condizioni ambientali artificiali che migliorano la loro crescita rispetto agli altri microrganismi competitori. La creazione di condizioni favorevoli ad un solo organismo o gruppo di organismi è noto come arricchimento. L obiettivo è quello di soddisfare da un lato le esigenze nutrizionali dell organismo desiderato e dall altro quello di inibire quanti più organismi indesiderati in maniera che essi non interferiscano con l organismo da isolare. Sfruttando alcune caratteristiche morfologiche e fisiologiche particolari dell organismo da isolare è possibile: - formulare substrati nutritivi (liquidi e solidi) che migliorano la sua crescita; - selezionare condizioni di incubazione ad esso favorevoli (temperatura, atmosfera, tempo); - decidere se sottoporre il campione a pretrattamenti che facilitino il suo isolamento selettivo (ad esempio trattando termicamente il campione per isolare solo le forme sporigene). Quando l arricchimento è formulato in maniera da inibire lo sviluppo di microrganismi competitori si parla di arricchimento selettivo. Un arricchimento in brodo selettivo aumenta la probabilità che le colonie dell organismo desiderato potranno essere isolate nel successivo passaggio di striscio su substrato solido in piastre. In genere i brodi di arricchimento hanno una composizione molto simile ai substrati solidi usati per il successivo isolamento selettivo. I selettivi usati sono, in genere, antibiotici, coloranti (come verde brillante, cristalvioletto eec.) e tensioattivi (ad esempio i sali biliari) a cui il microrganismo da isolare è resistente. E possibile formulare anche substrati nutritivi agarizzati, contenenti sostanze selettive (substrati selettivi solidi) che favoriscono lo sviluppo di un gruppo di microrganismi ostacolandone quello di altri. 34

36 In genere, ai substrati selettivi solidi, vengono aggiunte particolari sostanze chimiche che portano ad una modificazione del substrato come conseguenza di una particolare attività metabolica del microrganismo da isolare. Tali substrati sono detti differenziali in quanto consentono di differenziare il microrganismo da isolare da altri che pur crescendo sullo stesso substrato selettivo non presentano quella particolare attività metabolica. La maggior parte dei substrati differenziali sfruttano la capacità del microrganismo di fermentare un particolare carboidrato (variazioni di ph) o di produrre particolari metaboliti che rendono caratteristica la colonia da isolare Fasi per la ricerca di specifici patogeni negli alimenti Le strategie applicate più comunemente per l analisi qualitativa dei patogeni negli alimenti, seguono lo schema riportato nella Figura 4.1. Alcune considerazioni sulle varie fasi sono riportate di seguito Resuscitazione o prearricchimento non selettivo. In alimenti processati (trattamenti termici, essiccazione, irradiazione, refrigerazione, congelamento, ecc.) le cellule microbiche presenti possono subire danneggiamenti come conseguenza del trattamento, che pur non uccidendole, non consente loro di moltiplicarsi; in questo caso si parla di cellule danneggiate subletalmente. Tali cellule possono mostrare danni fisici alle strutture cellulari, con conseguente fuoriuscita del contenuto cellulare o danni a livello di alcune attività metaboliche. Le cellule danneggiate subletalmente non sono in grado di moltiplicarsi fintantoché il danno non é riparato. Pertanto, un tentativo per il loro isolamento in o su un substrato selettivo potrebbe risultare in un insuccesso, in quanto le stesse sostanze selettive (a cui il microrganismo con cellule non danneggiate risulta resistente) potrebbero essere causa della loro morte. Il danno cellulare può essere riparato dal microrganismo anche nello stesso alimento processato se le condizioni nutritive e di conservazione dell alimento sono tali da favorire la sua moltiplicazione. Questa condizione può avere importanti implicazioni nell analisi microbiologica di un alimento. Infatti i risultati analitici potranno essere non attendibili con una sottostima del numero di patogeni, o addirittura condurre a falsi negativi, come conseguenza del mancato rilevamento del microrganismo danneggiato. Queste situazioni si superano se l analisi microbiologica di alimenti fortemente processati viene fatta precedere da una fase di resuscitazione o prearricchimento (Figura 4.2) in un substrato o in condizioni colturali che consentono la riparazione delle cellule danneggiate. Nell analisi qualitativa, per recuperare cellule danneggiate subletalmente, si omogeneizza il campione in un substrato liquido nutrizionalmente completo e complesso, che dopo incubazione per tempi e temperature ottimali per il microrganismo, viene trasferito in un substrato liquido selettivo. 35

37 Omogeneizzazione del campione (in genere 25 g in 225 ml di brodo di prearricchimento o di arricchimento) 1a Resuscitazione (Prearricchimento in substrato liquido non selettivo) Arricchimento in substrato liquido selettivo 1 2a Arricchimento secondario (in substrato liquido selettivo) Piastramento su substrato solido selettivo e differenziale 2 Selezione di colonie tipiche e loro isolamento in coltura pura (substrato solido non selettivo) 3 Conferma dell isolato (identificazione con metodi biochimici, sierologici o molecolari) 4 Incubazione a temperatura e per tempi caratteristici del patogeno da isolare. Le fasi 1a e 2a sono applicate solo per alcuni microrganismi e in particolari procedure analitiche. Figura 4.1 Fasi dell analisi qualitativa per la ricerca di specifici patogeni negli alimenti. 36

38 Nei casi in cui è richiesta la determinazione del numero di un particolare microrganismo in un alimento in cui si presume la presenza di cellule danneggiate subletalmente, la fase di resuscitazione viene in genere applicata nel modo seguente: si seminano aliquote di diluizioni del campione su un adatto substrato solido nutrizionalmente completo e non selettivo, quindi, le piastre sono incubate per tempi sufficienti a recuperare le cellule danneggiate (in genere 3 ore) senza però dare il tempo alle cellule di moltiplicarsi. Infatti, se tale tempo fosse troppo lungo, si avrebbe una supercrescita di altri microrganismi contaminanti l alimento, rendendo difficile l isolamento del microrganismo ricercato nella fase successiva dell analisi. Al termine della fase di recupero, sulle piastre, viene versato uno strato di substrato selettivo (e differenziale) che inibirà la crescita dei microrganismi indesiderati. UFC/ml Microrganismi competitori Microrganismo da arricchire Tempo (h) Figura 4.2 Curve di crescita (teoriche) dei microrganismi nella fase di arricchimento di un campione alimentare in substrato liquido non selettivo (Resuscitazione) Arricchimento selettivo. L obiettivo dell arricchimento selettivo per la ricerca di uno specifico patogeno negli alimenti è quello di favorire il più possibile il suo sviluppo rispetto alla microflora che lo accompagna, che non essendo di nessun interesse per l analisi, si cerca di inibire il più possibile (Figura 4.3). L arricchimento selettivo è una fase obbligatoria quando si ricercano i microrganismi patogeni, in quanto i criteri microbiologici per questi microrganismi prevedono la loro assenza in almeno 25 g di alimento. Questo implica che il metodo di analisi deve essere in grado di rilevare anche una sola cellula del microrganismo in presenza di altri contaminanti. Ciò equivale a dire che l arricchimento selettivo deve assicurare che in un ansata (pochi µl) del substrato prelevata al termine della fase di incubazione contenga almeno 1 UFC del microrganismo. 37

39 UFC/ml Microrganismi competitori Microrganismo da arricchire Figura Curve di crescita (teoriche) dei microrganismi nella fase di arricchimento di un campione alimentare in substrato liquido selettivo. Tempo (h) Piastramento o isolamento su substrato selettivo e differenziale. Quando si parla di isolamento selettivo si fa riferimento allo striscio di aliquote di un brodo di arricchimento di un campione su substrati agarizzati selettivi e differenziali. L obiettivo di questa fase è quella di ottenere colonie isolate del patogeno che potranno essere utilizzate nelle fasi successive dell analisi. Specifici microrganismi danno origine a colonie tipiche su appropriati substrati selettivi e differenziali. Tuttavia, la selettività e la differenzialità di tali substrati non è assoluta. Infatti, è possibile che nell ambito di popolazioni normalmente sensibili agli agenti selettivi utilizzati nel substrato per isolare un dato patogeno, esistano specie o ceppi particolarmente resistenti; inoltre, molto spesso, le caratteristiche metaboliche utilizzate per differenziare il batterio ricercato, sono possedute in ugual misura da altri microrganismi, anche non strettamente correlati tassonomicamente ad esso Conferma dell isolato: introduzione all identificazione dei batteri. Sulla base delle considerazioni fatte in precedenza, una colonia tipica cresciuta su un substrato selettivo e differenziale deve essere considerata solo come presuntivamente appartenente alla specie batterica ricercata. L identità speciografica dell isolato, pertanto, deve essere confermata con ulteriori test. Preliminarmente, si annotano le caratteristiche di crescita della colonia (morfologia, colore, dimensioni, margini) ed eventuali variazioni del substrato selettivo e differenziale di primo isolamento (colore, aloni di chiarificazione, altro). Si procede quindi all isolamento della/e colonia/e su substrato non selettivo al fine di ottenere una coltura pura (popolazioni di cellule derivanti da un unica cellula) del microrganismo da identificare. L isolato in coltura pura sarà sottoposto ai seguenti test preliminari: 38

40 osservazione microscopica per accertare la sua morfologia (cocco, bastoncino, forme aggregate ecc); reazione di Gram (gram positivo o gram negativo); saggio della catalasi (idrolisi dell acqua ossigenata); saggio dell ossidasi; accertamento della mobilità in substrato semi-molle; L isolato va infine identificato a livello di specie mediante l applicazione di metodi biochimici, metodi immunologici e metodi molecolari. I principi sull identificazione dei microrganismi e i metodi specifici per la ricerca di batteri patogeni negli alimenti saranno trattati nei capitoli successivi. 39

41 5 Principi sui metodi di identificazione dei batteri isolati dagli alimenti 5.1 Principi generali Molto spesso, quando si isola un microrganismo da un alimento, con le tecniche descritte nei capitoli precedenti, nasce l esigenza di identificarlo e classificarlo. Identificare un microrganismo significa determinarne il maggior numero di caratteristiche (fenotipiche e genetiche) in maniera da poterlo distinguere da altri microrganismi e classificarlo in gruppi o taxa sulla base di reciproche somiglianze e quindi assegnargli un nome secondo norme ben definite. Identificazione, classificazione e nomenclatura, rappresentano tre aeree della tassonomia, che è appunto una branca delle scienze biologiche che si occupa della classificazione degli organismi in gruppi sulla base delle loro reciproche somiglianze e delle loro relazioni evolutive. Dunque, l identificazione è il processo secondo il quale un isolato microbico è studiato con tecniche di laboratorio per evidenziarne particolari attributi che consentono di collocarlo in gruppi più o meno omogenei. I gruppi in cui sono classificati gli organismi biologici sono, in senso discendente (cioè man mano che si scende da un livello o categoria progressivamente inferiore, gli organismi diventano sempre più simili): Regno, divisione o phylum, classe, ordine, famiglia, genere e specie. Nella tassonomia microbica la specie rappresenta il gruppo tassonomico di base. Una specie batterica è costituita da un insieme di individui (ceppi) che condividono molte caratteristiche distintive comuni, differenziandosi in maniera significativa da altri gruppi di organismi. L ordine tassonomico immediatamente superiore è costituito dal genere che comprende una o più specie con caratteristiche simili. Diversi generi vanno a costituire una famiglia e successivamente, con lo stesso criterio, si individuano gli i gruppi tassonomici di ordine superiore. Nella classificazione binomiale secondo Linneo, una specie batterica è indicata da due nomi latini scritti in corsivo: il primo indica il genere, mentre il secondo indica la specie particolare di quel genere (ad esempio, Escherichia coli, Listeria monocytogenes ecc.). 5.2 Coltura pura Qualsiasi microrganismo che cresce dando origine a colonie visibili su un terreno nutritivo, sia selettivo che non, prima di essere identificato a livello di specie deve essere isolato in coltura pura. Colture pure possono essere ottenute mediante la tecnica dello striscio su piastre contenenti un adatto terreno nutritivo non selettivo. Vicino alla fiamma di un becco bunsen, aprire il coperchio della piastra quel tanto necessario ad inserire l ansa batteriologica per prelevare una colonia isolata da isolare in coltura pura. L obiettivo dello striscio in piastra è di ottenere colonie isolate su una larga parte della superficie del terreno nutritivo in piastra (Figura 5.1). 5.3 Identificazione dei batteri Per l identificazione di un batterio sono impiegate molte caratteristiche che devono essere in grado di garantire una buona variabilità nell ambito delle diverse specie e sub-specie e che allo stesso tempo presentino una buona stabilità all interno dei ceppi. In generale, i metodi di identificazione dei batteri sono distinti in metodi fenotipici e metodi genetici. 40

42 Figura Esempi di piastre strisciate con colture di batteri. Come si può notare colonie dei batteri perfettamente isolate sono presenti nella parte in basso della piastra, dove, per effetto dello striscio sono state deposte meno cellule. Le classiche caratteristiche fenotipiche dei batteri comprendono la morfologia e le caratteristiche fisiologiche e metaboliche (sorgenti di carbonio e azoto; crescita a differenti temperature, valori di ph, concentrazioni di sale, agenti antimicrobici; presenza ed attività di vari enzimi; metabolizzazione di determinate sostanze; resistenza agli antibiotici; temperature di crescita; analisi dei componenti della parete cellulare e delle proteine citoplasmatiche ecc.). I metodi genotipici riguardano lo studio degli acidi nucleici (DNA ed RNA) presenti nella cellula. Alcune delle tecniche genetiche maggiormente utilizzate riguardano: determinazione del contenuto percentuale in guanina e citosina del DNA (mol% G+C); ibridazione DNA-DNA; RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism); PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis); sequenziamento del DNA o dei geni codificanti per l rrna (rdna 16S, 23S, 5S) e tutte le tecniche basate sulla metodologia che fa uso della PCR (Polymerase Chain Reaction) come l amplificazione della regione spaziatrice 16S-23S rdna, la DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), la RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), l ARDRA (Amplified rrna Restriction Analysis), l AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) 5.4 Fasi per l identificazione dei batteri Un elenco di saggi (non certo esaustivo), comprendente le caratteristiche fenotipiche maggiormente utilizzate per l identificazione dei batteri è riportato di seguito: Morfologia, gram-reazione, catalasi, ossidasi, mobilità, presenza di capsule, presenza di spore; Crescita in aerobiosi o anaerobiosi, a differenti ph, temperature e concentrazioni di NaCl, in presenza di bile, di blu di metilene e di altre sostanze; Produzione di CO 2, di H 2, H 2O 2, H 2S, NH3, acetoino etc. etc.; Isomeri ottici dell acido lattico prodotti dalla fermentazione del glucosio; Profili di fermentazione dei carboidrati; Idrolisi dell arginina, dell esculina, dell urea; Altri caratteri particolari quali ad esempio la riduzione del tellurito di potassio, attività lipolitica, attività proteolitica, attività superossidodismutasica, etc. etc. Di seguito descriveremo i metodi e le fasi utilizzate per l identificazione preliminarmente dei batteri Descrizione delle condizioni colturali: substrato di isolamento e presenza di eventuali agenti selettivi, condizioni di incubazione (atmosfera e temperatura), morfologia, colore e aspetto delle colonie. 41

43 5.4.2 Morfologia cellulare mediante osservazione microscopica di un preparato microbico a fresco. - pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti per microscopia; - depositare una goccia di acqua sterile sul vetrino; - prelevare con un ansa da batteriologia sterile parte o una colonia ben isolata del microrganismo; - stemperare il materiale microbico nell'acqua; - coprire con un vetrino copri-oggetto, avendo cura di evitare la formazione di bolle d aria; - osservare al microscopio Le cellule batteriche osservate al microscopio possono presentare diverse forme: cellule sferiche: cocchi; cellule sferiche in coppia: diplococchi; cellule sferiche aggregate in catene: streptococchi; cellule sferiche aggregate a forma di grappolo: stafilococchi; cellule sferiche aggregate in tetradi: micrococchi e sarcine; cellule a forma di bastoncino singolo, in coppia o in catena: batter o bacilli; cellule a forma di bastoncino corto, rigonfio e con margini arrotondati: coocobacili; cellule a forma di bastoncino ricurvo, formanti delle caratteristiche virgole: vibrioni; cellule a forma di bastoncino formanti delle caratteristiche spirali: spirilli; Colorazione di Gram Preparazione delle soluzioni Soluzione di Cristal violetto-ammonio ossalato: soluzione A: cristal violetto 2 g alcool etilico 95% 20 ml soluzione B: ammonio ossalato 0,8 g acqua distillata 80 ml Mescolare le soluzioni A e B, lasciare a riposo per 24 ore a temperatura ambiente, quindi filtrare per carta. Soluzione iodio-iodurata di potassio (liquido di Lugol) iodio 1 g ioduro di potassio 2 g acqua distillata 300 ml Miscelare lo iodio e lo ioduro di potassio in mortaio e sciogliere aggiungendo l'acqua poco alla volta; versare in bottiglia scura per reagenti e lavare il mortaio con una quantità di acqua necessaria a portare il volume a 300 ml. Miscela Alcool-acetone alcool 7 parti acetone 3 parti Soluzione di Safranina safranina O 2,5 g alcool etilico 95% 100 ml Prima dell uso aggiungere 10 ml di questa soluzione a 90 ml di acqua distillata. Esecuzione del saggio - pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti; - porre una goccia di acqua sterile sul vetrino; - stemperare il materiale microbico nell'acqua; - lasciare asciugare il preparato microbico all aria; - fissare il preparato tagliando tre volte la fiamma; - colorare per 1 minuto con cristal violetto-ammonio ossalato; 42

44 - lavare con acqua; - trattare per 1 minuto con Lugol; - lavare con acqua; - decolorare con alcool-acetone per 30 secondi; - lavare con acqua; - colorare con safranina per 1 minuto; - lavare, asciugare e osservare al microscopio Lettura e interpretazione dei risultati Le cellule dei batteri Gram-positivi appaiono colorate in blu-violetto, mentre le cellule dei batteri Gramnegativi in rosso. Note Dopo la colorazione con cristal violetto si colorano sia le cellule dei batteri Gram positivi che quelle dei Gram negativi. Il Lugol è un mordenzante. Il trattamento con alcool-acetone decolora le cellule dei Gram negativi. Le cellule dei Gram negativi si colorano con la safranina Reazione di Gram con KOH 3% Esecuzione del saggio - pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti - porre una goccia di idrossido di potassio al 3% sul vetrino - stemperare con un ansa il materiale microbico nella goccia per circa 30 sec - sollevare l ansa verso l alto Lettura e interpretazione dei risultati Le cellule dei batteri Gram-negativi si differenziano da quelle dei Gram-positivi per la formazione di un filamento viscoso visibile sollevando l ansa verso l alto dopo aver stemperato la colonia Presenza di endospore Le endospore risultano, nella maggior parte dei batteri sporigeni, visibili già da una semplice osservazione microscopica di un preparato microbico a fresco o dopo colorazione semplice o di Gram. Per una loro migliore evidenziazione si può ricorrere ad una colorazione specifica che consente di osservarle come aree colorate all interno delle cellule vegetative. Una delle procedure utilizzate per la colorazione delle spore è descritta di seguito. Soluzioni di coloranti Soluzione acquosa satura di verde malachite Soluzione di Safranina safranina O 0,25 g alcool etilico 95% 100 ml Prima dell uso aggiungere 10 ml di questa soluzione a 90 ml di acqua distillata. Esecuzione del saggio - pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti per microscopia; - porre una goccia di acqua sterile sul vetrino; - stemperare il materiale microbico nell'acqua; - lasciare asciugare il preparato microbico all aria; - fissare il preparato tagliando per 20 volte la fiamma; - colorare per 15 min con la soluzione acquosa satura di verde malachite; - lavare con acqua per 10 sec; 43

45 - colorare con una soluzione acquosa di safranina allo 0,25% per 15 sec: - lavare con acqua, asciugare ed osservare al microscopio Lettura e interpretazione dei risultati Le endospore appariranno colorate in verde all interno delle cellule che saranno di colore rosa-rosso Saggio della catalasi Molti microrganismi possiedono l enzima catalasi e sono in grado di scindere l H 2O 2 nel seguente modo: 2H 2O 2 + catalasi = 2H 2O+ O 2. Preparazione della soluzione Soluzione di perossido di idrogeno al 3% perossido di idrogeno 3 g acqua distillata 100 ml Esecuzione del saggio - pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti; - depositare sul vetrino una goccia di H 2O 2 al 3%; - stemperare il materiale microbico nella goccia di H 2O 2. Lettura e interpretazione dei risultati La positività del saggio è evidenziata dalla formazione di un effervescenza dovuta alla liberazione di ossigeno che indica la presenza della catalasi nella coltura saggiata Saggio dell ossidasi Reagenti per l ossidasi Tetrametil-p-fenilendiammina idrocloride 1 g acqua distillata 100 ml Questo reagente deve essere preparato fresco prima di ogni saggio e deve essere conservato in frigo in bottiglie scure per proteggerlo dalla luce. Esecuzione del saggio - Prelevare una colonia in esame cresciuta su substrato nutritivo agarizzato; - Stemperarla su carta da filtro Whatman n 1; - Aggiungere alcune gocce di reattivo Lettura e interpretazione dei risultati Il saggio è positivo quando la coltura microbica assume, al massimo entro 10 minuti una colorazione violacea a contatto con il reattivo. La reazione è dovuta all enzima citocromo a 3 ossidasi (componente del sistema di trasporto degli elettroni) che riduce il Tetrametil-p-fenilendiammina idrocloride a un composto di colore viola Saggio di motilità Composizione terreno nutritivo Componenti g/ litro di acqua distillata Triptone 5 Estratto di carne 3 Glucosio 1 Agar 3 ph 7,0 44

46 Preparazione Sospendere tutti i componenti in 1 litro di acqua distillata. Portare ad ebollizione sotto agitazione e distribuire 10 ml in tubi con tappo a vite. Esecuzione del saggio Prelevare con un ago da batteriologia una colonia ben isolata ed inoculare il terreno in provetta per infissione e incubare alla temperatura ottimale di crescita del microrganismo. I microrganismi mobili crescono in maniera diffusa dalla linea di inoculo (intorbidando tutto il terreno), mentre quelli immobili crescono solo lungo la linea dell inoculo. 45

47 6 Metodi di ricerca e identificazione di batteri patogeni negli alimenti Esistono numerosi metodi per la ricerca di specifici patogeni negli alimenti. La scelta del metodo da applicare, se non è dichiaratamente stabilito da legislazioni specifiche, dipende dal criterio microbiologico da adottare, dalle caratteristiche della materia prima, dal processo con cui il prodotto è stato ottenuto, dalle caratteristiche di rischio del prodotto, dal costo dell analisi e dalle sue finalità, ecc. Nelle pagine che seguono sono riportati i metodi specifici più in uso per la ricerca di batteri patogeni negli alimenti. Laddove le procedure di analisi sono normate da specifiche disposizioni legislative, si farà riferimento a questi metodi ufficiali di analisi. I presupposti teorici e le procedure generali per la ricerca qualitativa dei microrganismi patogeni negli alimenti sono descritte nel capitolo 4, mentre nel capitolo 5 sono riportati i principi per l identificazione.. Di seguito sono elencati alcuni materiali necessari per l analisi: Bilancia. Apparecchiatura e sacchetti sterili per omogeneizzazione. Attrezzi per la manipolazione del campione: coltelli, forbici, spatole, cucchiai, pinze, cilindri, ecc. sterili. Pipette sterili da 10, 1 e 0,1 ml e pro-pipette o pipettatori automatici. Terreni nutritivi: brodi di resuscitazione (prearricchimento), brodi di arricchimento selettivo, terreni agarizzati selettivi e differenziali; terreni agarizzati non selettivi. Piastre Petri sterili. Anse per batteriologia. Incubatori. Reagenti o test miniaturizzati per i saggi di identificazione. Anticorpi specifici. Avvertenze In questo capitolo sono descritte procedure, metodi e terreni nutritivi. Talvolta si tratta solo di esempi a scopo didattico e quindi non necessariamente vanno utilizzati al di fuori di questo contesto nel modo in cui sono descritti. Inoltre, ogni riferimento a terreni nutritivi, reagenti e Kit diagnostici è solo a titolo di esempio e non esclude l impiego di altri materiali che potrebbero essere adatti e che non sono qui citati. 46

48 6.1 Ricerca di Salmonella spp. negli alimenti Prearricchimento Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Arricchimento selettivo Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Isolamento su terreno selettivo e differenziale Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Selezione di colonie tipiche e loro isolamento in coltura pura Identificazione (Conferma dell isolato) In un sacchetto sterile aggiungere 25 g di campione e 225 ml di Acqua Peptonata Tamponata. Omogeneizzare per 1-2 min in Stomacher. Incubare per un minimo di 16 ore fino ad un massimo di 20 ore a C. Trasferire 1 ml del brodo di prearricchimento in 10 ml di Brodo Selenite Cistina; Trasferire 1 ml del brodo di prearricchimento in 0,1 ml di Brodo Rappaport- Vassiliadis. Incubare a C per 24 ore (più eventuali altre 24 ore) il Brodo Selenite Costina; Incubare a C per 24 ore (più eventuali altre 24 ore) il Brodo Rappaport-Vassiliadis. Strisciare con aliquote da 0,1 ml di ciascun brodo di arricchimento una piastra di Brilliant Green Agar (BGA) e una piastra di un altro substrato a scelta (ad esempio Salmonella-Shigella Agar, SSA o Hektoen Agar, HA). Incubare le piastre a C per 24 ore. Annotare la comparsa di colonie sospette (tipiche) che presentino le seguenti caratteristiche: - di colore rosso circondate da terreno rosso vivo su BGA; - incolori con centro nero su SSA; - blù-verdi con o senza centro nero su HA. Prelevare almeno 3-5 colonie tipiche e strisciarle su piastre contenenti un terreno nutritivo non selettivo (ad esempio Agar nutritivo; TSA; BHI agar). Incubare le piastre a C per 24 ore. Accertata la purezza delle colonie trapiantate, gli isolati presuntivi devono essere identificati come appartenenti al genere Salmonella attraverso i seguenti test: Morfologia delle cellule: l osservazione microscopica deve rilevare la presenza di corti bastoncini. Gram-reazione: l osservazione microscopica deve rilevare la presenza di corti bastoncini Gram negativi (colorati in rosso). Catalasi: il test deve rilevare lo sviluppo di effervescenza (sviluppo di gas) che indicherà la presenza dell enzima. Ossidasi: il test deve rilevare il mancato sviluppo di colorazione viola che indicherà l assenza dell enzima. Prove biochimiche Reazioni su Kliger Iron Agar: Salmonella spp. (acido da glucosio con produzione di gas; produzione di H 2S. Salmonella typhi (acido da glucosio senza produzione di gas; produzione di H 2S); Test dell ureasi: negativo; Test di decarbossilazione della lisina: positivo; Test della beta galattosidasi: negativo; Reazione di Voges Proskauer: negativa; Test di produzione di indolo: positivo; Impiego di sistemi di identificazione multitest specifici per Enterobacteriaceae. Conferma sierologica: ricerca della presenza di antigeni O, K ed H. 47

49 Tabella Caratteristiche biochimiche di Salmonella spp. e di alcune specie che presentano caratteristiche simili sui substrati selettivi e differenziali di primo isolamento. Caratteri Salmonella Proteus mirabilis Citrobacter freundii Produzione di indolo Rosso metile Voges-Proskauer - d - Utilizzazione Citrato ± d + H 2S + + [+] Ureasi - + d Fenilalanina deaminasi Lisina decarbossilasi Arginina deidrolasi d - d Ornitina decarbossilasi + + [-] Mobilità Idrolisi gelatina Crescita in KCN -/+ + + Utilizzazione malonato -/+ - [-] Acido da glucosio Gas da glucosio Acido da adonitolo Acido da arabinosio Acido da cellobiosio -/+ - d Acido da dulcitolo +/- - d Acido da glicerolo - d + Acido da mioinositolo Acido da lattosio -/+ - d Acido da maltosio Acido da mannitolo Acido da mannosio Acido da melibiosio +/- - d Ac. da α Metil D glucoside Acido da raffinosio - - d Acido da ramnosio Acido da salicina -/+ - - Acido da sorbitolo +/- - + Acido da saccarosio - [-] d Acido da trealosio Acido da xylosio Acido da mucato +/- - + Idrolisi esculina Riduzione nitrati ONPG +/- - + [-] : 11-25% positivo; [+]: 76-89% positivo; d: 26-75% positivo 48

50 6.2- Ricerca di Shigella spp. negli alimenti Arricchimento selettivo In un sacchetto sterile aggiungere 25 g di campione e 225 ml di Brodo Selenite-Cistina. Omogeneizzare per 1-2 min in Stomacher. Temperatura ( C) e Incubare a C per ore. tempo (h) di incubazione Isolamento su terreno Strisciare con aliquote da 0,1 ml del brodo di arricchimento una piastra selettivo e differenziale di Mac Conkey Agar (MCA) e una piastra di un altro substrato a scelta (ad esempio Salmonella-Shigella Agar, SSA o Hektoen Agar, HA). Temperatura ( C) e Incubare le piastre a C per 24 ore. tempo (h) di incubazione Selezione di colonie Annotare la comparsa di colonie sospette (tipiche) che presentino le tipiche e loro isolamento seguenti caratteristiche: in coltura pura - incolori su MCA; - incolori senza centro nero su SSA; - verdi, trasparenti su HA. Prelevare almeno 3-5 colonie tipiche e strisciarle su piastre contenenti un terreno nutritivo non selettivo (ad esempio Agar nutritivo; TSA; BHI agar). Incubare le piastre a C per 24 ore. Identificazione (Conferma Accertata la purezza delle colonie trapiantate, gli isolati presuntivi dell isolato) devono essere identificati come appartenenti al genere Shigella attraverso i seguenti test: Morfologia delle cellule: l osservazione microscopica deve rilevare la presenza di corti bastoncini. Gram-reazione: L osservazione microscopica deve rilevare la presenza di corti bastoncini Gram negativi (colorati in rosso). Catalasi: il test deve rilevare lo sviluppo di effervescenza (sviluppo di gas) che indicherà la presenza dell enzima. Ossidasi: il test deve rilevare il mancato sviluppo di colorazione viola che indicherà l assenza dell enzima. Prove biochimiche Reazioni su Kliger Iron Agar: acido da glucosio senza produzione di gas; mancata produzione di H 2S. Impiego di sistemi di identificazione multitest specifici per Enterobacteriaceae. 49

51 Tabella Caratteristiche biochimiche di specie di Shigella Caratteri S. boydii; S. flexneri; S. dysenteriae Shigella sonnei Produzione di indolo d - Rosso metile + + Voges-Proskauer - - Utilizzazione Citrato - - H 2S - - Ureasi - - Fenilalanina deaminasi - - Lisina decarbossilasi - - Arginina deidrolasi - - Ornitina decarbossilasi - + Mobilità - - Idrolisi gelatina - - Crescita in KCN - - Utilizzazione malonato - - Acido da glucosio + + Gas da glucosio - - Acido da adonitolo - - Acido da arabinosio d + Acido da cellobiosio - - Acido da dulcitolo - - Acido da glicerolo - [-] Acido da mioinositolo - - Acido da lattosio - - Acido da maltosio d + Acido da mannitolo + + Acido da mannosio + + Acido da melibiosio d [-] Ac. da α Metil D glucoside - - Acido da raffinosio d - Acido da ramnosio - [+] Acido da salicina - - Acido da sorbitolo d - Acido da saccarosio - - Acido da trealosio [+] + Acido da xylosio - - Acido da mucato - - Idrolisi esculina - - Riduzione nitrati + + ONPG - + [-] : 11-25% positivo; [+]: 76-89% positivo; d: 26-75% positivo 50

52 6.3 - Ricerca di Escherichia coli O157:H7 negli alimenti Arricchimento selettivo In un sacchetto sterile aggiungere 25 g di campione e 225 ml mtsb (Trypticase Soy Broth modificato con aggiunta di 20 mg/l di novobiocina); Omogeneizzare per 1-2 min in Stomacher. Temperatura ( C) e Incubare a 37 C per 6 ore tempo (h) di incubazione Isolamento su terreno Strisciare con ansate del brodo di arricchimento piastre di CT-SMAC selettivo e differenziale (Sorbitol MacConkey Agar con Cefixime e Tellurito di potassio). Temperatura ( C) e Incubare le piastre a 37 C per 20 ore. tempo (h) di incubazione Selezione di colonie Annotare la comparsa di colonie sospette (tipiche) che presentino le tipiche e loro isolamento seguenti caratteristiche: in coltura pura - incolori per mancata fermentazione del sorbitolo. Prelevare almeno 3-5 colonie tipiche e strisciarle su piastre contenenti un terreno nutritivo non selettivo (ad esempio Agar nutritivo; TSA; BHI agar). Incubare le piastre a C per 24 ore. Identificazione (Conferma Accertata la purezza delle colonie trapiantate, gli isolati presuntivi dell isolato) devono essere identificati come appartenenti ad E. coli O:157:H7 attraverso i seguenti test: Morfologia delle cellule: l osservazione microscopica deve rilevare la presenza di corti bastoncini. Gram-reazione: L osservazione microscopica deve rilevare la presenza di corti bastoncini Gram negativi (colorati in rosso). Catalasi: il test deve rilevare lo sviluppo di effervescenza (sviluppo di gas) che indicherà la presenza dell enzima. Ossidasi: il test deve rilevare il mancato sviluppo di colorazione viola che indicherà l assenza dell enzima. Prove biochimiche Reazioni su Kliger Iron Agar: acido da lattosio con produzione di gas; mancata produzione di H 2S. Test IMVC: ++-- Impiego di sistemi di identificazione multitest specifici per Enterobacteriaceae; Ricerca dell enzima beta-glucuronidasi: assente; Test di agglutinazione rapida su vetrino con anticorpi specifici. Produzione di tossine VT: saggio su cellule VERO. Ricerca di geni specifici mediante PCR: tossine ST1 e ST2; emolisina; eae. 51

53 Tabella 6.3 Caratteristiche biochimiche di Escherichia coli Caratteri Escherichia coli Produzione di indolo + Rosso metile + Voges-Proskauer - Utilizzazione Citrato - H 2S - Ureasi - Fenilalanina deaminasi - Lisina decarbossilasi + Arginina deidrolasi [-] Ornitina decarbossilasi d Mobilità + Idrolisi gelatina - Crescita in KCN - Utilizzazione malonato - Acido da glucosio + Gas da glucosio + Acido da adonitolo - Acido da arabinosio + Acido da cellobiosio - Acido da dulcitolo d Acido da glicerolo d Acido da mioinositolo - Acido da lattosio + Acido da maltosio + Acido da mannitolo + Acido da mannosio + Acido da melibiosio [+] Ac. da α Metil D glucoside - Acido da raffinosio d Acido da ramnosio [+] Acido da salicina d Acido da sorbitolo + (O157:H7 negativo) Acido da saccarosio d Acido da trealosio + Acido da xylosio + Acido da mucato + Idrolisi esculina + Riduzione nitrati + ONPG + [-] : 11-25% positivo; [+]: 76-89% positivo; d: 26-75% positivo 52

54 6.4 - Ricerca di Yersinia enterocolitica negli alimenti Arricchimento selettivo In un sacchetto sterile aggiungere 25 g di campione e 225 ml di Brodo Rappaport-Vassiliadis (modificato con aggiunta di 2,5 mg/l di carbenicillina) o 225 ml di Yersinia Selective Enrichment Broth; Omogeneizzare per 1-2 min in Stomacher. Temperatura ( C) e Incubare a 28 C per 48 ore. tempo (h) di incubazione Isolamento su terreno Strisciare con ansate del brodo di arricchimento piastre di CIN agar selettivo e differenziale (Cefsulodin Irgasan Novobiocin Agar). Per la numerazione del microrganismo seminare aliquote di diluizioni decimali del campione direttamente su CIN agar. Temperatura ( C) e Incubare le piastre a 28 C per ore. tempo (h) di incubazione Selezione di colonie Annotare la comparsa di colonie sospette (tipiche) che presentino le tipiche e loro isolamento seguenti caratteristiche: in coltura pura - centro rosa-rosso con periferia trasparente/traslucida. Prelevare almeno 3-5 colonie tipiche e strisciarle su piastre contenenti un terreno nutritivo non selettivo (ad esempio Agar nutritivo; TSA; BHI agar). Incubare le piastre a 28 C per 24 ore. Identificazione (Conferma Accertata la purezza delle colonie trapiantate, gli isolati presuntivi dell isolato) devono essere identificati come appartenenti a Yersinia enterocolitica attraverso i seguenti test: Morfologia delle cellule: l osservazione microscopica deve rilevare la presenza di corti bastoncini. Gram-reazione: L osservazione microscopica deve rilevare la presenza di corti bastoncini Gram negativi (colorati in rosso). Catalasi: il test deve rilevare lo sviluppo di effervescenza (sviluppo di gas) che indicherà la presenza dell enzima. Ossidasi: il test deve rilevare il mancato sviluppo di colorazione viola che indicherà l assenza dell enzima. Prove biochimiche Reazioni su Kliger Iron Agar: acido da glucosio senza produzione di gas; mancata produzione di H 2S. Impiego di sistemi di identificazione multitest specifici per Enterobacteriaceae. 53

55 Tabella 6.4 Caratteristiche di Yersinia enterocolitica Caratteri Yersinia enterocolitica Produzione di indolo d Rosso metile + Voges-Proskauer - Utilizzazione Citrato - H 2S - Ureasi [+] Fenilalanina deaminasi - Lisina decarbossilasi - Arginina deidrolasi - Ornitina decarbossilasi + Mobilità - Idrolisi gelatina - Crescita in KCN - Utilizzazione malonato - Acido da glucosio + Gas da glucosio - Acido da adonitolo - Acido da arabinosio + Acido da cellobiosio [+] Acido da dulcitolo - Acido da glicerolo + Acido da mioinositolo d Acido da lattosio - Acido da maltosio [+] Acido da mannitolo + Acido da mannosio + Acido da melibiosio - Ac. α Metil D glucoside - Acido da raffinosio - Acido da ramnosio - Acido da salicina [-] Acido da sorbitolo + Acido da saccarosio + Acido da trealosio + Acido da xylosio d Acido da mucato - Idrolisi esculina [-] Riduzione nitrati + ONPG + [-] : 11-25% positivo; [+]: 76-89% positivo; d: 26-75% positivo 54

56 6.5 Ricerca di Brucella spp. negli alimenti Preparazione del campione Isolamento su terreno selettivo e differenziale Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Selezione di colonie tipiche e loro isolamento in coltura pura Identificazione (Conferma dell isolato) In un sacchetto sterile aggiungere l alimento e un diluente (es. soluzione sale peptone) in rapporto 1:10. Omogeneizzare per 1-2 min in Stomacher. Strisciare con ansate dell omogenato piastre di Brucella agar. La ricerca del microrganismo nel latte deve essere fatta sia sulla crema che sull eventuale precipitato dopo centrifugazione o affioramento spontaneo del campione di latte. Seguire la seguente procedura: - porre il campione di latte in una provetta sterile ed incubarlo per una notte a 40 C; - prelevare un aliquota di panna affiorata e distribuirla con una spatola sterile su una piastra di Brucella agar. Incubare le piastre a 35 C per 10 giorni in atmosfera arricchita del 10% di CO 2. Esaminare le piastre ogni 2 giorni, fino a 10 giorni, per la presenza di colonie di 1-2 mm di diametro, convesse e a margini interi. Prelevare una o più colonie tipiche e strisciarle su piastre contenenti un terreno nutritivo non selettivo, ad esempio, BHIA (Brain Hearth Infusion Broth con 1,5% di agar e 5% di siero di cavallo). Incubare le piastre a 35 C per 48 ore in atmosfera arricchita del 10% di CO 2. Gli isolati presuntivi devono essere identificati come appartenenti al genere Brucella attraverso i seguenti test: Morfologia delle cellule: l osservazione microscopica deve rilevare la presenza di piccoli cocco-bacilli. Gram-reazione: L osservazione microscopica deve rilevare la presenza di piccoli cocco-bacilli Gram negativi (colorati in rosso). Catalasi: il test deve rilevare lo sviluppo di effervescenza (sviluppo di gas) che indicherà la presenza dell enzima. Ossidasi: il test deve rilevare lo sviluppo di colorazione viola che indicherà la presenza dell enzima. Prove biochimiche: vedi tabella Test di agglutinazione rapida su vetrino con antisieri specifici (antimelitensis e anti-abortus). Tabella 6.5 Alcune caratteristiche di Brucella spp. Specie Ospite Esigenza CO 2 Produzione di H 2S Crescita su coloranti Tionina 1: Fucsina basica 1: B. melitensis* capra-pecora-bufala B. abortus * bovini-bufala + (5-10%) B. suis * suini B. canis * cani B. ovis ovini B. neotomae roditori *: patogene per l uomo 55

57 6.6 Ricerca di Aeromonas spp. negli alimenti Arricchimento selettivo Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Isolamento su terreno selettivo e differenziale Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Selezione di colonie tipiche e loro isolamento in coltura pura Identificazione dell isolato) (Conferma In un sacchetto sterile aggiungere 25 g di campione e 225 ml di acqua peptonata a ph 8,4. Omogeneizzare per 1-2 min in Stomacher. Preparare diluizioni seriali decimali. Incubare l omogenato dell alimento a 28 C per Seminare aliquote di 0,1 ml delle diluizioni seriali su piastre di terreno Aeromonas Selective agar. Incubare le piastre a 30 C per 24 ore. Annotare la comparsa di colonie sospette (tipiche) riferibili ad Aeromonas hydrophila che presentino le seguenti caratteristiche: - diametro di 0,5-1,5 mm, opache, di colore verde con centro scuro. Prelevare una o più colonie tipiche e strisciarle su piastre contenenti un terreno nutritivo non selettivo (ad esempio Agar nutritivo; TSA; BHI agar). Incubare le piastre a 30 C per 24 ore. Gli isolati presuntivi devono essere identificati come appartenenti al genere Aeromonas attraverso i seguenti test: Morfologia delle cellule: l osservazione microscopica deve rilevare la presenza di bastoncini diritti. Gram-reazione: L osservazione microscopica deve rilevare la presenza di bastoncini Gram negativi (colorati in rosso). Catalasi: il test deve rilevare lo sviluppo di effervescenza (sviluppo di gas) che indicherà la presenza dell enzima. Ossidasi: il test deve rilevare lo sviluppo di colorazione viola che indicherà la presenza dell enzima. Resistenza all agente vibriostatico O/129 (diamino diisopropilenpteridine): si distribuisce uniformemente sulla superficie di una piastra di terreno selettivo usato per l isolamento una sospensione di una colonia sospetta, quindi si depone sul terreno un dischetto per antibiogramma contenente l agente O/129. Dopo incubazione si rileva la presenza o meno di aloni di inibizione (vedi tabella 10.6). Sensibilità alla cefalotina: procedura simile a quella descritta sopra (Aeromonas hydrophila è sensibile). Prove biochimiche - Reazioni su Kliger Iron Agar: acido da glucosio con produzione di gas; mancata produzione di H 2S. Impiego di sistemi di identificazione multitest. Tabella 10.6 Alcune caratteristiche di specie di Aeromonas CARATTERI hydrophila caviae veronii biovar jandaei schubertii trota sobria veronii Gruppo ibridazione G1 G4 G8/10 G8/10 G9 G12 G14 Resistenza O/ Sensibilità cefalotina + - Produzione indolo Gas da glucosio Reazione divp Produzione acido da arabinosio saccarosio mannitolo salicina idrolisi esculina beta emolisi + variab variab. 56

58 6.7 Ricerca di Campylobacter spp. negli alimenti Arricchimento selettivo Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Isolamento su terreno selettivo e differenziale Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Selezione di colonie tipiche e loro isolamento in coltura pura Identificazione (Conferma dell isolato) In un sacchetto sterile aggiungere 25 g di campione e 225 ml di brodo Preston. Omogeneizzare per 1-2 min in Stomacher. Incubare a 42 C per 18 ore in microaerofilia (atmosfera arricchita con il 5% di ossigeno e 10% di anidride carbonica). Strisciare con ansate dell arricchimento piastre con terreno selettivo di Karmali e su un altro terreno selettivo a scelta tra Skirrow agar (SA), Butzler Agar (BA), Preston agar (PA). Incubare le piastre a 42 C per 1-5 giorni in microaerofilia. Annotare la comparsa di colonie sospette (tipiche) riferibili a Campylobacter che presentino le seguenti caratteristiche: su Karmali Agar: grigie, piatte, umide e con tendenza a diffondere; su Skirrow agar: rosso chiare. Prelevare una o più colonie tipiche e strisciarle su piastre contenenti un terreno nutritivo non selettivo (ad esempio Agar nutritivo; TSA; BHI agar). Incubare le piastre a 30 C per 24 ore. Gli isolati presuntivi devono essere identificati come appartenenti al genere Campylobacter attraverso i seguenti test: Morfologia delle cellule: l osservazione microscopica deve rilevare la presenza di piccoli bastoncini ricurvi. Gram-reazione: L osservazione microscopica deve rilevare la presenza di bastoncini ricurvi Gram negativi (colorati in rosso). Catalasi: il test deve rilevare lo sviluppo di effervescenza (sviluppo di gas) che indicherà la presenza dell enzima. Ossidasi: il test deve rilevare lo sviluppo di colorazione viola che indicherà la presenza dell enzima. Sensibilità all acido nalidixico e alla cefalotina: si distribuisce uniformemente sulla superficie di una piastra di terreno selettivo usato per l isolamento una sospensione di una colonia sospetta, quindi si depone sul terreno un dischetto per antibiogramma contenente acido nalidixico e uno contenente cefalotina. Dopo incubazione si rileva la presenza o meno di aloni di inibizione (vedi tabella 10.7). Prove biochimiche Saggio idrolisi ippurato: sospendere un ansata di coltura del microrganismo cresciuto su substrato solido per 24 ore in 2 ml di acqua distillata sterile. Aggiungere 0,5 ml di una soluzione di ippurato di sodio al 5% e incubare a 37 C per 2 ore. Aggiungere 1 ml di soluzione di ninidrina (3,5 g in 50 ml di acetone e 50 ml di butanolo) e lasciare per altre 2 ore a temperatura ambiente. Lo sviluppo di un intenso colore viola-porpora è indice di idrolisi dell ippurato. Impiego di sistemi di identificazione multitest. Tabella Caratteristiche di alcune specie del genere Campylobacter Specie Crescita T C Idrolisi ippurato Sensibilità a Cefalotina Acido nalidixico C. jejuni R S C. coli R S C. fetus subsp. fetus + + Var - S R C. lari R R C. hyointestinalis Var + Var - S R 57

59 6.8.1 Ricerca di Vibrio cholerae negli alimenti Arricchimento selettivo Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Isolamento su terreno selettivo e differenziale Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Selezione di colonie tipiche e loro isolamento in coltura pura Identificazione (Conferma dell isolato) In due sacchetti sterili aggiungere 25 g di campione e 225 ml di acqua peptonata a ph 8,4. Omogeneizzare per 1-2 min in Stomacher. Incubare un sacchetto a 37 C e uno a 42 C per 6-8 ore. Strisciare con ansate dell arricchimento (prelevando soprattutto la pellicola superficiale) piastre con terreno selettivo TCBS agar (Tiosolfato Bile Citrato Saccarosio Agar). Incubare le piastre a 37 C per ore. Annotare la comparsa di colonie sospette (tipiche) riferibili a Vibrio spp. che presentino le seguenti caratteristiche: V. cholerae: 2-3 mm di diametro, liscie e leggermente appiattite, di colore giallo con centro opaco; V. parahaemolyticus: 2-3 mm di diametro, tonde, con periferia traslucida e centro di colore verde; Altre specie di Vibrio: gialle o verdi. Prelevare una o più colonie tipiche e strisciarle su piastre contenenti un terreno nutritivo non selettivo (ad esempio Agar nutritivo; TSA; BHI agar). Incubare le piastre a 37 C per 24 ore. Gli isolati presuntivi devono essere identificati come appartenenti al genere Vibrio attraverso i seguenti test: Morfologia delle cellule: l osservazione microscopica deve rilevare la presenza di piccoli bastoncini diritti o ricurvi. Gram-reazione: L osservazione microscopica deve rilevare la presenza di bastoncini ricurvi Gram negativi (colorati in rosso). Catalasi: il test deve rilevare lo sviluppo di effervescenza (sviluppo di gas) che indicherà la presenza dell enzima. Ossidasi: il test deve rilevare lo sviluppo di colorazione viola che indicherà la presenza dell enzima. Resistenza all agente vibriostatico O/129 (diamino diisopropilenpteridine): si distribuisce uniformemente sulla superficie di una piastra di terreno selettivo usato per l isolamento una sospensione di una colonia sospetta, quindi si depone sul terreno un dischetto per antibiogramma contenente l agente O/129. Dopo incubazione si rileva la presenza o meno di aloni di inibizione (vedi tabella e ). Prove biochimiche Reazioni su Kliger Iron Agar: acido da glucosio senza produzione di gas; mancata produzione di H 2S. Agglutinazione con antisieri polivalenti anti O1 e anti O139. Impiego di sistemi di identificazione multitest. Tabella Alcune caratteristiche del genere Vibrio e di generi e famiglie correlate Cartteristiche Vibrio Aeromonas Plesiomonas Enterobacteriaceae Flagello polare con guaina Accumulo di idrossibutirrato Esigenze di Na Ossidasi H 2S (su KIA) ± Gas da glucosio - ± - ± Acido: Mannitolo ± Mannosio ± Sensibilita agente O/ ± - 58

60 6.8.2 Ricerca di Vibrio parahaemolyticus e altre specie di Vibrio negli alimenti Arricchimento selettivo In un sacchetto sterile aggiungere 25 g di campione e 225 ml di acqua peptonata a ph 8,4 con il 3% di NaCl. Omogeneizzare per 1-2 min in Stomacher. Temperatura ( C) e Incubare a 37 C per ore. tempo (h) di incubazione Isolamento su terreno Strisciare con ansate dell arricchimento piastre con terreno selettivo selettivo e differenziale TCBS agar (Tiosolfato Bile Citrato Saccarosio Agar). Temperatura ( C) e Incubare le piastre a 37 C per ore. tempo (h) di incubazione Selezione di colonie Annotare la comparsa di colonie sospette (tipiche) riferibili a Vibrio spp. tipiche e loro isolamento che presentino le seguenti caratteristiche: in coltura pura V. parahaemolyticus: 2-3 mm di diametro, tonde, con periferia traslucida e centro di colore verde; V. cholerae: 2-3 mm di diametro, liscie e leggermente appiattite, di colore giallo con centro opaco; Altre specie di Vibrio: gialle o verdi. Prelevare una o più colonie tipiche e strisciarle su piastre contenenti un terreno nutritivo non selettivo (ad esempio Agar nutritivo; TSA; BHI agar). Incubare le piastre a 37 C per 24 ore. Identificazione (Conferma Gli isolati presuntivi devono essere identificati come appartenenti al dell isolato) genere Vibrio attraverso i seguenti test: Morfologia delle cellule: l osservazione microscopica deve rilevare la presenza di piccoli bastoncini diritti o ricurvi. Gram-reazione: L osservazione microscopica deve rilevare la presenza di bastoncini ricurvi Gram negativi (colorati in rosso). Catalasi: il test deve rilevare lo sviluppo di effervescenza (sviluppo di gas) che indicherà la presenza dell enzima. Ossidasi: il test deve rilevare lo sviluppo di colorazione viola che indicherà la presenza dell enzima. Resistenza all agente vibriostatico O/129 (diamino diisopropilenpteridine): si distribuisce uniformemente sulla superficie di una piastra di terreno selettivo usato per l isolamento una sospensione di una colonia sospetta, quindi si depone sul terreno un dischetto per antibiogramma contenente l agente O/129. Dopo incubazione si rileva la presenza o meno di aloni di inibizione (vedi tabella e ). Prove biochimiche Reazioni su Kliger Iron Agar: acido da glucosio senza produzione di gas; mancata produzione di H 2S. Impiego di sistemi di identificazione multitest. 59

61 Tabella Caratteristiche biochimiche di alcune specie di Vibrio Caratteri V. CHOLERAE V. MIMICUS V. METSCHNIKOVII V. CINCINNATIENSIS V. HOLLISAE V. DAMSELA V. FLUVIALIS V. FURNISSII V. ALGINOLYTICUS V. PARAHAEMOLYTICUS V. VULNIFICUS V. CARCHARIAE Crescita 0% NaCl Crescita 1% NaCl Crescita 7% NaCl Crescita 10% NaCl Ossidasi Riduzione nitrati Arginina diidrolasi - - ± Lisina decarbossilasi + + ± ± - ± Ornitina decarbossilasi ± + ± - Acido da saccarosio ± Gas da glucosio Acido da Maltosio

62 6.9 Ricerca di Bacillus cereus negli alimenti Preparazione del In un sacchetto sterile aggiungere l alimento e un diluente (es. campione soluzione sale peptone) in rapporto 1:10. Omogeneizzare per 1-2 min in Stomacher. Preparare diluizioni seriali decimali. Isolamento su terreno Seminare con aliquote da 0,1 ml di ciascuna diluizione piastre selettivo e differenziale contenenti il terreno MYP agar (Mannitol Egg Yolk Polymixine Agar). Temperatura ( C) e Incubare le piastre a 32 C per ore più altre 24 se necessario. tempo (h) di incubazione Selezione di colonie Contare le colonie tipiche che si presentano rugose, secche, di colore tipiche e loro isolamento rosa-viola circondate da un denso alone di precipitazione. in coltura pura Prelevare una o più colonie tipiche e strisciarle su piastre contenenti un terreno nutritivo non selettivo (ad esempio Agar nutritivo; TSA; BHI agar). Incubare le piastre a 30 C per 24 ore. Identificazione (Conferma Gli isolati presuntivi devono essere identificati come appartenenti al dell isolato) genere Bacillus attraverso i seguenti test: Morfologia delle cellule: l osservazione microscopica deve rilevare la presenza di bacilli sporigeni. Gram-reazione: L osservazione microscopica deve rilevare la presenza di bacilli Gram positivi (colorati in viola). Catalasi: il test deve rilevare lo sviluppo di effervescenza (sviluppo di gas) che indicherà la presenza dell enzima. Ossidasi: il test deve rilevare lo sviluppo di colorazione viola che indicherà la presenza dell enzima. Colorazione delle spore e dei granuli lipidici: allestire un preparato microbico seccato all aria e fissato alla fiamma; esporre il vetrino ai vapori di acqua bollente e coprire con una soluzione di verde malachite al 5% per 2 min; lavare con acqua e asciugare; colorare con una soluzione di Nero Sudan allo 0,3% (sciolto in etanolo al 70%) per 15 minuti; lavare con xylolo per 5 secondi; asciugare e colorare con safranina per 20 sec; lavare con acqua, asciugare e osservare al microscopio: le cellule vegetative di B. cereus (4-5x1-1,5 µm) saranno colorate in rosso, mentre le spore (in posizione centrale o subterminale) saranno di colore verde e i granuli lipidici di colore nero. Prove biochimiche: vedi tabella 6.9. Impiego di sistemi di identificazione multitest. 61

63 Tabella 6.9 Caratteristiche biochimiche di Bacillus cereus Caratteri Reazione Morfologia Bastoncini (1,0-1,5x3-5 µm) Spore Ellittiche, centrali o sub-terminali Gram-reazione + Catalasi + Mobilità Flagelli peritrichi Granuli lipidici + Cristalli parasporali - Temperatura di crescita C (ottimale C) Crescita: anaerobica + 0,001% lisozima + Voges-Proskauer + Utilizzazione citrato + Produzione indolo - Idrolisi: gelatina + caseina + urea ± amido ± Riduzione nitrati + Acido da: glucosio + maltosio + trealosio + glicerolo + mannitolo - xilosio - arabinosio - lattosio - dulcitolo - inositolo - saccarosio ± dulcitolo ± Emolisi su agar sangue + 62

64 Ricerca di Listeria monocytogenes negli alimenti Arricchimento selettivo primario Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Arricchimento selettivo secondario Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Isolamento su terreno selettivo e differenziale Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Selezione di colonie tipiche e loro isolamento in coltura pura Identificazione (Conferma dell isolato) In un sacchetto sterile aggiungere 25 g di campione e 225 ml Half Frazer Broth (Brodo di Frazer con una ridotta concentrazione di agenti selettivi). Omogeneizzare per 1-2 min in Stomacher. Incubare per 24 ore a 30 C. Trasferire 0,1 ml del brodo di arricchimento in 10 ml di Frazer Broth. Incubare a C per 48 ore. Strisciare con ansate di ciascun brodo di arricchimento (primario e secondario) una piastra di Oxford agar e una piastra di Palcam agar. Incubare le piastre a C per ore. Annotare la comparsa di colonie sospette (tipiche) che presentino le seguenti caratteristiche: - su Oxford agar: piccole (1 mm di diametro) grigiastre circondate da un alone nero dovuto all idrolisi dell esculina. Dopo 48, le colonie, tendono a diventare più scure e più grandi leggermente infossate nel terreno con centro concavo; - su Palcam agar: piccole, grigio-verde o grigio-oliva con alone nero e talvolta con il centro nero, su sfondo rosso del substrato. Prelevare almeno 3-5 colonie tipiche e strisciarle su piastre contenenti un terreno nutritivo non selettivo (ad esempio TSA con aggiunto lo 0,6% di estratto di lievito). Incubare le piastre a C per 24 ore. Accertata la purezza delle colonie trapiantate, gli isolati presuntivi devono essere identificati come appartenenti al genere Listeria attraverso i seguenti test: Morfologia delle cellule: L osservazione microscopica deve rilevare la presenza di bastoncini. Gram-reazione: l osservazione microscopica deve rilevare la presenza di bastoncini Gram positivi (colorati in violetto). Catalasi: il test deve rilevare lo sviluppo di effervescenza (sviluppo di gas) che indicherà la presenza dell enzima. Mobilità: inoculare per infissione una provetta contenente il terreno Motility medium con un ansata della coltura del ceppo cresciuto per 24 ore in TSB a C, ed incubare a 25 C per 48 ore. I batteri mobili cresceranno anche intorno alla linea di infissione (tipica crescita "ad ombrello"). Emolisi su agar sangue: inoculare per infissione più punti di una piastra contenente Agar sangue. Dopo incubazione a 37 C Listeria monocytogenes presenta zone di beta emolisi molto strette. Prove biochimiche (vedi tabella 6.10). Impiego di sistemi di identificazione multitest specifici per Listeria. Conferma sierologia: agglutinazione su vetrino con antisieri O. 63

65 Ricerca di Listeria monocytogenes nel latte e derivati del latte Arricchimento selettivo primario Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Arricchimento selettivo secondario Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Isolamento su terreno selettivo e differenziale Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Selezione di colonie tipiche e loro isolamento in coltura pura Identificazione (Conferma dell isolato) In un sacchetto sterile aggiungere 25 g o 25 ml di campione e 225 ml Listeria Enrichment Broth. Omogeneizzare per 1-2 min in Stomacher. Incubare per ore e fino a 7 giorni a 30 C. Trasferire 0,1 ml del brodo di arricchimento in 10 ml di Listeria Enrichment Broth. Incubare a C per 48 ore. Strisciare con ansate di ciascun brodo di arricchimento (primario e secondario) una piastra di Oxford agar; può essere usato anche il Palcam agar. Incubare le piastre a 37 C per ore. Annotare la comparsa di colonie sospette (tipiche) che presentino le seguenti caratteristiche: - su Oxford agar: piccole (1 mm di diametro) grigiastre circondate da un alone nero dovuto all idrolisi dell esculina. Dopo 48, le colonie, tendono a diventare più scure e più grandi leggermente infossate nel terreno con centro concavo. - su Palcam agar: piccole, grigio-verde o grigio-oliva con alone nero e talvolta con il centro nero su sfondo rosso del substrato. Prelevare almeno 3-5 colonie tipiche e strisciarle su piastre contenenti un terreno nutritivo non selettivo (ad esempio TSA con aggiunto lo 0,6% di estratto di lievito). Incubare le piastre a C per 24 ore. Accertata la purezza delle colonie trapiantate, gli isolati presuntivi devono essere identificati come appartenenti al genere Listeria attraverso i seguenti test: Morfologia delle cellule: L osservazione microscopica deve rilevare la presenza di bastoncini. Gram-reazione: l osservazione microscopica deve rilevare la presenza di bastoncini Gram positivi (colorati in violetto). Catalasi: il test deve rilevare lo sviluppo di effervescenza (sviluppo di gas) che indicherà la presenza dell enzima. Mobilità: inoculare per infissione una provetta contenente il terreno Motility medium, con un ansata della coltura del ceppo cresciuto per 24 ore in TSB a C, ed incubare a 25 C per 48 ore. I batteri mobili cresceranno anche intorno alla linea di infissione (tipica crescita "ad ombrello"). Emolisi su agar sangue: inoculare per infissione più punti di una piastra contenente Agar sangue. Dopo incubazione a 37 C Listeria monocytogenes presenta zone di beta emolisi molto strette. Prove biochimiche (vedi tabella 6.10). Impiego di sistemi di identificazione multitest specifici per Listeria. Conferma sierologia: agglutinazione su vetrino con antisieri O. 64

66 Numerazione di Listeria monocytogenes in alimenti da consumarsi previa cottura (escluso il latte e derivati), con la tecnica MPN (Ministero della Sanità: ordinanza 7 dicembre Limiti di Listeria monocytogenes in alcuni prodotti alimentari) Preparazione del campione Semina provette Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Isolamento su terreno selettivo e differenziale Temperatura ( C) e tempo (h) di incubazione Selezione di colonie tipiche e loro isolamento in coltura pura Identificazione (Conferma dell isolato) In un sacchetto sterile aggiungere 10 g di campione e 90 ml di Acqua peptonata tamponata. Omogeneizzare per 1-2 min in Stomacher. Preparare diluizioni seriali decimali fino alla diluizione 1:1000. Seminare in triplice 1 ml delle diluizioni (1:10; 1:100 e 1:1000) in 9 ml di Frazer Broth. Incubare a 32 C per ore. Strisciare con ansate di coltura da ciascuna provetta che presenti annerimento del brodo su una piastra di Oxford agar. Incubare le piastre a 37 C per ore. Annotare la comparsa di colonie sospette (tipiche) che presentino le seguenti caratteristiche: piccole (1mm di diametro) grigiastre circondate da un alone nero dovuto all idrolisi dell esculina. Dopo 48 tendono a diventare più scure e più grandi leggermente infossate nel terreno con centro concavo. Prelevare almeno 5 colonie tipiche e strisciarle su piastre contenenti un terreno nutritivo non selettivo (ad esempio TSA con aggiunto lo 0,6% di estratto di lievito). Incubare le piastre a C per 24 ore. Accertata la purezza delle colonie trapiantate, gli isolati presuntivi devono essere identificati come appartenenti al genere Listeria attraverso i seguenti test: Morfologia delle cellule: L osservazione microscopica deve rilevare la presenza di bastoncini. Gram-reazione: l osservazione microscopica deve rilevare la presenza di bastoncini Gram positivi (colorati in violetto). Catalasi: il test deve rilevare lo sviluppo di effervescenza (sviluppo di gas) che indicherà la presenza dell enzima. Mobilità: inoculare per infissione in Motility medium un ansata della coltura del ceppo cresciuto per 24 ore in TSB a C, ed incubare a 25 C per 48 ore. I batteri mobili cresceranno anche intorno al punto di infissione (tipica crescita "ad ombrello"). Emolisi su agar sangue: inoculare per infissione più punti di una piastra contenente Agar sangue. Dopo incubazione a 37 C Listeria monocytogenes presenta zone di beta emolisi molto strette. Prove biochimiche Fermentazione del ramnosio: (+) Fermentazione dello xylosio: (-) Fermentazione del mannitolo: (-) Prova biologica: si iniettano in 5 topini Swiss 0,1 ml di una sospensione in soluzione fisiologica del sedimento della coltura del ceppo in esame cresciuto per 24 ore in TSYB. Si osservano i topi per 5 giorni. Dai risultati dei vari test si determina il MPN/g dalle apposite tavole. 65

67 Tabella 6.10 Caratteristiche di specie di Listeria Caratteri L. monocytogenes L. ivanovii L. seeligeri L. innocua L. welshimeri ß-emolisi CAMP test: Staphylococcus aureus Rhodococcus equi Produzione acido da: esculina maltosio mannitolo xilosio ramnosio v v α-metil-d-mannoside Virulenza nel topo

68 6.11 Numerazione di Staphylococcus aureus negli alimenti Preparazione del In un sacchetto sterile aggiungere 10 g di campione e 90 ml di Acqua campione peptonata tamponata. Omogeneizzare per 1-2 min in Stomacher. Preparare diluizioni seriali decimali. Isolamento su terreno Seminare 0,1 ml di ogni diluizione su piastre di Baird Parker con Egg selettivo e differenziale Yolk Tellurite (BP) o Baird Parker contenente RPF (Plasma di coniglio, fibrinogeno e tellurito di potassio) (BPRPF). Temperatura ( C) e Incubare a 37 C per ore. tempo (h) di incubazione Selezione di colonie Annotare la comparsa di colonie sospette (tipiche) che presentino le tipiche e loro isolamento seguenti caratteristiche: in coltura pura BP: nere o grigie, lucenti e convesse (1-1,5 mm di diametro) con margine opalescente biancastro e circondante da alone trasparente. BPRPF: grigie, bianche o nere con alone opaco di precipitazione della fibrina (coagulasi positiva). Prelevare almeno 5 colonie tipiche e strisciarle su piastre contenenti un terreno nutritivo non selettivo (ad esempio TSA con aggiunto lo 0,6% di estratto di lievito). Incubare le piastre a C per 24 ore. Identificazione (Conferma Accertata la purezza delle colonie trapiantate, gli isolati presuntivi dell isolato) devono essere identificati come appartenenti al genere Staphylococcus attraverso i seguenti test: Morfologia delle cellule: L osservazione microscopica deve rilevare la presenza di forme cocciche aggregate. Gram-reazione: l osservazione microscopica deve rilevare la presenza di cocchi Gram positivi (colorati in violetto). Catalasi: il test deve rilevare lo sviluppo di effervescenza (sviluppo di gas) che indicherà la presenza dell enzima. Ricerca della coagulasi libera: in un tubo da saggio sterile, miscelare 0,5 ml di coltura del ceppo cresciuto a 37 C per h in BHI e 0,5 ml di Plasma di coniglio contenente EDTA. Incubare a 37 C. Osservare dopo 4, 6 e 24 ore la formazione parziale o totale di coagulo. La prova è considerata positiva se il volume del coagulo occupa più del 75% del volume originario dell inoculo. Ricerca della coagulasi legata: su un supporto solido (cartoncino, vetrino) stemperare 2-3 colonie del ceppo in esame in una goccia di fibrinogeno e IgG e miscelare. Osservare dopo circa 1 min. la formazione eventuali agglutinazioni. Prove biochimiche (vedi tabella 6.11). Impiego di sistemi di identificazione multitest specifici per Staphylococcus. 67

69 Tabella 6.11 Caratteristiche di alcune specie di Staphylococcus Caratteri S. aureus S. hycus S. intermedius S. epidermidis S. chromogenes S. saprophyticus Coagulasi Clumping factor Termonucleasi ± - - Pigmento giallo ± Attività emolitica ± - - Fosfatasi ± + - Fermentazione mannitolo + - ± - ± ± Resistenza alla novobiocina Resistenza alla lisostafina Resistenza al furazolidone

70 7 Popolazioni microbiche specifiche degli alimenti: presupposti teorici, significato e metodi di ricerca e numerazione Il numero e i tipi di microrganismi presenti in un alimento possono essere usati per giudicare la qualità e la sicurezza microbiologica di quel prodotto. La sicurezza e la qualità microbiologica di un alimento è determinata dall assenza di microrganismi patogeni e/o delle loro tossine e dal livello di microrganismi alterativi. In generale, non è praticabile analizzare ogni alimento per la presenza di microrganismi indesiderati, siano essi patogeni che alterativi. In pratica per accertare sia la qualità microbiologica che la sicurezza di un alimento si fa ricorso alla ricerca di organismi in grado di indicare una situazione potenzialmente pericolosa. 7.1 Organismi Marker Gli organismi marker sono organismi in grado di indicare eventi potenzialmente pericolosi nel corso della produzione, conservazione e distribuzione di un alimento. Essi sono distinti in due gruppi: 1. Organismi INDEX: sono microrganismi patogeni la cui presenza indica la presenza di altri patogeni ecologicamente correlati. La presenza di un organismo index in un alimento può essere ipotizzata dal verificarsi di talune condizioni compositive, chimico-fisiche o epidemiologiche. 2. Organismi INDICATORI: sono organismi non dannosi in se, ma in grado di dare informazioni sulle condizioni microbiologiche generali del prodotto. Gli organismi indicatori possono essere, a loro volta, distinti in due gruppi: a) organismi indicatori della qualità microbiologica (che risultano utili nella valutazione dell idoneità delle condizioni di processo e di conservazione di un alimento); b) organismi indicatori della sicurezza microbiologica (suggeriscono la possibilità di un pericolo di natura microbiologica che può compromettere la salute del consumatore) Indicatori della qualità microbiologica degli alimenti Sono organismi che possono essere usati per valutare la qualità del prodotto con indicazioni sulla idoneità delle condizioni di processo e per predire la shelf life del prodotto e quindi avere indicazioni sulle condizioni di conservazione. Viene suggerito che indicatori ideali dovrebbero avere i seguenti requisiti: - dovrebbero essere presenti e rivelabili in tutti gli alimenti di cui si vuole accertare la qualità; - la loro crescita e il loro numero dovrebbero essere correlati negativamente con la qualità del prodotto; - dovrebbero essere rivelati e numerati in maniera facile e in tempi brevi ed essere chiaramente distinguibili da altri microrganismi; - la loro crescita non dovrebbe essere influenzata negativamente da altri componenti della microflora. Per ogni specifico prodotto è possibile individuare uno o più microrganismi correlati con la qualità del prodotto. In genere, nella maggior parte dei prodotti alimentari, la perdita di qualità non è imputabile ad un 69

71 solo microrganismo, ma piuttosto ad una varietà di microrganismi. Per questo motivo è più pratico determinare il numero di gruppi di microrganismi che più verosimilmente possono fornire indicazioni sullo stato microbiologico e sulle condizioni di processo dell alimento. Tali gruppi di microrganismi sono rappresentati principalmente dal numero di microrganismi aerobi mesofili e dalla famiglia delle Enterobacteriaceae Numero di Microrganismi Aerobi o Conta Batterica Totale. E importante sottolineare che non esiste un terreno nutritivo o condizioni colturali tali da soddisfare le esigenze metaboliche e fisiologiche della complessa e sconosciuta microflora potenzialmente presente in un alimento. La scelta del terreno nutritivo e delle condizioni di incubazione (temperatura e atmosfera gassosa) consentiranno la crescita di alcuni microrganismi non consentendo lo sviluppo di altri. Pertanto, quando si contano i microrganismi in un alimento, il conteggio non dovrebbe essere mai riferito come conteggio vitale totale o, come spesso è indicato questo conteggio, come microflora totale. Ad esempio, quando si parla di Microflora aerobia totale o di Carica microbica totale, in genere, si fa riferimento al numero totale di microrganismi in grado di svilupparsi in aerobiosi e in mesofilia (30 C) in un adatto terreno nutritivo. E evidente che in queste condizioni non è possibile favorire lo sviluppo di tutti i microrganismi presenti, avendo appunto i microrganismi esigenze nutrizionali, di ossigeno, di temperatura ecc. differenti. Modificando le condizioni di incubazione o del substrato nutritivo, è possibile usare il conteggio per ricercare in maniera preferenziale alcuni gruppi di microrganismi come i microrganismi aerobi (o anaerobi) termofili, mesofili e psicrotrofici, i microrganismi proteolitici, i microrganismi lipolitici, i microrganismi sporigeni aerobi o anaerobi ecc. ecc. Di là della terminologia usata, quando si esegue un conteggio microbico è importante specificare il tipo o il gruppo di microrganismi di interesse e le condizioni colturali in cui essi sono determinati. La determinazione più comune del contenuto microbico di un alimento è il conteggio standard in piastra (CSP) anche chiamato conteggio aerobico mesofilo (CAM). Tale conteggio, pur non essendo strettamente correlato con la sicurezza microbiologica di un alimento, può fornire utili indicazioni sul suo stato microbiologico, riflettendo esso la storia produttiva dell alimento stesso, condizionandone lo stato di conservabilità, la comparsa di fenomeni alterativi ed evidenziando le condizioni di trasformazione e di conservazione. Quando si valutano i risultati di un conteggio microbico di un alimento è necessario avere idea della popolazione microbica che ci si aspetta nel punto del processo o della distribuzione in corrispondenza del quale il campione è stato raccolto. Ad esempio, dopo un determinato trattamento tecnologico di cui si conosce l efficacia nel determinare la riduzione del carico microbico iniziale, il conteggio della microflora può mettere in evidenza eventuali anomalie nel processo stesso, consentendo di intervenire con azione correttive. Il conteggio aerobico mesofilo può dunque essere usato per: i) valutare la qualità microbiologica di materie prime e di prodotti finiti; ii) valutare il rispetto delle condizioni igieniche durante il processo di produzione; iii) valutare se la temperatura a cui un alimento deve essere conservato e distribuito sono rispettate; valutare i tempi di conservazione (shelf life) di un alimento; determinare i livelli di contaminazione degli ambienti di processo Procedura di numerazione dei microrganismi aerobi mesofili negli alimenti. Il numero di microrganismi aerobi mesofili è determinato, inoculando il substrato Triptone Glucosio Estratto di lievito, noto anche come Plate Count Agar (PCA: Estratto di lievito 2,5 g; Digerito pancreatico di caseina 70

72 5 g; Glucosio 1 g; Agar 15 g; ph 7,0; Acqua distillata 1000 ml) per inclusione (1 ml) o per distribuzione superficiale (0,1 ml) con diluizioni decimali del campione omogeneizzato. Dopo la semina, le piastre sono incubate aerobicamente a 30 C per 72 ore, condizioni che sono in grado di soddisfare le esigenze dei microrganismi mesofili e di gran parte dei microrganismi psicrotrofici. Per un conteggio specifico dei microrganismi aerobi psicrotrofici le piastre possono essere incubate a 10 C per 7 giorni. Per la determinazione del numero di microrganismi potenzialmente alterativi in alcuni alimenti, il terreno nutritivo scelto deve mimare il più possibile la composizione dell alimento stesso. Così, ad esempio, il conteggio della microflora aerobica mesofila del latte crudo (tenore in germi a 30 C) si determina in PCA a cui si aggiungono 10 g/l di latte scremato in polvere Famiglia delle Enterobacteriaceae. La famiglia delle Enterobacteriaceae è classificata nella sezione 5 del Bergey s Manual of Systematic Bacteriology dedicata ai Batteri gram-negativi anaerobi facoltativi. Fanno parte di questa sezione altre due famiglie quali quella delle Vibrionaceae e quella delle Pasteurellaceae. Le caratteristiche generali della famiglia delle Enterobacteriaceae sono le seguenti: bastoncini gramnegativi (0,3-1,0x1,6-6,0 µm); mobili per flagelli peritrichi o immobili; non sporigeni; anaerobi facoltativi; catalasi positivi (ad eccezione di Shigella dysenteriae sierotipo 1); ossidasi negativi; metabolismo ossidativo e fermentativo (da glucosio e altri zuccheri producono acidi e spesso gas). I generi e le specie che rivestono maggiore importanza nella microbiologia degli alimenti possono essere distinte in tre gruppi: 1) Patogeni sensu stricto : germi invasivi e germi enterotossici; 2) Patogeni opportunisti: provocano malattia quando si riducono le difese dell ospite; 3) Bioindicatori della qualità e della sicurezza microbiologica degli alimenti. Gli enterobatteri di questo gruppo, si ritrovano sia come saprofiti nell ambiente che come componenti della flora commensale dell intestino dell uomo e degli animali (Tabella 7.1). Tabella 7.1 Origine di alcune specie di Enterobatteriaceae rispondenti alla definizione di coliformi POSSIBILE ORIGINE Fecale Acquatica o tellurica Probabilmente non fecale Escherichia Coli Klebsiella terrigena Klebsiella planticola Klebsiella Pneumoniae Enterobacter intermedium Enterobacter agglomerans Klebsiella oxytoca Serratia plymuthica Enterobacter gergoviae Enterobacter cloacae Serratia fonticola Enterobacter sakazakii Enterobacter aerogenes Rhanella acquatilis Hafnia alvei Citrobacter freundii Buttiauxella agrestis Serratia marcescens Citrobacter diversus Serratia liquefaciens Citrobacter amalonaticus Serratia marinorubra Serratia odorifera La famiglia delle Enterobacteriaceae è stata proposta da lungo tempo come gruppo di microrganismi indicatori delle condizioni di processo cui l alimento è sottoposto; la loro presenza può evidenziare eventuali anomalie che si possono verificare nel corso delle varie tecnologie. La quantificazione delle 71

73 Enterobacteriaceae è particolarmente utile come indicatore di processo per quegli alimenti che sono sottoposti a trattamenti tecnologici in grado di controllare i microrganismi patogeni, come trattamenti termici, congelamento prolungato, fermentazioni, additivi. La loro presenza può indicare in questi casi la non corretta applicazione della particolare tecnologia Procedura di numerazione delle Enterobacteriaceae totali negli alimenti. La numerazione delle Enterobacteriaceae totali è fatta seminando per inclusione 1 ml di diluizioni decimali del campione nel terreno nutritivo selettivo e differenziale agarizzato Violet Red Bile Glucose Agar (VRBGA: Estratto di lievito 3 g; Peptone 7 g; Sodio cloruro 5 g; Sali biliari 1,5 g; Glucosio 10 g; Rosso neutro 0,03 g; Cristal Violetto 0,002 g; Agar 12; Acqua distillata 1000 ml; ph 7,4). Avvenuta la solidificazione del substrato, si versa su questo un altro strato di substrato (circa 6-7 ml) al fine di assicurare condizioni anaerobiche favorevoli alla fermentazione del glucosio. L incubazione delle piastre è fatta a 37 C per 24 ore. Le colonie si presentano di colore rosa-rosso, circondate da un alone di colore porpora dovuto alla precipitazione dei sali biliari in ambiente acido. Almeno 4-5 colonie tipiche devono essere confermate come appartenenti alla famiglia, trapiantandole su piastre di Agar nutritivo (AN: Estratto di carne 3 g; Peptone 5 g; Agar 15 g; Acqua distillata 1000 ml; ph 6,8-7,0). Dopo incubazione a C per 24 ore, sulle colonie isolate si determinerà la morfologia, la gram-reazione, la catalasi e l ossidasi Indicatori della sicurezza microbiologica degli alimenti Suggeriscono la possibilità di un pericolo microbiologico. La loro presenza in un alimento o nell acqua fanno sospettare la presenza di microrganismi enterici patogeni. Un buon indicatore di contaminazione dovrebbe avere i seguenti requisiti: - dovrebbero essere consistentemente ed esclusivamente associati alla fonte del patogeno; - dovrebbero essere presenti in numero sufficiente a fornire un accurata stima della loro densità; - dovrebbero essere facilmente rivelati e numerati e chiaramente distinguibili da altri microrganismi; - dovrebbero presentare resistenza a stress ambientali e ai disinfettanti; - dovrebbero essere sempre presenti quando il patogeno di interesse è presente; I gruppi di microrganismi che maggiormente rispondono ai requisiti descritti, e quindi utilizzati come indicatori sono: i coliformi ed Escherichia coli, gli streptococchi fecali (enterococchi) e i clostridi solfitoriduttori Coliformi. Una definizione di organismi classificabili come coliformi è data di seguito. Coliformi (totali): batteri gram-negativi, non sporigeni, anaerobi facoltativi, catalasi positivi, ossidasi negativi (Fam. Enterobacteriaceae), capaci di moltiplicarsi in presenza di sali biliari e di fermentare il lattosio con produzione di acido e gas in 48 h a temperature di C. Coliformi fecali: coliformi che presentano le stesse proprietà anche a 44,5 C. Escherichia coli: coliformi fecali che presentano inoltre le seguenti proprietà al Test IMVC (produzione di indolo da triptofano; reazione positiva al rosso-metile; reazione di Voges-Proskauer negativa; mancata crescita su citrato agar). Al gruppo dei coliformi possono essere ascritti sia enterobatteri il cui habitat è rappresentato esclusivamente dal tratto gastro-intestinale, sia enterobatteri di origine ambientale (Tabella 7.1). 72

74 A parte E. coli, la maggior parte degli organismi definiti come coliformi, hanno prevalentemente una vita saprofitaria ambientale; pertanto la loro presenza in un prodotto alimentare non necessariamente indica una contaminazione di tipo fecale, né tanto meno la presenza di microrganismi patogeni. E. coli è, allo stato attuale, l indicatore di contaminazione fecale più largamente usato, soprattutto per valutare la potabilità dell acqua. Il presupposto è che data l origine intestinale del microrganismo, una sua presenza nell acqua, in materie prime da trasformare o in alimenti da consumare crudi, indichi una contaminazione di natura fecale degli stessi, con potenziale presenza di microrganismi patogeni che condividono con l indicatore lo stesso habitat (intestino) e quindi ugualmente escreti con le feci. Negli alimenti processati, il legame della presenza di E. coli con l ambiente intestinale va valutato più attentamente e non può prescindere da considerazioni legate alle caratteristiche del processo produttivo e all ecologia del microrganismo. La presenza di E. coli in alimenti processati, indica per lo più una non appropriata applicazione della particolare tecnologia o più verosimilmente una ricontaminazione del prodotto post-processo, il più delle volte derivante dall ambiente di processo (attrezzature e utensili contaminati, dal personale o da alimenti crudi), come conseguenza della mancata applicazione delle norme di corretta prassi igienica. In ogni modo l assenza di E. coli da un alimento non necessariamente garantisce l assenza di altri patogeni enterici. In molti alimenti crudi di origine animale un basso numero di E. coli può essere facilmente rinvenuto, data la stretta associazione di questi alimenti con l ambiente animale, con possibilità di contaminazione con materiale fecale Procedura di numerazione dei coliformi e di E. coli negli alimenti. Esistono numerosi metodi per determinare i coliformi ed E. coli negli alimenti e nelle acque, basati sia su conteggi in piastra che mediante MPN. Di seguito descriveremo i metodi più comunemente impiegati Determinazione dei coliformi (totali) con il metodo di inclusione in terreno nutritivo selettivo e differenziale agarizzato. Omogeneizzare il campione in soluzione sale peptone e allestire diluizioni seriali decimali. Seminare 1 ml di ciascuna diluizione in piastre Petri vuote e aggiungere circa 15 ml di terreno nutritivo Agar Cristalvioletto Rosso neutro Bile (VRBA - Violet Red Bile Agar: Estratto di lievito 3 g; Peptone 7 g; Sodio cloruro 5 g; Sali biliari 1,5 g; Lattosio 10 g; Rosso neutro 0,03 g; Cristal Violetto 0,002 g; Agar 15; Acqua distillata 1000 ml; ph 7,4), omogeneizzare mediante rotazioni in maniera da disperdere uniformemente l inoculo e lasciare solidificare; aggiungere quindi altri 5-6 ml dello stesso substrato al fine di creare condizioni anaerobiche per la fermentazione del lattosio. Dopo solidificazione del substrato, le piastre sono incubate capovolte a 30 C per 24 ore. Il terreno VRBA contiene come selettivi i sali biliari e il cristalvioletto la cui azione combinata assicura l inibizione dei batteri gram positivi; la componente differenziale del terreno nutritivo è invece costituita dal lattosio, dalla cui fermentazione sono prodotti acidi organici che abbassano il ph al di sotto del punto di viraggio dell indicatore rosso neutro presente nel mezzo. Come conseguenza della fermentazione del lattosio, le colonie tipiche (diametro di circa 0,5 mm) appariranno colorate dal rosa al rosso intenso, circondate da un alone di colore rosso dovuto alla precipitazione dei sali biliari in ambiente acido Determinazione dei coliformi (totali) con il metodo del Numero più Probabile (MPN). 73

75 Per alimenti solidi, preparare l omogenato dell alimento (diluizione 1:10) in soluzione sale peptone, quindi allestire diluizioni decimali seriali. A seconda della sensibilità voluta, si possono utilizzare diversi schemi di inoculo, impiegando come terreno nutritivo liquido selettivo il Brodo con Bile (2%) e Verde Brillante (Brilliant Green Bile Broth BGBB: Peptone 10 g; Lattosio 10 g; Bile di bue 20 g; Verde brillante 0,0133 g; Acqua distillata 1000 ml; ph 7,4) distribuito in provette munite di campanule di Durham. I selettivi di questo terreno sono la bile e il verde brillante che inibiscono i batteri gram-positivi. Schema di inoculo ,1 ml (per concentrazioni presunte di coliformi variabili da poche cellule ad un massimo di 100 organismi per g o ml): Inoculare 3 tubi contenenti BGBB a doppia concentrazione * ciascuno con 10 ml della diluizione 1:10 (corrispondenti a inoculi di 1 g di campione per tubo); Inoculare 3 tubi contenenti BGBB a concentrazione normale ciascuno con 1 ml della diluizione 1:10 (corrispondenti a inoculi di 0,1 g di campione per tubo); Inoculare 3 tubi contenenti BGBB a concentrazione normale ciascuno con 1 ml della diluizione 1:100 (corrispondenti a inoculi di 0,01 g di campione per tubo). * Per evitare l eccessiva diluizione del substrato, con conseguente perdita delle sue proprietà nutritive, selettive e differenziali, lo stesso va preparato doppio concentrato, cioè sciogliendo il doppio dei componenti nello stesso volume di acqua richiesto per la preparazione del terreno alla concentrazione normale; la concentrazione usuale verrà ristabilita con l inoculo di 10 ml della diluizione 1:10. I tubi sono incubati a 30 C per 48 ore; sono considerati positivi i tubi che presentano sviluppo di gas nelle campanule di Durham. Dalla combinazione dei tubi positivi, si risale al MPN/g leggendo il valore sulle apposite tavole. Schema di inoculo 1 0,1 0,01 ml (per concentrazioni presunte di coliformi da poche cellule fino ad un migliaio di organismi per g o ml): Inoculare 3 tubi contenenti BGBB a concentrazione normale ciascuno con 1 ml della diluizione 1:10 (corrispondenti a inoculi di 0,1 g di campione per tubo); Inoculare 3 tubi contenenti BGBB a concentrazione normale ciascuno con 1 ml della diluizione 1:100 (corrispondenti a inoculi di 0,01 g di campione per tubo); Inoculare 3 tubi contenenti BGBB a concentrazione normale ciascuno con 1 ml della diluizione 1:1000 (corrispondenti a inoculi di 0,001 g di campione per tubo). Le condizioni di incubazione e la lettura dei risultati sono come per lo schema di inoculo precedente. Quando la concentrazione di coliformi non è prevedibile, si dovranno allestire diluizioni più spinte. Il numero di coliformi determinato con il metodo descritto sopra è da considerarsi presuntivo, a causa della possibile presenza di risultati falsamente positivi, dovuti alla possibilità di sviluppo di microrganismi non coliformi (sempre gram negativi ma ossidasi positivi come Aeromonas, Pasteurella ecc.) in grado di produrre gas da lattosio in presenza di sali biliari e verde brillante. E dunque necessario procedere alla conferma dei risultati, come di seguito illustrato. Da ciascuna delle provette risultate positive nella prova presuntiva, si striscia un ansata di coltura su una piastra di Agar Eosina Bleu di Metilene (EMBA: Peptone 10 g; Lattosio 10 g; Fosfato bipotassico 2 g; Eosina Y 0,4 g; Bleu di Metilene 0,065 g; Agar 15 g; Acqua distillata 1000 ml; ph 6,8). Il terreno nutritivo 74

76 contiene selettivi che inibiscono la crescita di batteri gram negativi e ossidasi positivi. Dopo incubazione delle piastre a 32 C per 24 ore, le colonie di coliformi si presenteranno di colore scuro con aspetto metallico verde iridescente se osservate con luce riflessa. Almeno due colonie caratteristiche cresciute su quest ultimo substrato vanno trapiantate, contemporaneamente, in una provetta munita di campanula di Durham e contenente come terreno nutritivo il Brodo Lattosato (LB: Estratto di carne 3 g; Peptone 5 g; Lattosio 5 g; Acqua distillata 1000 ml; ph 6,9) per confermare, dopo incubazione a 30 C per 24 ore la produzione di gas da lattosio e su una piastra di Agar Nutritivo, per confermare, sulle colonie cresciute dopo 24 ore di incubazione a 30 C, la presenza di bastoncini gram negativi, catalasi positivi e ossidasi negativi. Sulla base dei risultati ottenuti è possibile confermare o meno l MPN presuntivo Determinazione dei coliformi fecali (Escherichia coli presuntivo) con il metodo del Numero più Probabile (MPN). Da ciascuna delle provette di BGBB risultate positive per i coliformi totali, si inoculano una provetta di BGBB e una provetta di Acqua Triptonata (Triptone 10 g; NaCl 5 g; Acqua distillata 1000 ml; ph 7,2). Entrambi i terreni sono incubati a 44,5 C per 48 ore. Annotare l eventuale produzione di gas nei tubi di BGBB, mentre nella provetta contenente Acqua triptonata si ricerca la produzione di indolo da triptofano, aggiungendo 1 ml di Reattivo di Kovacs (Paradimetilaminobenzaldeide 5 g; Alcool isoamilico 75 ml; HCl concentrato 75 ml). In presenza di indolo, entro pochi minuti si avrà una colorazione rosa-rossa sulla superficie del brodo. Per calcolare il numero di coliformi fecali o di E. coli presuntivo si confermano o meno i risultati MPN della prova presuntiva per coliformi totali Conferma del numero di Escherichia coli. Da ciascuno dei tubi di BGBB risultati positivi nella ricerca di coliformi fecali si striscia una piastra di EMBA. Dopo incubazione delle piastre a 32 C per 24 ore, le colonie di coliformi si presenteranno di colore scuro con aspetto metallico verde iridescente se osservate con luce riflessa. Almeno 2 colonie caratteristiche cresciute su quest ultimo substrato vanno trapiantate, contemporaneamente, in una provetta contenente Brodo Lattosato per confermare, dopo incubazione a 30 C per 24 ore la produzione di gas da lattosio e su una piastra di Agar Nutritivo, per confermare, sulle colonie cresciute dopo 24 ore di incubazione a 30 C, la presenza di bastoncini gram negativi, catalasi positivi e ossidasi negativi. Gli isolati su Agar Nutritivo, riferibili ai coliformi, sono sottoposti alle seguenti prove: Test del Rosso metile e test di Voges Proskauer: si inocula un ansata di coltura in Brodo Glucosato Tamponato (Peptone 7 g; Fosfato dipotassico 5 g; Glucosio 5 g; Acqua distillata 1000 ml; ph 7,5) che è incubato a 37 C. Dopo due giorni di incubazione si prelevano, trasferendoli in una provetta vuota, circa 2 ml di coltura a cui si aggiungono in successione 0,5 di una soluzione di alfa-naftolo al 5% in alcool etilico e 0,5 ml di una soluzione acquosa di KOH al 40%, per valutare la reazione di Voges-Proskauer. La positività del test è indicata dallo sviluppo, entro 30 minuti, di una colorazione rosa-rossa sulla superficie del brodo. Dopo altri 3 giorni di incubazione, alla restante parte della brodocoltura si aggiungono circa 0,5 ml di una soluzione allo 0,02% di rosso metile in una miscela costituita da 6 parti di alcool etilico e 4 parti di acqua distillata. La positività del test è indicata dal mantenimento della colorazione rossa del substrato (ph della brodocoltura inferiore a 4,5). Una colorazione gialla indica, invece, negatività del test. 75

77 Crescita su Agar Citrato di Simmons per valutare l utilizzazione del citrato come unica sorgente di carbonio: (SCA: Magnesio solfato 0,2 g; Ammonio fosfato biacido 1 g; Fosfato di potassico 1 g; Sodio citrato 2 g; Sodio cloruro 5 g; Blu di bromotimolo 0,08 g; Agar 15 g; Acqua distillata 1000 ml; ph 7.) Il terreno, solidificato a becco di clarino (agar-slant), viene strisciato con la coltura in esame. Dopo incubazione a 37 C per 48 ore, l avvenuta utilizzazione del citrato si manifesta con una variazione di colore del substrato dall originale verde al blu intenso, come conseguenza della produzione di sostanze alcaline. Escherichia coli produce indolo da triptofano, è positivo al test Rosso metile, è negativo al test Voges- Proskauer e non cresce su Agar Citrato (Test IMVC:++--). Sulla base dei risultati ottenuti è possibile confermare o meno l MPN presuntivo Esempio di numerazione dei coliformi, dei coliformi fecali e di Escherichia coli con il metodo MPN. Campione da analizzare: latte crudo. a) Coliformi (totali): prova presuntiva Schema di inoculo: 1 0,1-0,01 0,001 ml. Inoculare 3 tubi contenenti BGBB a concentrazione normale ciascuno con 1 ml del campione di latte (corrispondenti a inoculi di 1 ml di campione per tubo); Inoculare 3 tubi contenenti BGBB a concentrazione normale ciascuno con 1 ml della diluizione 1:10 del campione di latte (corrispondenti a inoculi di 0,1 ml di campione per tubo); Inoculare 3 tubi contenenti BGBB a concentrazione normale ciascuno con 1 ml della diluizione 1:100 del campione di latte (corrispondenti a inoculi di 0,01 ml di campione per tubo); Inoculare 3 tubi contenenti BGBB a concentrazione normale ciascuno con 1 ml della diluizione 1:1000 del campione di latte (corrispondenti a inoculi di 0,001 ml di campione per tubo). Incubazione: 30 C per 48 ore. Lettura dei risultati: si considerano positivi i tubi che presentano accumulo di gas nelle campanule di Durham. Supponiamo di ottenere i seguenti risultati: 3 tubi positivi nella diluizione 10 0 ; 3 tubi positivi nella diluizione 10-1 ; 2 tubi positivi nella diluizione 10-2 ; 2 tubi positivi nella diluizione In corrispondenza del numero caratteristico 322, sulla tavola di Mc Crady si ritrova un MPN di 20. Considerando che la diluizione limite è la 10-1, allora l MPN/ml di coliformi è pari a 200 (20x10). b) Coliformi (totali): prova di conferma Da ciascuna delle provette risultate positive nella prova presuntiva, cioè: 3 tubi alla diluizione tubi alla diluizione tubi alla diluizione tubi alla diluizione 10-3 strisciare un ansata di coltura su una piastra di Agar Eosina Bleu di Metilene (in totale 10 piastre). Incubazione delle piastre: 32 C per 24 ore. Lettura delle piastre: le colonie di coliformi si presenteranno di colore scuro con aspetto metallico verde iridescente se osservate con luce riflessa. Supponiamo che tutte le piastre presentino colonie rispondenti a queste caratteristiche. Almeno due colonie caratteristiche cresciute su ciascuna piastra vanno 76

78 trapiantate, contemporaneamente, in una provetta di Brodo Lattosato (in totale 20 provette) per confermare la produzione di gas da lattosio e su una piastra di Agar Nutritivo (in totale 20 piastre) per confermare, sulle colonie cresciute dopo 24 ore di incubazione a 30 C, la presenza di bastoncini gram negativi, catalasi positivi e ossidasi negativi. Dopo incubazione dei tubi e delle piastre a 30 C per 24 ore, supponiamo di avere i seguenti risultati: Colonie su EMB Provette di BL Caratteristiche dell isolato su Agar Nutritivo (diluizione) N Produzione di gas 1a; (10 0 ) 1a + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 1b; (10 0 ) 1b + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 2a; (10 0 ) 2a + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 2b; (10 0 ) 2b + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 3a; (10 0 ) 3a + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 3b; (10 0 ) 3b + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 1a; (10-1 ) 1a + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 1b; (10-1 ) 1b + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 2a; (10-1 ) 2a + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 2b; (10-1 ) 2b + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 3a; (10-1 ) 3a + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 3b; (10-1 ) 3b + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 1a; (10-2 ) 1a + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 1b; (10-2 ) 1b + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 2a; (10-2 ) 2a + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 2b; (10-2 ) 2b + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 1a; (10-3 ) 1a + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 1b; (10-3 ) 1b + Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (-) 2a; (10-3 ) 2a - Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (+) 2b; (10-3 ) 2b - Bastoncino gram (-); catalasi (+); ossidasi (+) Sulla base dei risultati ottenuti è possibile confermare o meno il MPN presuntivo. Come si può notare non tutte le provette risultate positive nella prova presuntiva sono state confermate nella prova di conferma (infatti, le colonie caratteristiche cresciute su EMB e provenienti dalla provetta 2 del BGBB alla diluizione 10-3, non risultavano appartenere al gruppo dei coliformi, per mancata produzione di gas da lattosio e per le loro caratteristiche tassonomiche preliminari). Il nuovo numero caratteristico sarà dunque pari a 321 a cui corrisponde un MPN/ml di coliformi pari a 150 (15x10). c) Coliformi fecali o Escherichia coli presuntivi Da ciascuna delle provette risultate positive nella prova presuntiva per coliformi, cioè: 3 tubi alla diluizione tubi alla diluizione tubi alla diluizione

79 2 tubi alla diluizione 10-3 si inoculano una nuova provetta di BGBB e una provetta di Acqua Triptonata (AT). Incubazione delle provette di BGBB e AT: 44,5 C per ore. Lettura dei risultati: annotare l eventuale produzione di gas nei tubi di BGBB, mentre nella provetta contenente Acqua triptonata si ricerca la produzione di indolo da triptofano, aggiungendo 1 ml di Reattivo di Kovacs. In presenza di indolo, entro pochi minuti si avrà una colorazione rosa-rossa sulla superficie del brodo. Supponiamo di avere i seguenti risultati: diluizione N di provette di BGBB positive a 30 C N di provette di BGBB positive a 44,5 C N di provette positive per l indolo Il nuovo numero caratteristico sarà dunque pari a 310 a cui corrisponde un MPN/ml di coliformi fecali o meglio di Escherichia coli presuntivo pari a 45 (4,5x10). d) Conferma del numero di Escherichia coli. Da ciascuno dei tubi di BGBB risultati positivi nella ricerca di coliformi fecali si striscia una piastra di EMBA (in totale 4 piastre). Incubazione: 32 C per 24 ore. Lettura delle piastre: le colonie di coliformi si presenteranno di colore scuro con aspetto metallico verde iridescente se osservate con luce riflessa. Supponiamo che tutte le piastre presentino colonie rispondenti a queste caratteristiche. Almeno due colonie caratteristiche cresciute su ciascuna piastra vanno trapiantate, contemporaneamente, in una provetta di Brodo Lattosato (in totale 8 provette) per confermare la produzione di gas da lattosio e su una piastra di Agar Nutritivo (in totale 8 piastre) per confermare, sulle colonie cresciute dopo 24 ore di incubazione a 30 C, la presenza di bastoncini gram negativi, catalasi positivi e ossidasi negativi. Dopo incubazione dei tubi e delle piastre a 30 C per 24 ore, gli isolati su Agar Nutritivo in grado di produrre gas da lattosio in LB, riferibili ai coliformi, sono sottoposti alle prove del Rosso metile, di Voges Proskauer e di Crescita su Agar Citrato di Simmons. Supponiamo di avere per le 8 colonie saggiate i seguenti risultati: positività al test Rosso metile; negatività alla reazione di Voges Proskauer; mancata crescita su Agar citrato. Tutte le 8 colonie rispondono alle caratteristiche di E. coli (IMVC:++--), per cui il MPN/ml di Escherichia coli sarà pari a 45 (4,5x10), confermando il risultato presuntivo Numerazione di Escherichia coli su substrati cromogenici o fluorogenici E. coli, tra tutti i coliformi è l unico a presentare l enzima β-glucuronidasi. Sono stati pertanto studiati dei terreni nutritivi in cui si utilizzano sostanze in grado di rilevare l attività β-glucuronidasi. Tali sostanze possono essere fluorogeniche come il MetilUmbelliferil-D-Glucuronide (MUG) che per azione della β- 78

80 glucuronidasi di E coli libera metilumbelliferone, un composto che alla luce UV a corta lunghezza d onda (366 nm) fluoresce in azzurro. La numerazione con composti fluorogenici si esegue mediante la tecnica MPN, incorporando il fluorogeno in un terreno selettivo liquido come il BGBB già citato prima. Le provette che presentano sviluppo di gas dopo incubazione a 37 C per vanno osservate sotto luce UV per la presenza di fluorescenza azzurro brillante. Data la possibile interferenza di alcuni componenti selettivi del substrato sulla produzione dell enzima da parte delle cellule e per il mascheramento della fluorescenza dal colore dello stesso substrato, risulta più accurato utilizzare il saggio di fluorescenza come test di conferma. In questo caso si determina il MPN di E. coli presuntivo in BGBB seconda la tecnica descritta in precedenza. Dalle provette positive si trasferisce un aliquota del brodo in provette contenenti come terreno nutritivo il Brodo Laurilsolfato Triptosio (LST: Triptosio 20 g; Lattosio 5 g; Cloruro di sodio 5 g; Potassio fosfato monoacido 2,75 g; Potassio fosfato biacido 2,75 g; Sodio laurilsolfato 0,1 g; Acqua distillata 1000 ml; ph 7,0) aggiunto di MUG. Dopo incubazione a 37 C, dopo 4 ore e quindi ogni ora fino ad un massimo di ore, si osserva l eventuale comparsa di fluorescenza azzurra. Dai risultati di questa prova si conferma o meno il MPN presuntivo. Il composto fluorescente MUG può essere incorporato anche in terreni nutritivi agarizzati come il VRBA. Le piastre, dopo inoculo e incubazione vanno osservate sotto luce UV, dove le colonie di E. coli mostrano aloni di fluorescenza di colore azzurro. Tra i composti cromogenici si utilizza il 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucuronide che per azione enzimatica libera 5-bromo-4-cloro-3-indolo il quale è assorbito dalle cellule microbiche le cui colonie sul substrato assumono una colorazione blu/verde. Un esempio di substrato cromogenico è rappresentato dal Triptone Bile X-Glucuronide (TBX: Triptone 20 g; Sali biliari n 3 1,5 g; X-glucuronide 0,075 g; Agar 15 g; Acqua distillata 1000 ml; ph 7,2). Le piastre contenenti il terreno nutritivo, una volta inoculate con aliquote di diluizioni decimali seriali del campione, sono incubate a 30 C per 4 ore e per ulteriori 18 ore a 44 C. Si contano tutte le colonie di colore blù-verde, esprimendo il risultato come UFC/g o ml di campione Il Kligler Iron Agar (KIAgar): un esempio di terreno nutritivo per la differenziazione degli enterobatteri in base alla loro capacità di fermentare il glucosio ed il lattosio con e senza produzione di gas e di produrre idrogeno solforato Composizione Componenti g/litro di acqua distillata Lab-Lemco (estratto di carne) 3,0 Estratto di lievito 3,0 Peptone 20,0 Sodio cloruro 5,0 Lattosio 10,0 Glucosio 1,0 Ferro citrato 0,3 Sodio tiosolfato 0,3 Rosso fenolo 0,05 Agar 12,0 ph 7,4 ± 0,2 79

81 Preparazione. Sospendere tutti i componenti in 1 litro di acqua distillata. Riscaldare a bagnomaria bollente sino a completa soluzione. Mescolare e distribuire in provette. Sterilizzare in autoclave a 121 C per 15 minuti. Lasciare solidificare il terreno a becco di clarino con una parte di fondo alta circa 2,5 cm. Tecnica. Strisciare la superficie del terreno nutritivo ed infiggere sino al fondo della provetta una colonia prelevata da un substrato di primo isolamento del microrganismo. Lettura e interpretazione dei risultati. Dopo aver incubato a 37 C al massimo per ore, si possono registrare tre reazioni sul substrato: 1. Utilizzazione dei carboidrati. 1A Reazione sulla superficie inclinata: acidità (colore giallo); alcalinità (color rosso); 1B Reazione di profondità (fondo del tubo): acidità (colore giallo) alcalinità: color rosso. 2. Produzione di gas: presente (bollicine o rottura dell agar); assente. 3. Produzione di H 2S: annerimento di tutto il terreno o della parte più profonda. Le diverse reazioni registrabili sul substrato dipendono dal rapporto tra glucosio e lattosio e dal rapporto di questi ultimi con la quantità di peptone: glucosio 1 g, lattosio 10 g e peptone 20 g. La rilevazione della fermentazione degli zuccheri è dovuta al diverso bilanciamento tra metaboliti acidi (derivanti dalla fermentazione degli zuccheri) e metaboliti alcalini (proteine). Quando è fermentato solo il glucosio, l acido prodotto fa virare solo il fondo del tubo (condizioni anaerobiche), mentre in superficie il tubo resta rosso, perché i metaboliti alcalini sono preponderanti. Quando è fermentato il lattosio, tutto il tubo diventa giallo; questo perché il lattosio è presente in concentrazione 10 volte superiore al glucosio, per cui i metaboliti acidi diventano preponderanti su quelli alcalini. Quindi, registrare nell ordine: la reazione sulla superficie inclinata, la reazione in profondità, la produzione di gas e la produzione di H 2S, interpretando i risultati come riportato di seguito: Superficie di color rosso/fondo color giallo: fermentazione del solo glucosio; Superficie di color giallo/fondo color giallo: fermentazione del glucosio e del lattosio; Superficie di color rosso/fondo color rosso: nessuna fermentazione; Annerimento di tutto il terreno o della parte più profonda: Produzione di H 2S. Tabella Reazioni presentate da alcuni enterobatteri sul KIA Microrganismo Superficie Fondo Gas H 2S Shigella sonnei Rossa Gialla - - Shigella dysenteriae Rossa Gialla - - Salmonella typhi Rossa Gialla - + Salmonella spp. Rossa Gialla + + Enterobacter spp. Rossa Gialla + - Klebsiella spp. Gialla Gialla + - Escherichia coli Gialla Gialla + - Proteus mirabilis Rossa Gialla - + Morganella spp. Rossa Gialla v - Citrobacter freundii Gialla Gialla + + Yersinia spp. Rossa Gialla v - v: reazione variabile; +: reazione positiva; -: reazione negativa Streptococchi fecali (enterococchi) Gli streptococchi sono batteri di forma coccica, le cui cellule formano catene lunghe da due a decine di elementi, Gram positivi, catalasi negativi, ossidasi negativi, non sporigeni, con metabolismo 80

82 omofermentativo e capaci di crescere in presenza di sali biliari. La classificazione degli streptococchi è in continua evoluzione ed è tuttora controversa. Al gruppo sono ascritti i generi Streptococcus, Lactococcus ed Enterococcus. Gli streptococchi, sulla base dei loro antigeni somatici, sono classificati in gruppi dalla A alla O (gruppi di Lancefield). Le specie del genere Enterococcus (a cui appartengono, tra le altre, specie come E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. avium) appartengono al gruppo antigeno-specifico D; tuttavia questo gruppo antigenico è comune anche ad alcune specie del genere Streptococcus, come S. bovis e S. equinus. Altre caratteristiche fisiologiche di interesse tassonomico degli enterococchi furono stabilite da Sherman negli anni 40 e riguardano la loro capacità di svilupparsi in brodo incubato a 10 e a 45 C, la capacità di svilupparsi in brodo contenente il 6,5% di NaCl e in brodo a ph 9,6. Anche queste caratteristiche non sono esclusive delle specie del genere Enterococcus essendo esse possedute anche da altre specie come Streptococcus bovis e Streptococcus agalactiae. Dato il loro frequente isolamento dalle feci di umani e animali, a questo gruppo di batteri fu attribuito il nome di streptococchi fecali e il significato di indicatori di contaminazione fecale di acqua e alimenti. Numerose ricerche sull ecologia e sulla sistematica di questo gruppo di microrganismi hanno evidenziato che essi non si rinvengono esclusivamente nel tratto intestinale, mostrando una grande diffusione nell ambiente grazie alla loro notevole resistenza in condizioni, anche le più stressanti, che in genere risultano sfavorevoli per altri microrganismi. Pur rappresentando gli enterococchi, ancora oggi, un buon indicatore per stabilire la potabilità dell acqua, il loro impiego come indicatori di contaminazione fecale di alcuni alimenti fermentati è più discutibile. Accettabile rimane ancora il loro uso come indicatori di ricontaminazioni post-processo per prodotti che abbiano subito trattamenti tecnologici inattivanti i microrganismi (calore, essiccazione, congelamento prolungato ecc.). Alcune importanti caratteristiche di questo gruppo di microrganismi indicatori sono rappresentate da una loro alta resistenza ai trattamenti di sanificazione delle superfici e degli impianti; da una buona resistenza all acidità (sopravvivono a ph di 3,5-4,0 per diverse settimane), alle temperature di congelamento (si inattivano lentamente, potendo resistere per anni) e ai processi di essiccazione. Inoltre gli enterococchi sono termodurici (presentano tempi di riduzione decimale (D) a 63,5 C compresi tra 5 e 30 minuti), sono psicrotrofici (sviluppano a temperature minime di 2-8 C), sono in grado di svilupparsi in presenza di concentrazioni di NaCl comprese tra 7 e 10% (corrispondenti a valori di attività dell acqua (a w) di 0,92-0,92) Procedura di numerazione degli enterococchi negli alimenti Dopo aver preparato l omogenato dell alimento e le diluizioni seriali decimali secondo le modalità solite, si possono seminare aliquote delle stesse su o in diversi terreni nutritivi selettivi e differenziali agarizzati. Uno tra i più utilizzati, con le caratteristiche di crescita delle colonie, è riportato di seguito, mentre la numerazione degli streptococchi fecali nelle acque potabili con il metodo MPN è riportata nel paragrafo 7.4. Terreno colturale Agar Kanamicina Esculina Azide (KAA: Triptone 20 g; Estratto di lievito 5 g; Sodio cloruro 5 g; Sodio citrato 1 g; Esculina 1 g; Citrato ammoniacale di ferro 0,5 g; Solfato di Kanamicina 0,02 g; Sodio azide 0,15 g; Agar 15 g; Acqua distillata 1000 ml). Il terreno contiene come agenti selettivi l azide sodica (che, alle concentrazioni usate, inibisce la maggior parte dei batteri Gram negativi) e l antibiotico Kanamicina che ostacola lo sviluppo di stafilococchi. La componente differenziale del terreno è costituita dall esculina (glucoside incolore) che viene ridotta ad esculetina (derivato agliconico) che reagisce con i sali di ferro formando un complesso ferro-fenolico di colore nero. Le piastre con il terreno 81

83 solidificato, dopo essere state seminate in superficie con 0,1 ml di ciascuna diluizione del campione, sono incubate a 37 C per ore. Le colonie caratteristiche, di circa 2-3 mm di diametro, si presenteranno di colore scuro e circondate da un alone marrone-nero dovuto alla riduzione dell esculina ad esculetina. Lo stesso terreno nutritivo, privato dell agar, può essere utilizzato per numerare basse concentrazioni di enterococchi con la tecnica MPN. La positività dei tubi sarà valutata, dopo incubazione delle provette a 37 C per 24 ore, dall annerimento del brodo dovuto all idrolisi dell esculina. In ogni caso è bene procedere alla conferma delle colonie presuntivamente considerate come enterococchi, mediante agglutinazione con antisieri gruppo-specifico D e mediante prove morfologiche (cocchi in coppia o catene Gram positivi), biochimiche (assenza dell enzima catalasi) e fisiologiche (crescita in brodo a 45 C dopo 48 ore di incubazione, crescita in brodo contenente il 6,5% di NaCl dopo 72 ore di incubazione a 37 C). 7.5 Clostridi solfito riduttori Con la denominazione di clostridi solfito-riduttori si intende un gruppo di batteri di forma bastoncellare, Gram positivi, sporigeni, anaerobi, in grado di ridurre i composti ossidati dello zolfo (solfiti) a idrogeno solforato (solfuro). Crescono in un range di temperatura compreso tra 0 e 50 C, mentre sono incapaci di crescere a ph inferiore a 5. Al gruppo appartengono sia specie patogene per l uomo e gli animali, come C. perfringens, che specie responsabili di alterazioni putrefattive degli alimenti come C. bifermentans, C. putrificum, C. paraputrificum, C. baratii, C. celatum, C. roseum, C. novyi ed altre ancora Procedura di numerazione delle spore di clostridi solfitoriduttori negli alimenti Si prepara l omogenato dell alimento nel modo consueto; circa 10 ml di questa diluizione si trattano a 80 C per 10 minuti per eliminare le forme vegetative dei batteri, lasciando inalterate le spore. Dopo rapido raffreddamento, si allestiscono le diluizioni decimali seriali successive. Aliquote di 1 ml di ciascuna diluizione saranno trasferite in piastre sterili vuote a cui sono aggiunti ml di terreno nutritivo mantenuto fluido a C. Come terreno nutritivo può essere usato, tra gli altri, l Agar Triptosio Solfito Cicloserina (TSC: Triptosio 15 g; Estratto di lievito 5 g; Peptone di soia 5 g; Estratto di carne 5 g; Citrato ammoniacale di ferro 1 g; Metabisolfito di sodio 1 g; Agar 14 g; Acqua distillata 1000 ml. Al substrato sterile e mantenuto fluido a 50 C si aggiungono 10 ml di una soluzione al 5% dell antibiotico D-cicloserina sterilizzata per filtrazione). Dopo aver disperso uniformemente l inoculo nel terreno nutritivo, si lascia solidificare, quindi si versano sulla superficie del terreno solidificato altri 7-8 ml dello stesso terreno fluido, per assicurare migliori condizioni anaerobiche. L incubazione delle piastre avviene a 37 C per in giare per anaerobiosi. Le colonie di clostridi solfito riduttori appaiono di colore nero, con un diametro di 3-7 mm. Spesso nel terreno sono presenti colonie incolori o colonie puntiformi di colore nero che non vanno considerate nel conteggio Parametri microbiologici per la potabilità dell acqua Decreto del Presidente della Repubblica 24 maggio 1988, n 236. Attuazione della direttiva CEE n 80/778 concernente la qualità delle acque destinate al consumo umano, ai sensi dell art. 15 della legge 16 aprile 1987, n

84 PARAMETRI LIMITI Conteggio delle colonie su Agar per 1 ml a 36 C <10 a 22 C <100 Coliformi totali per 100 ml Assenti Coliformi fecali per 100 ml Assenti Streptococchi fecali per 100 ml Assenti Clostridi solfito riduttori per 100 ml Assenti Conteggio delle colonie su agar per 1 ml a 36 e a 22 C. Seminare in Agar-germi aliquote da 1 ml dei campioni in 6 piastre di Petri. Utilizzare l Agar per il conteggio delle colonie (Plate Count Agar: Estratto di lievito 2,5 g; Digerito pancreatico di caseina 5 g; Glucosio 1 g; Agar 15 g; ph 7,0; Acqua distillata 1000 ml). Incubare 3 piastre a 36 +/- 1 C per 48 ore e 3 piastre a 22 C per 3 giorni. Contare le colonie rilevando il valore medio per ogni 3 piastre e riportare il valore come colonie per ml di campione. Coliformi totali per 100 ml: metodo MPN Seminare almeno un matraccio con 50 ml ed una serie di 5 tubi con 10 ml campione per ciascun tubo di brodo lattosato (Estratto di carne 3 g; Peptone 5 g; Lattosio 5 g; Acqua distillata 1000 ml; ph 6,9) doppio concentrato. Incubare a 36 +/- 1 C per ore. I tubi positivi (presenza di gas) devono essere sottoposti a conferma in brodo lattosio bile verde brillante (Peptone 10 g; Lattosio 10 g; Bile di bue 20 g; Verde brillante 0,0133 g; Acqua distillata 1000 ml; ph 7,4) a 36 +/- 1 C per ore. Sulla base della positività su tale terreno (produzione di gas), riportare il valore come MPN/100ml. Coliformi fecali per 100 ml: metodo MPN I tubi positivi di brodo lattosato devono essere sottoposti a conferma in tubi di EC broth (g/litro di acqua distillata: Peptone 20; Lattosio 5; Sali biliari 5; Sodio cloruro 5; Potassio fosfato monoacido 4; Potassio fosfato biacido 1,5; ph 6,8 ± 0,2. Sistemare nella provetta una campanula di Durham) per 24 ore a 44,5 +/- 0,2 C in bagnomaria. Sulla base della positività su tale terreno (produzione di gas) riportare il valore MPN/100 ml di campione. Streptococchi fecali per 100 ml: metodo MPN Seminare almeno un matraccio con 50 ml ed una serie di 5 tubi con ml 10 ml campione per ciascun tubo di Azide Dextrose Broth (g/litro di acqua distillata: Peptone 20; Destrosio 5; Sodio cloruro 5; Potassio fosfato monoacido 2,7; Potassio fosfato biacido 2,7; Sodio azide 0,2; ph 6,8 ± 0,2) doppio concentrato. I tubi positivi (torbidi) devono essere sottoposti a conferma in tubi di Ethyl Violet Azide Dextrose Broth (g/litro di acqua distillata: Peptone 20; Destrosio 5; Sodio cloruro 5; Potassio fosfato monoacido 2,7; Potassio fosfato biacido 2,7; Sodio azide 0,3; Violetto di etile 0,0005; ph 6,8 ± 0,2) per ore a 36 +/- 1 C. Leggere i tubi positivi (torbidi con deposito porpora sul fondo). Riportare il valore MPN/100 ml di campione. 83

85 Spore di clostridi solfito riduttori Distribuire il campione da esaminare in 10 provettoni nella quantità di circa 12 ml per provettone. Immergere i provettoni in bagnomaria a 80 C per 10 minuti. Raffreddare rapidamente sotto acqua corrente. Seminare in ragione di ml 10 per tubo in 10 tubi di terreno al solfito di sodio già predisposto (g/litro di acqua distillata: Estratto di carne 10; Peptone 10; Glucosio 20; Sodio cloruro 5; Agar 20; ph 7,4. Distribuire 20 ml per tubo e sterilizzare a 121 C per 20 minuti. Al momento dell uso si fa fluidificare il terreno e vi si aggiunge il seguente supplemento:1 ml di soluzione al 2,5% di solfito di sodio anidro e 0,2 ml di una soluzione al 5% di citrato di ferro. Queste due soluzioni vanno sterilizzate per filtrazione e preparate al momento dell uso. Servono da indicatori della riduzione del solfito). Raffreddare sotto acqua corrente e incubare a 36 C +/- 1 C per ore. Contare le colonie nere di almeno mm 3 di diametro. Riportare il valore a ml 100 di campione. Tabella per il calcolo del numero più probabile (MPN) di coliformi e streptococchi fecali nelle acque Quantità di acqua seminata per ogni beuta e per tubo ml 50 ml 10 Numero più probabile/100 ml di campione Numero di tubi positivi >16 84

86 8 Schemi generali delle operazioni di laboratorio SCHEMA A FASI PER LA NUMERAZIONE DEI MICRORGANISMI PROCEDIMENTO Iniziare le operazioni il più presto possibile dopo il prelievo del campione. I campioni congelati vanno fatti scongelare nel loro contenitore di origine mantenendoli per circa 18 ore in frigorifero alla temperatura di +2/+5 C. Preparazione del campione e delle diluizioni decimali seriali CAMPIONE Conservare in condizioni refrigerate la parte in eccesso del campione per eventuali ulteriori indagini pesare o misurare una quantità n di campione solido in una busta da stomacher addizionare una quantità 9 x n di diluente (vedi appendice A) e omogeneizzare (diluizione madre 1/10 o 10-1 ) diluizioni decimali successive (vedi schema B e C) Semina su o in terreno solido o liquido conteggio standard di cellule vitali su o in terreno nutritivo solido inoculo in piastra e incubazione (vedi schema D) numero più probabile di microrganismi (MPN) in terreno nutritivo liquido inoculo delle provette e incubazione (vedi schema F) numerazione delle colonie (vedi schema E) determinare il MPN (vedi schema F) 85

87 SCHEMA B FASI PER LA PREPARAZIONE DELLE DILUIZIONI DECIMALI DI UN CAMPIONE ALIMENTARE SOLIDO pesare n g di alimento in sacchetto sterile aggiungere 9 x n di diluente sterile ALIMENTO solido OMOGENEIZZARE Diluizione 10-1 = 0,1 g/ml 1 ml = 0,1 g Trasferire con pipetta sterile da 1 ml 1 ml = 0,01 g 1 ml = 0,001 g 1 ml = 0,0001 g 1 ml = 0,00001 g Diluente 9 ml Diluente 9 ml Diluente 9 ml Diluente 9 ml Diluente 9 ml Diluizione 10-2 = 0,01 g/ml Diluizione 10-3 = 0,001 g/ml Diluizione 10-4 = 0,0001 g/ml Diluizione 10-5 = 0,00001 g/ml Diluizione 10-6 = 0, g/ml 86

88 SCHEMA C FASI PER LA PREPARAZIONE DELLE DILUIZIONI DECIMALI DI UN CAMPIONE ALIMENTARE LIQUIDO 1 ml 1 ml = 0,1 ml 1 ml = 0,01 ml 1 ml = 0,001 ml 1 ml = 0,0001 ml WATER Diluente 9 ml Diluente 9 ml Diluente 9 ml Diluente 9 ml Diluente 9 ml Diluizione 10-1 = 0,1 ml/ml Diluizione 10-3 = 0,001 ml/ml Diluizione 10-5 = 0,00001 ml/ml Diluizione 10-2 = 0,01 ml/ml Diluizione 10-4 = 0,0001 ml/ml 87

89 SCHEMA D SEMINA IN (per inclusione) O SU (distribuzione superficiale) TERRENO NUTRITIVO AGARIZZATO DI DILUIZIONI DECIMALI DI UN CAMPIONE ALIMENTARE SOLIDO Preparare il campione come descritto nello Schema B 1 ml = 0,1 g 1 ml = 0,01 g 1 ml = 0,001 g 1 ml = 0,0001 g Diluente 9 ml Diluente 9 ml Diluente 9 ml Diluente 9 ml Diluizione 10-1 Diluizione 10-2 Diluizione 10-3 Diluizione 10 4 Diluizione ml = 0,1 g 1 ml = 0,01 g 1 ml = 0,001 g 1 ml = 0,0001 g 1 ml = 0,00001 g Inoculo per inclusione Inoculo in superficie 0,1 ml = 0,01 g 0,1 ml = 0,001 g 0,1 ml = 0,0001 g 0,1 ml = 0,00001 g 0,1 ml = 0, g

90 SCHEMA E CALCOLO DEL NUMERO DI MICRORGANISMI SVILUPPATI SU TERRENO NUTRITIVO SOLIDO Scartare le piastre che presentano crescita diffusa sulla superficie (> di 300 colonie). Prendere in considerazione le piastre che contengono almeno 15 colonie in caso di terreno nutritivo selettivo e almeno 30 in caso di terreno nutritivo non selettivo e meno di 300. Annotare il numero di colonie contate sulle piastre di due diluizioni successive, calcolando il numero di colonie per grammo o ml di prodotto con la seguente formula: N= C V(n 1 +0,1n 2 )d N = Numero Microrganismi/g o ml C = somma delle colonie nelle piastre considerate V = Volume dell inoculo in ml n 1 = numero di piastre considerate per la prima diluizione n 2 = numero di piastre considerate per la seconda diluizione d = fattore di diluizione della prima diluizione considerata Si consideri l esempio riportato di seguito (E1). 89

91 Francesco Villani Manuale di Laboratorio di Microbiologia degli Alimenti SCHEMA E1- Esempio di numerazione dei microrganismi DILUIZIONE 10-1 > di 300 colonie DILUIZIONE 10-2 > di 300 colonie2 DILUIZIONE 10-3 > di 300 colonie DILUIZIONE 10-4 > di 300 colonie DILUIZIONE 10-5 Colonie numerabili (es.: 168 e 215 colonie) N= (2+0,1x 2) 10-5 DILUIZIONE 10-7 Colonie numerabili (es.: 14 e 25 colonie) = 1,9x107 Unità Formanti Colonie (UFC)/g o ml Più semplicemente il calcolo delle UFC può essere determinato sommando il valore medio del numero di colonie contato nelle quattro piastre (avendo cura di riferire i numeri alla stessa diluizione) moltiplicandolo per il fattore di diluizione ( /4= 193,25 x 105 che approssimando sarà 1,9x107 UFC/g o ml). 90