Sequenze ripetute vegetali

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1 Sequenze ripetute vegetali

2 FAMIGLIE MULTIGENICHE Organizzazione di geni in famiglie multigeniche Es. proteine riserva, rbcs, leghemoglobine, etc Eventi di formazione: duplicazioni, mutazioni, amplificazioni, crossing over ineguale Piante più tolleranti verso amplificazione ed alti numeri di copie inoltre sono molto tolleranti verso la poliploidia Espressione differenziale dei vari membri della famiglia genica. Regolazione della trascrizione o dello splicing. Famiglie spesso contengono pseudogeni

3 Arabidopsis contains 41 described gene families family Kinesins ABC superfamily Lipid metabolism ABC transporters Major intrinsic protein AAAP family Miscellaneous Antiporters MYB Aquaporins Myosins Calcineurin-like B calcium sensors NADPH P450 reductases CHO esterase Nodulin-like CBL-int. S-T Pkases Org. solute co-transporters CW biosynthesis Phospholipase D Chor./Mit. Polysaccharide lyase Cyt P450 Pollen coat proteome Cyt. B5 Primary pumps (ATPases) Cytoskeleton Receptor kinase-like Euk. init. Factors SNARE interacting prot. Expansins Other SNARES Glycoside hyhydrolase Syntaxins Glycosyltransferase Trehalose biosynthesis Hsfs WRKY transcription factors Inorg. solute co-trans. Xyloglucan fucosyltransferase Ion channels

4 rdna Geni trascritti da diverse RNA polimerasi Pol I trascrive 18S, 5,8S e 25S, organizzati in una sola unità policistronica processata nel nucleo dopo la sintesi in nucleolo. 10milioni di ribosomi per cellula richiedono un'intensa attività di sintesi. spacer - 18S - 5,8S - 25S - spacer - 18S - etc ripetuta molte volte in tandem Mais: fino a copie per genoma, tutte poste su un solo cromosoma. frumento: su cromosomi diversi Lo spacer esterno contiene il promotore dell'unità, gli enhancers ed il terminatore che servono per due unità contigue. Pol II trascrive i piccoli RNA che servono per lo splicing snrnas, anche'essi organizzati in famiglie multigeniche disperse nel genoma provviste di promotori abbastanza 'normali' (TATA).

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10 Pol III trascrive altri RNA (trna, 4,5S e 5S) e la caratteristica è la presenza di promotori all'interno del gene. 5S RNA: 5000 copie per genoma, organizzate in tre tandem arrays multigenici formati da unità: spacer - 120nt per 5S RNA - spacer trna: dispersi nel genoma Il 'promotore' è localizzato nel gene, chiamato ICR (internal control region), consta di elementi conservati posti bp a vale del sito di inizio della trascrizione. Le porzioni corrispondenti agli RNA strutturali sono molto conservate mentre gli spacer mostrano variabilità e polimorfismo.

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13 Sequenze ripetute Possono rappresentare una buona porzione del genoma completo rdna, sequenze 'specializzate', sequenze ripetute non codificanti localizzate, sequenze ripetute disperse codificanti (trasposoni) e non (pseudogeni). Seq. specializzate: TELOMERI - stabilizzano le estremità dei cromosomi, sono molto conservati e sono formati da ripetizioni di sequenze simili a TTAGGG ripetute in tandem, per migliaia di copie (2-5kbp in Arabidopsis, fino a 160kbp in tabacco). Enzima responsabile: telomerasi, che aggiunge le unità ripetute fornendo un templato a RNA per la replicazione del DNA.

14 Telomerasi Enzima indispensabile per il metabolismo dei telomeri Uomo: solo presente in cellule in continua divisione (ematopoietiche ed epidermide, per es.), nella linea germinale e negli stadi embrionali. La mancanza di T nelle altre cellule causa senescenza ed invecchiamento. Piante: Non esiste una linea germinale definita e la plasticità delle cellule è molto maggiore (totipotenza). Le T sono comunque anche nelle piante presenti quasi esclusivamente in cellule in divisione e sono silenti nei tessuti differenziati. A differenza degli animali, però, possono essere riattivate durante lo sdifferenziamento in vitro per dare il callo. Mutanti privi di T Si osservano aberrazioni cromosomiche dovute alla fusione delle estremità dei cromosomi, progressivo accorciamento dei cromosomi e successivo arresto della crescita (senescenza).

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16 Variabilità in lunghezza: tra le specie, le varietà e i singoli individui di una varietà, durante lo sviluppo di una singola pianta Le variazioni sono più tollerate nelle piante rispetto agli animali. Accorciamento legato a senescenza e danni ai cromosomi

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19 CENTROMERI zona di attacco (indiretto) per i microtubuli durante segregazione dei cromosomi. Molto conservati, evidenti citologicamente. Molto studiati in lievito, meno conosciuti in animali e piante. Formati da ripetizioni di frammenti di nt lunghe anche 1000kbp. Arab. elemento ripetuto di 180bp, presente in ogni centromero, che fa parte della schiera di unità ripetute che lo compongono. Nucleo centrale ripetuto - fiancheggiato da seq. meno intensamente ripetute e poi da zone ad alto tasso di ricombinazione e ricche in trasposoni.

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23 Seq. rip. non codificanti localizzate DNA satellite/tandem DNA repeats Diversa mobilità in gradienti di CsCl a causa di un diverso contenuto in GC. Con DNA satellite si fa riferimento a qualunque popolazione di DNA con una diversa densità rispetto al resto del DNA. Monomeri da fino a bp. Si trova di solito in regioni eterocromatiniche, attorno ai centomeri e vicino ai telomeri. Non è trascritto in RNA. Consiste di brevi sequenze ripetute molte volte con lo stesso orientamento e di solito senza sequenze spacer. Sono variabili in termini di lunghezza e numero di unità, in termini di sequenza, e in profilo di distribuzione tra specie diverse. Si pensa svolgano un ruolo nella stabilizzazione del cromosoma e nel funzionamento del centromero.

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26 MICROSATELLITI: unità di 1-5 nt ripetute in tutto il genoma, In animali molto frequenti Ricchi in AC/TC In piante 10x meno frequenti Ricchi in AT 1 repeat ogni 33kbp Facilmente evidenziabili con PCR, molto polimorfiche, neutrali, alta ricombinazione, codominanti. Ipervariabilità dovuta ad errori durante replicazione. Molto utili in piante dove si sono rivelati marcatori molto informativi.

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31 MINISATELLITI Repeats di unità di almeno 9nt fino a 30 nt, organizzate in lunghi segmenti ipervariabili. Le mutazioni in lunghezza sono dovute a ricombinazione e a crossing over ineguale che espandono o contraggono le dimensioni del repeat. Sono organizzate in segmenti di unità ripetute presenti in più loci nel genoma. Questi segmenti si ritrovano soprattutto in zone pericentromeriche, sub telomeriche.

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34 Sequenze ripetute disperse codificanti Capacità di muoversi da un locus ad un altro del genoma, capacità di amplificarsi durante la trasposizione Divise in due classi: Classe II: si muovono sotto forma di DNA, Ac/Ds, En/Spm, Mutator, MITE Classe I: retrot, si muovono con intermedio a RNA retrotrascritto a DNA,

35 Trasposoni classe II Possono essere lunghi poche centinaia fino a basi e contenere dei geni codificanti per enzimi necessari alla trasposizione Sono identificati da Terminal Inverted Repeats (11-2/300nt) e questo consente di classificarli nelle varie famiglie Ac, En, etc. Queste TIR sono specificamente riconosciute dall'enzima trasposasi codificato da alcuni membri della famiglia. Altri membri sono deleti o mutati e possono attivarsi solo grazie a trasposasi fornite in trans.

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37 La trasposasi riconosce le TIR, excide l'elemento e lo integra in altri punti del genoma in modo indipendente da omologia di sequenza. Il locus lasciato può venir riparato mediante riligazione (excisione netta) o mediante ricombinazione con cromatidio fratello (excisione non netta).

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39 Spesso però rimangono nel sito brevi tratti di sequenze (ripetute o meno) o si verificano delezioni che impediscono comunque la reversione della mutazione.

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41 Molto diffusi nelle piante e spesso presenti in specie differenti anche se spesso molto più abbondanti in alcune specie

42 Causano mutazioni instabili anche somatiche. Si inseriscono preferenzialmente in regioni attive del genoma, spesso non metilate. Possono causare: rotture cromosomiche, riarrangiamenti, mutazioni, alterazioni nel profilo di espressione, amplificazioni. Possono contenere forti promotori che influenzano sequenze fiancheggianti. Barbara McClintock studiando il mais evidenziò un elemento che poteva 'dissociare' frammenti di cromosoma (Ds). Sono di per sè molto variabili e mutano con alta frequenza. La loro attività dipende da parecchi fattori (tessuto, sviluppo, fattori ambientali). Sono però soggetti a due meccanismi di controllo: autospegnimento e silenziamento genico. a) autospegnimento perchè sono molte di più le forme delete o mutate di quelle intere. In mais per 1 copia di Ac attiva ce ne sono centinaia inattive Ds. b) silenziamento mediato da meccansimi della pianta: metilazione e condensazione cromatina.

43 Kernels on a maize ear show unstable phenotypes due to the interplay between a transposable element (TE) and a gene that encodes an enzyme in the anthocyanin (pigment) biosynthetic pathway. Sectors of revertant (pigmented) aleurone tissue result from the excision of the TE in a single cell. The size of the sector reflects the time in kernel development at which excision occurred.

44 Classe I: retrot Sequenze disperse nel genoma che si replicano mediante un intermedio a RNA retrotrascritto. Identificati prima in animali e lievito, ma sono ubiquitari. La loro duplicazione non comporta excisione, ma solo amplificazione mediata da RT, quindi le mutazioni causate da retro-t sono stabili e non revertono come quelle dei trasposoni di classe II. Rappresentano una grossa porzione del genoma, soprattutto nelle piante con grandi genomi (70% in mais).

45 4 tipi diversi identificati nelle piante divisibili in elementi privi di LTR elementi con LTR Non-LTR elements: LINE (long interspersed elements, >5kbp): sembrano un mrna integrato nel genoma con coda polya (NON e uno pseudogene), con capacità di codificare: gag: packaging pol: RTpol en: endonucleasi per integrazione? Molto eterogenei e variabili anche perché la RT fa molti errori o si ha precoce terminazione.

46 SINE, short interspersed elements: elementi più corti (qualche centinaio di bp). Molto abbondanti in animali (Alu elements), meno frequenti in piante. Sono copie retrotrascritte di trna e snrna (prodotti dalla RNA Pol III), contengono coda polya o AT-rich. Non codificano per RT o altri enzimi, non sono autonomi. Contengono il promotore al loro interno, quindi ogni copia può essere funzionale ed essere trascritta. La maggior parte però è inattiva o silente. Distribuzione non casuale: si ritrovano soprattutto organizzati in gruppi di sequenze presenti in più punti nei cromosomi. Integrazione su copie preesistenti?

47 LTR-elements Elementi con LTR (long terminal repeats). Lunghi circa 5 kbp. Molto più abbondanti degli altri. Contengono delle sequenze terminali ripetute e dirette. Si pensa siano derivati da LINE che hanno acquisito le LTR in un secondo memento. Hanno potenzialità codificante: RT, gag, int (integrazione). Es. copia, gypsy, simili a struttura di RT di Drosophila. Diversi per ordine dei geni.

48 Simili a T presenti in altri organismi e a retrovirus animali (che in più contengono una proteina di involucro ENV).

49 Ciclo: attivazione, trascrizione in RNA mediata da elementi localizzati nelle LTR, sintesi proteine, retrotrascrizione, reintegrazione in nuovo sito del genoma. La classificazione dei retrot è abbastanza difficile. A parte la differenza con o senza LTR e copia/gypsy non si evidenzia una specificità di azione, che è invece tipica dei T di classe II. Gli enzimi RT/int sembra che possano agire in trans su altri elementi. No differenziazione in base alla funzione, si fa su base strutturale 50% di omologia di sequenza.

50 Sono molto abbondanti e sono stati ritrovati in zone intergeniche, in introni o sequenze promotrici, in zone eterocromatiniche, pericentromeriche. Primi responsabili dell'espansione dei genomi nelle piante. Piccoli genomi: contengono poche sequenze ripetute in grandi blocchi (satelliti, centromeri, telomeri e zone collegate). Grandi genomi: molte sequenze ripetute disperse in più (LTR retro-t, soprattutto spezzati e mutati).

51 Vengono spesso attivati in condizioni di stress o in particolari stadi di sviluppo. Vengono tenuti a bada da meccanismi di silenziamento genico e di inattivazione. E stato visto che le LTR contengono elementi di attivazione trascrizionale in particolari condizioni di crescita e manipolazione (protoplastizzazione, ferita, etc) simili ad elementi propri di geni endogeni espressi nelle stesse condizioni. Manipolazioni in vitro o attacchi di patogeni si è visto sono capaci di indurre la trasposizione e quindi la creazione di nuove mutazioni. Importante risvolto applicativo i retrot o le semplici LTR fuse a geni noti potrebbero essere usati come dei marcatori genomici per studiare gli effetti di stress biotici ed abiotici.

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