costituiscono una importante risorsa alimentare ed economica del nostro Paese, Sardegna compresa

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3 costituiscono una importante risorsa alimentare ed economica del nostro Paese, Sardegna compresa sono prodotti alimentari particolarmente apprezzati da molti consumatori ma ad elevato rischio sanitario

4 Elevata capacità di filtrazione dell acqua (2-4 l/h) Elevata capacità di concentrazione nei propri tessuti inquinanti di varia natura (batteri, virus, parassiti, microalghe tossigene, metalli pesanti, PCB, diossine ecc..) Il consumo di MBV viene da sempre associato a patologie umane quando non provengono dal circuito produttivo e commerciale ufficiale

5 La legislazione comunitaria vigente prescrive per i MBV prima della loro immissione nel circuito commerciale per il consumo umano, il soddisfacimento di requisiti sanitari di natura microbiologica, biotossicologica, chimica e fisica molto stringenti E.coli, Salmonella spp Biotossine algali (PSP, DSP. ASP, Palitossine, ecc.) metalli pesanti, diossine, PCB

6 non esistevano dati epidemiologici riferibili alla loro eventuale presenza nei MBV presenti negli allevamenti regionali in assenza di dati di laboratorio non era possibile applicare l approccio di valutazione del rischio previsto dalla legislazione comunitaria, in questo caso VR da protozoi zoonosici nelle produzioni regionali l IZS non disponeva di metodi di detection con elevati livelli di sensibilità e specificità, basati su metodologie molecolari

7 Molluschicoltura europea: 635 mila tonnellate di prodotto immesse ogni anno sul mercato per un valore di 867 milioni di euro (Eurostat 2009) In Italia, la molluschicoltura è basata sull'allevamento di mitili (Mytilus galloprovincialis e M. edulis) e vongola verace (Tapes philippinarum), con produzioni rispettivamente pari a 98 mila e 33 mila tonnellate per un valore di 68 e 138 milioni di euro (API, 2011) L'allevamento di cozze e vongole rappresenta il 70% della produzione nazionale di acquacoltura, pari al 17% di quella europea (l Italia è il terzo produttore europeo dopo Spagna e Francia)

8 allevamenti: circa 180 (2011, dati Min. Salute), di cui circa 90 dislocati in zone di produzione di tipo A, e i rimanenti in zone di produzione di tipo B banchi naturali gestiti da imprese/consorzi: 135 (2011, dati Min. Salute), di cui 47 in zone di produzione di tipo A, 85 in zone di tipo B e 3 in zone di tipo C

9 o 118 CDM o 378 CSM lavaggio, cernita, confezionamento, etichettatura Gli stabilimenti di MBV necessitano di riconoscimento comunitario (Reg. 853/04, art.4) rilasciato dalla Regione di competenza e registrato nel sistema «SINTESI stabilimenti» che aggiorna costantemente l elenco degli stabilimenti riconosciuti in ambito UE

10 allevamenti di mitili dislocati principalmente nelle province di Olbia-Tempio, Oristano, Cagliari e Ogliastra Golfo di Olbia: organizzazione di Produttori (OP), progetti di valorizzazione del prodotto locale, tra cui la richiesta del marchio di origine IGP

11 Imprese : circa 30 (14 OL, 3 STeod, 1 CPTort, 1 Fer Col, 8 SGilla, 1 SGS, 1 SASantadi, 1 SC la Sulc, 1 CPA) Addetti : oltre 450 Zone di produzione classificate: 19 (3 A, 16 B) Stabilimenti: 11 CDM, 16 CSM Produzione annuale: ton circa Valore economico: 20 mil euro circa (SARDEGNA AGRICOLTURA/LAORE, 2009)

12 La mitilicoltura regionale concentra gran parte della produzione e della commercializzazione all inizio del periodo estivo nel periodo autunno-inverno è frequente il riscontro di prodotti provenienti da allevamenti del Nord Italia o importati dalla Spagna, mentre nel periodo primavera-estate è presente in genere prodotto importato dalla Grecia La maggior parte degli allevamenti della Sardegna ricade in zone di produzione di classe B (Reg. CE 854/2004)

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15 Legislazione comunitaria (Reg. CE 853/04, 854/04, 2073/05, 2074/05, 1881/06) controlli per la verifica della idoneità al consumo: ricerca di batteri di origine fecale (Salmonella spp, E.coli), biotossine algali (PSP, DSP, ASP), inquinanti chimici (metalli pesanti, diossine ecc..) Non è attualmente prevista dalla normativa comunitaria la verifica della eventuale presenza di virus (norovirus, epatite A), altri batteri patogeni (alcuni vibrioni), protozoi zoonosici

16 Oltre a contaminanti biologici ampiamente conosciuti (batteri patogeni, virus, microalghe) anche protozoi parassiti di interesse zoonosico possono essere riversati, attraverso reflui zootecnici, urbani o acque di dilavamento, nelle acque superficiali e nelle zone costiere marine o lagunari utilizzate per l allevamento dei MBV

17 Tra i diversi agenti parassitari la cui presenza è strettamente associata ad acqua e alimenti contaminati da materiale fecale di origine umana e/o animale, i protozoi Criptosporidium Giardia Toxoplasma costituiscono gli agenti zoonosici più importanti

18 o Protozoi enterici di animali selvatici, da reddito e da compagnia o distribuzione cosmopolita o trasmissione orofecale (acqua e/o cibo contaminati) o responsabili di gravi forme diarroiche o potenziali agenti zoonosici (es. Giardia intestinalis, genotipi A1 e B; Cryptosporidium parvum (genotipo bovino)

19 o Coccide appartenente al Phylum degli Apicomplexa o Attualmente riconosciute 16 specie

20 Ciclo biologico diretto

21 o Phylum Metamonadida, famiglia Hexamitidae o Attualmente riconosciute 6 specie Specie Giardia duodenalis (G. intestinalis/g. lamblia) Giardia agilis Giardia muris Giardia ardeae Giardia psitaci Giardia microti Ospite Vari animali domestici e selvatici/uomo Anfibi Roditori, uccelli, rettili Uccelli Uccelli Topo muschiato e arvicola

22 2 trophozoites released per cyst Multiply by binary fission every 12 h Sucking disc used for attachment Cyst forms in transit to colon

23 Diffusione: elevato n. di (oo)cisti eliminate con le feci da ospiti infetti (i vitelli giovani possono eliminare fino a 100 milioni oocisti di Cryptosporidium/g di feci; ) straordinaria resistenza delle forme cistiche alle più svariate condizioni ambientali e a numerosi disinfettanti (vengono inattivate a 65 C, ma resistono per mesi alla temp. di refrigerazione ed ai trattamenti di clorazione) bassa dose media infettante (compresa tra 25 e 100 cisti per Cryptosporidium e <10 per Giardia)

24 L infezione si trasmette all ospite per ingestione di cisti (Giardia) ed oocisti (Cryptosporidium) presenti sul terreno, nell acqua o in cibi contaminati da feci sintomatologia clinica: diarrea acquosa, nausea, vomito, crampi addominali; più grave nei soggetti immunocompromessi epidemiologia: in Italia prevalenza 2-6,5% (giardiasi); 75% dei donatori di sangue presenta anticorpi anti- Cryptosporidium

25 è dovuta a: o inquinamento dei fiumi con reflui urbani e zootecnici o contaminazione degli ambienti marini e di diversi organismi viventi presenti negli estuari e nelle aree costiere o notevole resistenza delle (oo)cisti di Cryptosporidium e Giardia nell ambiente acquatico (2 mesi 1 anno) o accumulo nei molluschi bivalvi

26 1.acquisizione di dati epidemiologici sulla eventuale presenza di protozoi di interesse zoonosico nei MBV allevati e commercializzati in Sardegna 2.messa a punto di metodiche biomolecolari sensibili, specifiche e rapide 3.contributo alla Valutazione del Rischio

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28 1095 Mytilus galloprovincialis 240 Crassostrea gigas

29 Zone di campionamento

30 Golfo di Olbia: Mytilus galloprovincialis (n. 675) n. 495 prelevati in allevamento Seno Cocciani Cala Saccaia Isola Cavallo Scoglio di Mezzocammino Foci del Padrongianus

31 Golfo di Olbia: Mytilus galloprovincialis (n. 675)

32 Golfo di Oristano: Mytilus galloprovincialis (n. 420) Foce Tirso n. 40 prelevati in allevamento Golfo Oristano

33 Arborea: Mytilus galloprovincialis (n. 420)

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35 1. identificazione dei campioni 2. invio al Laboratorio a temperatura controllata (2-5 C) 3. preparazione dei pools (15±2 mitili, 4±1 ostriche)

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37 I II III IV

38 V VI VII

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40 Ziehl-Neelsen modificata: evidenzia le componenti acido-resistenti presenti nelle oocisti di Cryptosporidium caratterizzata dalla presenza di un agente decolorante meno aggressivo rispetto alla tecnica tradizionale per bacilli acido resistenti le oocisti di Cryptosporidium appaiono di colore rosso-viola e il materiale restante sullo sfondo viene ricolorato in tonalità chiare di verde Auramina O: si basa sulla fluorescenza dell Auramina che si lega alla parete cistica alcol-acido resistente di Cryptosporidium Le oocisti, di 4-6 µm di diametro, osservate al microscopio a fluorescenza, si presentano di colore verde brillante su sfondo scuro

41 Nero Clorazolo di Kohn: o Le cisti ellittiche di Giardia (12 x 8µm) appaiono di colore grigio scure ed evidenti le strutture dei nuclei Colorazione con Lugol : o Le cisti di Giardia (12 x 8µm) appaiono di colore giallobruno, risultano evidenti le strutture dei corpi mediani ed i nucle

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43 Criptosporidium sp.: amplificazione di un frammento di 298 bp del rdna che codifica per il 18S rrna Giardia sp. Amplificazione di un tratto di 432 bp del gene gdh, codificante la glutammato deidrogenasi

44 Individuazione allevamento bovino con criptosporidiosi reperimento gatto infetto da giardiasi prelievo feci bovine e feline purificazione/concentrazione delle (oo)cisti isolamento branchie e epatopancreas da pool di 20 esemplari di M. galloprovincialis contaminazione omogenato purificazione/concentrazione delle (oocisti) su 1 controllo positivo e 1 controllo negativo 1 µl

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46 Ha consentito: La visualizzazione della morfologia delle oocisti di Cryptosporidium sp. e delle cisti di Giardia sp. precedentemente estratte Cryptosporidium sp. Giardia sp. la verifica dell integrità delle strutture in esse presenti

47 Ha consentito: La messa a punto delle biomolecolari metodiche l identificazione, per mediante PCR, dei protozoi zoonosici bp 432 bp 298 Cryptosporidium sp. M Giardia sp. M M M Lanes: M Molecular weigth marker VIII 1-3 Controlli positivi; 4-6 Controlli negativi. Lanes: M Molecular weigth marker VIII 1-2; 4-5; 7-8; Controlli positivi; Controlli negativi.

48 Esemplari di MBV esaminati: 1095 Mytilus galloprovincialis 240 Crassostrea gigas In nessuno degli esemplari esaminati è stata riscontrata la presenza di (oo)cisti di Cryptosporidium sp. e Giardia sp. in branchie e ghiandola digestiva (epatopancreas) con l utilizzo di metodiche tradizionali, IF e PCR.

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50 Precedenti studi, effettuati in acque italiane, hanno evidenziato la presenza di: Cryptosporidium sp. in molluschi bivalvi veneridi provenienti dalle coste del Mare Adriatico raccolti ad una distanza di circa 500 metri dalla foce di fiumi (Giangaspero et al., 2004; Molini et al., 2004; Traversa et al., 2004) Cryptosporidium sp. e Giardia sp in mitili (M. galloprovincialis) provenienti dalla Sacca di Scardovari in Alto Adriatico, zona lagunare sita nel Delta del Po e, per il solo Cryptosporidium, nel Messinese (Berrilli F., 2008)

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52 il mancato riscontro di (oo)cisti potrebbe essere legato : o alla bassa densità di allevamenti di bovini insistenti nella zona o conseguente scarsità di reflui zootecnici nelle acque affluenti al golfo

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54 Valutazione rischio sanitario: è attualmente molto basso nelle zone di allevamento oggetto della presente indagine non può essere considerato del tutto assente in altre aree sulle quali non sono stati condotti accertamenti

55 Monitoraggio a seguito di : 1. aumento del numero delle aziende zootecniche nelle aree che insistono sulla fascia costiera presa in esame 2. pressione demografica crescente e conseguente incremento degli scarichi urbani verso il mare 3. eventi piovosi di particolare intensità e durata, soprattutto a seguito di periodi prolungati più o meno siccitosi Prevenzione 1. controllo della diffusione di parassiti intestinali (Cryptosporidium e Giardia) nelle aziende zootecniche della Sardegna

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57 Giudizio positivo della Commissione 1.acquisizione di dati epidemiologici sulla ministeriale sugli obiettivi raggiunti: eventuale presenza di protozoi di interesse 1. zoonosico dati epidemiologici nei sulla MBV Sardegna allevati e commercializzati in Sardegna 2. allestimento nuovi metodi di laboratorio più 2.messa specifici a e punto sensibili di metodiche biomolecolari sensibili, specifiche e rapide 3. contributo alla Valutazione del Rischio 3.contributo alla Valutazione del Rischio

58 comunicazione XXII Convegno Nazionale Associazione Italiana Veterinari Igienisti (AIVI), 2012 Premio miglior comunicazione scientifica del settore ittico, pubblicazione su Eurofishmarket

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60 Qualora il legislatore, nell ambito della analisi del rischio, ritenga opportuno inserire tra i controlli sanitari anche la ricerca dei protozoi zoonosici sui MBV, l IZS è in grado di far fronte alla richiesta

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