INTRODUZIONE I PAPILLOMAVIRUS. I Papillomavirus (HPV, dall inglese Human Papilloma Virus), membri della famiglia

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1 INTRODUZIONE I PAPILLOMAVIRUS Caratteristiche dei Papillomavirus I Papillomavirus (HPV, dall inglese Human Papilloma Virus), membri della famiglia Papillomaviridae, sono piccoli virus a DNA privi di envelope, che infettano i tessuti epiteliali delle mucose e dell epidermide inducendo lesioni proliferative quali verruche, a livello di mani e piedi, e condilomi, a livello del tratto genitale, labiale e respiratorio; ne esistono oltre 120 tipi che si differenziano per il tipo di tessuto che infettano. I Papillomavirus possono essere suddivisi in tipi a basso ed alto rischio; i gruppi ad alto rischio includono HPV-16, -18, -31, -33 e -45 e sono responsabili dello sviluppo di oltre il 99% dei carcinomi della cervice uterina, mentre quelli a basso rischio, come ad esempio HPV-6, -11 e -44, causano per lo più verruche genitali. [Kobe et al., 2004] Il virus contiene una singola molecola di DNA circolare a doppia elica di 7900 paia di basi, formata da più sequenze codificanti ( Open Reading Frame ) che costituiscono lo stampo per la trascrizione dei messaggeri policistronici; è presente inoltre una regione denominata LCR ( Long Control Region ) a monte dei geni E6 ed E7 dove sono contenute sequenze regolatorie per la replicazione e trascrizione virale. I geni contenuti nelle ORF sono suddivisi in Early o precoci, che codificano per le proteine da E1 a E8 responsabili dell inizio e della regolazione dell attività replicativa, e in Late o tardivi che codificano per le proteine strutturali L1 ed 5

2 L2, le quali si assemblano a formare il capside; quest ultimo racchiude il genoma virale formando una struttura icosaedrica di 55 nanometri di diametro composta da 72 capsomeri. Ogni capsomero è un pentamero di L1, la proteina strutturale maggiormente espressa in quanto costituisce ben l 85% del capside, mentre L2 è la proteina minore. [Jung et al., 2004] Figura 1: presentazione schematica del genoma di Papillomavirus Nella produzione degli mrna di HPV sono implicati più promotori; per quanto riguarda ad esempio HPV-16, esiste un promotore principale chiamato P97 che avvia e regola l espressione delle oncoproteine E6 ed E7. 6

3 Le prime proteine virali ad essere prodotte sono E1 ed E2. E1 svolge un attività ATPasica ed elicasica 3-5 ed è fondamentale per l inizio della sintesi del DNA in quanto recluta il complesso di replicazione cellulare a livello del sito di origine della replicazione del genoma virale. E2 lega il DNA sotto forma di dimero in modo specifico a livello di una sequenza consenso palindromica ed è importante nella regolazione della trascrizione virale; la proteina E2 è presente in due forme, una normale con attività di attivatore o repressore della trascrizione, e una troncata con attività di repressore, molto importante nel normalizzare i livelli di E6 ed E7. La funzione della proteina E4 non è del tutto chiarita nonostante sia la proteina di HPV con i più alti livelli di espressione; i dati sperimentali ad oggi disponibili suggeriscono che sia coinvolta sia nella replicazione virale sia nella liberazione della progenie virale. E5 è una piccola proteina idrofobica localizzata a livello delle membrane endosomiali, dell apparato di Golgi e della membrana plasmatica. Si ritiene che E5 ostacoli i meccanismi di inibizione della crescita interagendo con il recettore per EGF in membrana e che si leghi all ATPasi endosomiale impedendone l acidificazione con conseguente aumento del ricambio del recettore di EGF a livello della plasma membrana. La sua espressione avviene nella fase iniziale dell infezione e viene persa dopo l integrazione virale nel genoma della cellula ospite. [Longworth et al., 2004] Il gene E6 codifica per una proteina di 150 aminoacidi espressa sia a livello citoplasmatico sia a livello nucleare ed è stata definita, insieme ad E7, oncoproteina di HPV, poiché induce la trasformazione neoplastica dei cheratinociti infettati; il bersaglio principale di E6 è p53, uno dei primi oncosoppressori ad essere stato identificato e studiato. P53 regola il controllo cellulare ed in seguito a danni al DNA viene attivata con conseguente blocco del ciclo 7

4 cellulare ed apoptosi. Durante l infezione per bloccare l attività di p53 e quindi permettere la progressione del ciclo cellulare, E6 lega questa proteina attraverso l ubiquitina ligasi E6AP, con conseguente degradazione via proteasomica (figura 2). L altra oncoproteina dei Papillomavirus è E7, di 100 aminoacidi, situata principalmente nel nucleo; la caratteristica peculiare di E7 risiede nella sua capacità di legare la proteina del Retinoblastoma (Rb). Rb nella forma ipofosforilata viene espressa durante la fase G1 del ciclo cellulare con la funzione di impedire il passaggio alla fase S attraverso il legame al fattore di trascrizione E2F (figura 2). E7 lega Rb impedendo la formazione del complesso con E2F e mantenendo l attivazione costitutiva dei geni bersaglio del fattore trascrizionale. Oltre a ciò, la proteina E7 si associa alle cicline A ed E, le quali una volta attivate fosforilano Rb bloccandone l attività. In cellule non infette da HPV, Rb lega le istone deacetilasi (HDAC), enzimi che rimuovono gruppi acetile dagli istoni bloccando così la trascrizione genica; in cellule esprimenti E7, le HDAC vengono reclutate dall oncoproteina insieme a Rb mantenendo così l acetilazione istonica e quindi l attivazione trascrizionale. [Patrick Frinzer et al., 2002] 8

5 Figura 2: schema delle funzioni delle oncoproteine E6 ed E7 di Papillomavirus 9

6 Ciclo replicativo del virus I Papillomavirus possiedono uno spiccato ed esclusivo tropismo per le cellule epiteliali squamose stratificate dell epidermide e delle mucose. L infezione virale inizia con il legame del capside alla superficie delle cellule ospiti, i cheratinociti, nello strato basale dell epitelio; i recettori cellulari coinvolti nell adsorbimento del virus non sono ancora stati chiaramente identificati, anche se sembrano avere un ruolo determinante gli eparansolfati, presenti sulla superficie cellulare. Le particelle virali vengono poi internalizzate attraverso la formazione di fagosomi che li trasportano nel citoplasma dove avviene la scapsidazione o denudamento. La replicazione del DNA si verifica secondo due diverse modalità. Nelle cellule degli strati inferiori dell epitelio, e in particolare nello strato basale, il DNA virale è mantenuto in alcune copie con il significato di un plasmide stabile che esprime solo alcuni geni precoci e si riproduce mediamente una volta per ciclo cellulare; questo è equamente distribuito alle cellule figlie, assicurando la persistenza dell infezione latente nelle cellule progenitrici dell epitelio. Nelle cellule differenziate, localizzate negli strati superiori dell epitelio, la sintesi di DNA cellulare non si verifica, mentre si osserva un intensa replicazione del DNA virale con l attivazione dell espressione di geni tardivi, la produzione delle proteine strutturali e la formazione della progenie virale completa che è presente solo negli strati più superficiali dell epitelio, da cui viene eliminata nell ambiente assieme alle cellule desquamate. [Howley et al., 2001] 10

7 Figura 3: ciclo replicativo del Papillomavirus Il ciclo replicativo completo del virus con produzione di una progenie virale matura è tipico delle infezioni da HPV a basso o medio rischio, in cui il genoma del virus permane in forma plasmidica come mostrato in figura 3. Nelle lesioni ad alto grado indotte da HPV ad alto rischio, come il -16 o il -18, avviene l integrazione del DNA virale nel genoma della cellula ospite con conseguente mancata produzione di virioni. L integrazione presuppone la rottura e la linearizzazione della molecola del DNA virale ed il legame covalente degli estremi della molecola linearizzata con il DNA cellulare come mostrato in figura 4. Poiché la rottura avviene tra le regioni E1 ed E2, ciò comporta la perdita dell azione repressiva di E2 sulla trascrizione dei geni precoci E6 ed E7. 11

8 Pertanto nelle cellule tumorali indotte da HPV ad alto rischio, i geni E1, E6 e E7 sono integrati e funzionali, mentre i geni E2, E4 e E5 vengono persi o non sono trascritti. Tutto ciò causa una sovrapproduzione delle oncoproteine E6 ed E7 responsabili principali dell azione tumorigenica. Questo meccanismo di integrazione determina dunque l inizio dei processi di trasformazione e immortalizzazione dei cheratinociti. [Doorbar et al., 2006; Motoyama et al., 2004] Figura 4: meccanismo di integrazione dei papillomavirus ad alto rischio 12

9 Epidemiologia I Papillomavirus sono patogeni ampiamente distribuiti nella specie umana che si trasmettono prevalentemente per via sessuale; sono virus molto resistenti al calore e a condizioni di aridità, pertanto si può verificare anche un tipo di trasmissione non sessuale, ad esempio per mezzo di fomiti in seguito a prolungato contatto con abiti contaminati. Gli HPV ad alto rischio sono strettamente associati a carcinomi alla cervice uterina, che costituiscono la seconda causa di cancro mortale nella donna con vittime ogni anno nel mondo; in particolare sono coinvolti in oltre il 90% dei casi di neoplasia intra-epiteliale della mucosa dell utero. La più alta incidenza annuale nel mondo è stata trovata ad Haiti con 93,8 per donne (1996); circa casi di cancro uterino sono riportati ogni anno, di cui l 80% dai paesi in via di sviluppo: in Africa, in America latina e in Asia per un totale di [Robert et al., 2004] Negli Stati Uniti l infezione da Papillomavirus è la più diffusa tra tutte la malattie a trasmissione sessuale. Nel 1999 i centri per il controllo delle malattie hanno stimato che negli USA sono stati diagnosticati nuovi casi di infezioni da HPV. Di questi, una percentuale significativa progredisce da infezione latente a manifestazioni cliniche di cancro alla cervice. In Italia, i dati dei registri nazionali tumori relativi agli anni mostrano che ogni anno sono stati diagnosticati circa nuovi casi di carcinoma della cervice (pari a una stima di incidenza annuale di 10 casi ogni donne). Nel corso della vita, il rischio di avere una diagnosi di tumore della cervice è del 6,2 per mille (1 caso ogni 163 donne), mentre il rischio di morire è di 0,8 per mille. 13

10 Per quanto riguarda la prevalenza dell infezione da HPV in Italia, i dati disponibili su donne di età compresa tra 17 e 70 anni, che afferivano a controlli ginecologici di routine o a programmi di screening (Pap-test), mostrano una prevalenza del 7-16%. Nelle donne con diagnosi di citologia anormale la prevalenza sale invece al 35%, per arrivare al 96% in caso di diagnosi di displasia severa o oltre. Come già detto, ci sono più di 120 tipi di HPV, 40 dei quali infettano la zona urogenitale: l HPV16 è il tipo più comune ed è responsabile del 50% dei casi di cancro alla cervice, seguito dai tipi -18, -45, -31 e -33. Nei neonati i tipi di HPV più diffusi sembrano essere il -16 e il -18 e persistono soltanto per un breve periodo di tempo, mentre nei bambini il tipo -6 e il tipo -11 sono quelli prevalenti. La diffusione dell HPV risulta essere diversa, a seconda del metodo utilizzato per individuarne la presenza; la mancanza di un metodo standard di ricerca fa sì che gli studi di tipo epidemiologico siano molto difficili e trovino range di diffusione ampiamente variabile. Servendosi della citologia come strumento per l identificazione del virus, si è visto che il 3-11% di tutte le donne ha un infezione da HPV. L indice di diffusione, quando viene usata la colposcopia, sale invece al 33%, mentre i test più sensibili, come gli studi mediante ibridazione, hanno indicato che il range di diffusione dell HPV tra gli individui di sesso femminile è attorno al 30-38%; infine i nuovi metodi di PCR (Polymerase Chain Reaction) hanno evidenziato una diffusione tra il 20 e il 46%. Tuttavia un limite di questi test è l impossibilità di identificare un infezione latente e di eseguire la tipizzazione del virus. [Bosch et al., 2002] Nonostante la mancanza di adeguate tecniche standard di identificazione per quantificare la diffusione e l incidenza di HPV, alcune tendenze sono comunque emerse. 14

11 Donne giovani e attive sessualmente hanno più alta incidenza di infezione da HPV, mentre donne più anziane e monogame hanno un incidenza più bassa. La diffusione dell HPV raggiunge i massimi valori tra i 15 e i 25 anni e decresce bruscamente con l avanzare dell età. Nessuna valutazione conclusiva si è potuta trovare per l HPV negli uomini a causa delle moltissime esperienze di infezioni latenti e della rarità di sintomi visibili della malattia. Alcuni possibili fattori di rischio sono stati identificati in associazione all incremento di infezioni da HPV: rapporti sessuali con molti partners, una co-infezione con Herpesvirus, condizioni di immunodepressione, il fumo di sigaretta, l uso di contraccettivi orali e lo stato di gravidanza. [Burd et al., 2003] 15