La spettroscopia EPR

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1 La spettroscopia EPR

2 Metodi Chimici Gli intermedi radicalici nelle reazioni chimiche sono di solito così altamente reattivi da precludere la loro individuazione o il loro isolamento attraverso metodi fisici. La loro momentanea esistenza può essere d altronde d accertata intrappolandoli con dei reagenti per i quali essi hanno un alta affinità e con i quali essi si combinano per dare prodotti stabili che possano poi essere isolati ed identificati. Ad esempio l aggiunta l di toluene ad una reazione radicalica permette al radicale intermedio di strappare ad esso un atomo di idrogeno per formare il persistente benzil radicale, che vive nel sistema reagente fino a quando non dimerizza per formare il difeniletano o altri prodotti identificabili. Se tali prodotti non vengono isolati si può ipotizzare che non ci siano intermedi radicalici anche se la loro presenza non può comunque essere esclusa.

3 Metodi Chimici Abbastanza frequentemente la natura dei prodotti di reazione ci dàd un indizio sulla presenza o meno di intermedi radicalici.. Le reazioni omolitiche di solito danno origine ad una gran varietà di prodotti che si formano per estrazione, addizione, dimerizzazione,, frammentazione, ecc. e attraverso una attenta analisi dei prodotti i radicali coinvolti possono spesso essere identificati. La natura omolitica di una reazione può anche essere spesso dedotta da evidenze di catalisi o di inibizione. Se l addizione l di sostanze capaci di produrre radicali (ad esempio perossidi) o l applicazione l di luce ultravioletta,, che dàd origine a radicali attraverso la rottura omolitica dei legami, accelera la reazione è possibile che un meccanismo attraverso dei radicali liberi sia operante. Al contrario l addizione l di inibitori che riducono la concentrazione dei radicali reagenti rallenterà o inibirà le reazioni radicaliche.. Inibitori di questo tipo sono di solito sostanze che contengono atomi di idrogeno reattivi (come ad esempio i fenoli o le ammine aromatiche).

4 EPR Uno dei metodi spettroscopici più usato e conosciuto per l individuazione l di radicali è la spettroscopia di risonanza di spin elettronico (EPR o ESR) La spettroscopia di risonanza di spin elettronico è una tecnica che permette lo studio di radicali liberi stabili o persistenti. Essa permette inoltre lo studio di specie radicaliche transienti che si formano nel corso di una reazione.

5 Basi teoriche Come sappiamo l'elettrone è una particella subatomica, che possiede una certa massa ed una certa carica, dotata di un movimento di rotazione attorno a se stessa che viene chiamato spin (trottola). Tale spin può essere uguale ad ½ o a -½ a seconda del verso in cui ruota l elettrone. l A causa della sua rotazione l'elettrone genera un campo magnetico.

6 Nel caso in cui l elettrone l venga sottoposto ad un campo magnetico esterno l energia l dei due stati di spin,, che in condizioni normali sono degeneri, viene modificata a causa dell interazione del campo magnetico esterno con quello generato dall elettrone. Splitting dei livelli di spin di un elettrone in presenza di un campo magnetico.

7 La differenza di energia che si viene a creare tra i due stati di spin è uguale a: dove: ΔE E = g E β E è il campo magnetico applicato, β E è una costante detta magnetone di Bohr (9,2733 x erg/gauss) g E è un numero adimensionale che per l elettrone libero vale 2,0023 e che per gli elettroni in atomi o in molecole (cioè non isolati) ha un valore che dipende dall intorno dell elettrone.

8 Quando l elettrone l è esposto ad una radiazione elettromagnetica appropriata la cui frequenza ν soddisfa la condizione di risonanza: hν = g E β E = E a - E b sono possibili transizioni tra i due livelli energetici cioè gli elettroni possono assorbire o emettere energia per passare da uno stato all altro. altro.

9 Allo stesso modo irradiando l elettrone l con una radiazione di frequenza ν costante, e variando la forza del campo magnetico applicato si può raggiungere il valore che soddisfa la condizione di risonanza. Quando tale condizione è soddisfatta, le transizioni degli elettroni da uno stato all altro altro possono avere luogo in entrambe le direzioni dando luogo ad assorbimento (E b E a ) o ad emissione (E( a E b ) di energia.

10 Il sistema nel suo complesso assorbirà o emetterà energia a seconda della direzione del maggior numero di transizioni, e poiché le due transizioni hanno la stessa probabilità di avvenire, la popolazione dei due livelli a e b ha un importanza determinante. Si avrà così assorbimento solo quando la popolazione del livello più basso è più grande di quella del livello più alto. La legge di distribuzione di Boltzman predice un leggero eccesso di popolazione nel livello più basso per cui di solito si avrà assorbimento anche se molto piccolo.

11 A causa dei bassi livelli di assorbimento che di solito vengono ottenuti, per aumentare l intensità del segnale registrabile nella tecnica EPR si usa registrare lo spettro di assorbimento come derivata prima. i) Segnale EPR (assorbimento) ottenuto a frequenza costante e intensità del campo variabile; ii) Derivata prima del segnale di assorbimento EPR.

12 Strumentazione Uno spettrometro EPR consiste di: un elettromagnete, il quale permette di variare con continuità il campo magnetico applicato un generatore di radiazioni elettromagnetiche che emette microonde in un campo molto ristretto di frequenze una cella portacampioni un rilevatore che permette di misurare l entitl entità dell assorbimento subito dalla radiazione elettromagnetica. I segnali forniti dal rilevatore vengono registrati in funzione dell intensit intensità del campo magnetico.

13 Radicali organici Nello stato fondamentale dei composti organici stabili, sia gli orbitali interni che quelli di legame sono occupati ognuno da due elettroni che differiscono solo per il valore di M s (gli elettroni si dicono accoppiati e si indicano generalmente con il simbolo ). Lo stato di un sistema è un singoletto in quanto ha molteplicità* 1 ed è diamagnetico. * Un singoletto è una molecola con un'unica funzione d'onda e che non ha elettroni spaiati. Un doppietto e un tripletto hanno funzioni d'onda che possono essere scritte in due e tre modi, rispettivamente come conseguenza della presenza di uno o due elettroni spaiati. In generale il numero di elettroni spaiati corrisponde alla molteplicità della molecola.

14 Radicali organici Nel caso in cui una molecola organica abbia un orbitale occupato da un solo elettrone spaiato, allora esso si troverà in uno stato di doppietto e sarà paramagnetica dando luogo ad uno spettro EPR. Il paramagnetismo di tali molecole deriva quasi esclusivamente dallo spin dell'elettrone spaiato, cosicché i loro valori di g e (o più semplicemente g) differiscono solo di poco da quello tipico dell'elettrone libero (2,0023).

15 Radicali organici Nei radicali organici l elettrone l può interagire con il nucleo dell atomo in cui si trova e con i nuclei adiacenti dando origine ad un insieme di assorbimenti. Il segnale EPR ben risolto di un radicale organico può contenere anche più di cento linee ed è per questo che si parla di spettri EPR. La complessità degli spettri dipende dall interazione dell'elettrone spaiato con i nuclei con numero quantico di spin nucleare non nullo presenti nel radicale.

16 Momento magnetico nucleare Analogamente al caso dell'elettrone infatti, anche i nuclei degli atomi possono possedere un momento magnetico nucleare che dipenderà dal numero di neutroni e di protoni che contengono. Esso sarà associato al numero quantico di spin nucleare I. I

17 Valori di I I = multipli dispari di ½ per nuclei che possiedono un numero di massa dispari: 1/2 per 1 1, 13 6C, 19 9F, 31 15P 3/2 per 11 5B, 23 11Na, 33 16S, 39 19K, 63 29Cu 5/2 per 55 25Mn 7/2 per 51 23V, Cs, etc. I = numeri interi dispari per nuclei che possiedono un numero di massa pari e carica nucleare dispari: 1 per 2 1, 14 7N 3 per 10 5B, etc. I = 0 per nuclei con numero di massa pari e carica nucleare pari poiché hanno un numero quantico di spin nullo: 0 per 12 6C, 16 8, 32 16S, etc.

18 Splitting L interazione dell elettrone elettrone spaiato con uno o più di questi nuclei sdoppia il segnale che deriva dall elettrone. Il numero di linee che vengono ottenute dall interazione con n nuclei equivalenti sono date dall equazione: dove: numero di linee = 2 n I +1 n è il numero di nuclei equivalenti che interagiscono I è il numero quantico di spin nucleare

19 Esempi Splitting di un segnale ESR originato dall'interazione dell'elettrone spaiato con un nucleo avente numero quantico di spin I = ½ (a sinistra ) o I = 1 (a destra).

20 Costante di accoppiamento La separazione tra le righe si chiama costante di accoppiamento ed è caratteristica di ogni nucleo in ogni composto radicalico. Essa ci dà una misura di quanto un particolare nucleo interagisca con l'elettrone spaiato Ad esempio nel caso di un atomo di idrogeno l elettrone viene splittato in due dal nucleo dell idrogeno: in questo caso la distanza tra le righe è di circa 500 Gauss.

21 Metil Radicale Nel caso del metil radicale l elettrone interagisce con tre nuclei di idrogeno equivalenti: il segnale viene splittato in un quartetto con costante di accoppiamento di circa 230 Gauss. Per tre nuclei equivalenti aventi spin = ½ infatti lo spettro consiste di quattro righe aventi intensità relative 1:3:3:1, tutte ugualmente separate tra loro. C La notevole differenza di accoppiamento riscontrata in e C 3 è da ricercarsi nel fatto che nel metile l'elettrone spaiato è localizzato sull'atomo di carbonio, cioè più lontano dagli atomi di idrogeno che interagiscono quindi in minor misura con esso.

22 Intensità delle righe (I = ½) N righe e intensità relative N atomi eq. con I = 1/

23 Intensità delle righe (I = 1) N righe e intensità relative N atomi eq. con I =

24 Atomi diversi Una situazione molto più frequente è quella in cui si abbia la contemporanea presenza di nucleo non equivalenti che intagiscono con l elettrone spaiato. In questo caso vale la formula: (2n A I A + 1) (2n B I B +1) etc. = No. Totale di righe. dove n A sono il numero di nuclei equivalenti con momento magnetico nucleare I A, n B il numero di nuclei equivalenti con momento magnetico nucleare I B, ecc.

25 Benzochinone radicale anione. (2 * 4 * 1/2 +1) = 5 righe

26 Di-tert-butilnitrossido C 3 C 3 3 C C N C C 3 (2 * 1 * 1 + 1) = 3 righe C 3 C 3

27 N-tert-butil-N-(2,2-dimetil-1- fenilpropil)-nitrossido nitrossido C 3 t-bu 3 C C C 3 N C (2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 1 * 1/2 + 1) = 6 righe

28 N-metil-N-tert-butil nitrossido C 3 3 C C N C 3 C 3 (2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 3 * 1/2 + 1) = 12 righe

29 N-D 3 -metil-n-tert-butil nitrossido C 3 3 C C N CD 3 C 3 (2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 3 * 1 + 1) = 21 righe

30 Etil radicale β α 3 C C 2. (2 * 2 * 1/2 +1) * (2 * 3 * 1/2 +1) = 12 righe

31 Naftalina radicale anione α β._ (2 * 4 * 1/2 +1) * (2 * 4 * 1/2 +1) = 25 righe

32 Butadiene radicale anione _. _ C C C 2 C 2 C C _ C C C2. C 2 2 C 2 C.. _ C 2 C C C 2. C 2 C C C 2 _ (2 * 4 * 1/2 +1) * (2 * 2 * 1/2 +1) = 15 righe

33 Nitrossido indolinonico N Ph C 3. + N Ph C 3. + N Ph C 3. + N Ph C 3

34 Nitrossido indolinonico 5-sost PhS N Ph C 3

35 Esempio Ipotizzare lo spettro EPR del propenil radicale e del butenil radicale. C C C 2 radicale propenilico C C C C 3 radicale butenilico

36 2 N 2' 3' Ph 4' N N N 2 Ph 2 1 6' 5' 2 N DPP (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) N(1) N(2) (3', 5') N(2', 6', N2) N(4', N2) (2", 6", 2"', 6"') (3", 5", 3"', 5"') (4", 4"') Galvinossile But 3' C 3 But (C) (3, 3', 5, 5') (C(C3)3) N Ph Me But TEMP (2,2,6,6-tetrametilpirrolidin nitrossido) 1 C ' 5 But 2-fenil-2-metil-indolin-3-on-nitrossido C C C 3 C 3 3 N C 3 C C N (5, 7) (4, 6) (C3) N (C3) (2 C3) (6 C3) (5 C3) (3 C2) α-tocoferolo

37 RISNANZA DI SPIN ELETTRNIC IN BILGIA La spettroscopia di risonanza di spin elettronica (EPR) ha costantemente trovato applicazioni nella problematica biochimica e biomedica,, come un mezzo potente e sensibile per la rivelazione di specie radicaliche. Ciò si applica tanto al rilevamento (e all identificazione) di intermedi radicalici in reazioni metaboliche, quanto all osservazione di specie paramagnetiche stabili presenti in natura, o al rilevamento di radicali prodotti da radiazioni esterne o, infine, all'analisi di sonde paramagnetiche introdotte in sistemi biologici specifici (spin labeling).

38 RISNANZA DI SPIN ELETTRNIC IN BILGIA Sebbene esista una grande potenzialità per l'osservazione diretta di specie radicaliche associate a specifici fenomeni biochimici, il paramagnetismo si manifesta naturalmente assai di rado in sistemi biologici. Tuttavia grandi vantaggi possono essere ottenuti dalla introduzione di una qualche versatile sonda contenente un centro paramagnetico.

39 RISNANZA DI SPIN ELETTRNIC IN BILGIA Uno "spin" label" " ideale è un radicale libero stabile (spesso organico) di struttura e/o reattività tali da consentirne l'introduzione in una particolare zona dei sistemi biologici e della macromolecola. Sebbene a prima vista una tale sonda possa sembrare facilmente ottenibile, in realtà non lo è.. Infatti la maggior parte degli "spin" spin-labels" " usati attualmente sono radicali nitrossidi protetti la cui sintesi è stata perfezionata solo in tempi recenti. 3 C 3 C R N C 3 C 3

40 RISNANZA DI SPIN ELETTRNIC IN BILGIA Sebbene la tecnica dello "spin" spin-labeling" " faccia generalmente riferimento all'uso di radicali nitrossidi,, si hanno anche altri esempi in cui N 2, Mn 2+, altri ioni paramagnetici di metalli di transizione, ioni di lantanidi, ed altri radicali organici di diversa natura sono stati usati come sonde per lo studio di particolari sistemi. Tuttavia, a causa della loro grande versatilità,, sensibilità e varietà di informazioni da essi ottenibili, i radicali nitrossidi,, hanno trovato un predominante impiego nella tecnica dello Spin-Labeling.