Tecniche elettroforetiche

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1 Tecniche elettroforetiche Biochimica e biotecnologie degli alimenti Lezione 4

2 Elettroforesi L elettroforesi è la migrazione di ioni in un campo elettrico. L elettroforesi di proteine utilizza di norma supporti costituiti da gel di poliacrilammide (PAGE) che separano le proteine in base alle dimensioni ed alla carica delle molecole. È un supporto molto usato perchéha una porositàomogenea e riproducibile.

3 Elettroforesi Il gel di poliacrilammide è un copolimero cross-linked della acrilammide. Il gel si prepara per polimerizzazione di una soluzione di un monomero monofunzionale, l'acrilammide (CH 2 =CH-CO-NH 2 ), e uno bifunzionale, la N,N'-metilen-bis-acrilammide(CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH-CO-CH=CH 2 ). La polimerizzazione avviene per mezzo di una reazione a catena dovuta all'aggiunta di ammonio persolfato e della base N,N,N',N'-tetrametiletilendiammina (TEMED). Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero. In questo modo si formano catene di acrilammide tenute insieme da legami crociati di bis-acrilammide.

4 SDS-PAGE Nell elettroforesi in presenza di SDS, le proteine sono denaturate mediante l aggiunta del detergente sodio dodecil solfato (SDS) che denatura le proteine conferendo a tutte una carica netta negativa. [CH 3 -(CH 2 ) 10 -CH 2 -OSO 3- ]Na Interagisce con le proteine in un rapporto costante di circa 1.4 g SDS ogni g di proteina. Le cariche negative dell SDS mascherano la carica intrinseca della proteina conferendo a tutte un rapporto carica/massa simile. La separazione avviene quindi mediante filtrazione su gel in base alla massa delle proteine.

5 Colorazione Per visualizzare le proteine si ricorre a colorazioni specifiche O S C H 2 5 CH N C N CH CH C H SO H C 5 2 N C H 2 5 Nitrato d argento (1-2 ng) Ponceau S (100 1,000 ng) Coomassie Blue( ng)

6 SDS-PAGE Mediante SDS-PAGE è possibile determinare la massa molecolare delle proteine. La mobilità relativa (migrazione) è in questo caso direttamente proporzionale al logaritmo della sua massa molecolare. E possibile costruire rette di calibrazione utilizzando proteine con peso molecolare noto.

7 SDS-PAGE Mediante SDS-PAGE è possibile determinare la composizione in subunità di una proteina multimerica. In presenza di un agente riducente (DTT o Mecaptoetanolo) si ha la rottura dei ponti disolfurici e la separazione su gel delle subunità. Proteina dimericacon due subunità A B Proteina con una subunità C SDS e Mercaptoetanolo Elettroforesi su gel di poliacrilammide Gel di poliacrilammide

8 SDS-PAGE Mediante SDS-PAGE è possibile monitorare l andamento della purificazione e verificare il livello di purezza della proteina di interesse.

9 Focalizzazione isoelettrica Per isoelettrofocalizzazione (IEF) o focalizzazione isoelettrica si intende un processo per il quale le proteine si separano su un supporto solido, molto spesso un gel, in base al loro punto isoelettrico. Questa tecnica elettroforetica viene quindi utilizzata sia per la separazione di proteine che per determinarne il loro punto isoelettrico. Sul gel viene creato un gradiente di ph grazie a miscele di anfoliti che, una volta applicato un campo elettrico, si dispongono tra anodo e catodo conferendo in quel punto un ph uguale al loro pi.

10 2D-PAGE Nell'elettroforesi bidimensionale, tecnica elettroforetica utilizzata nel campo della proteomica per separare miscele proteiche complesse, le proteine sono separate in due dimensioni sfruttando principi fisici differenti. Nel caso dell'elettroforesi bidimensionale, i principi più utilizzati sono il punto isoelettrico e il peso molecolare.

11 Dal genoma al proteoma Lo studio della chimica delle proteine può essere basato su approcci differenti e complementari che includono l approccio biochimico tradizionale e il più recente approccio proteomico.

12 Dal genoma al proteoma PROTEOMA: PROTEine espresse dal genoma Il termine PROTEOMA è stato coniato nel 1994 da Marc Wilkins (Macquarie University, Sydney) TOTALITÀDELLE PROTEINE ESPRESSE DAL GENOMA IN UNA DATA CELLULA IN UN CERTO ISTANTE, INCLUSE LE ISOFORME E LE PROTEINE MODIFICATE POST- TRADUZIONALMENTE (Wilkins, 1994)

13 Dal genoma al proteoma

14 Dal genoma al proteoma Nell era post-genomica, lo studio del proteoma mediante approcci innovativi è estremamente promettente per fornire risposte concrete a problematiche in campo biomedico ed agroalimentare.

15 Approccio proteomico Pre-frazionamento 2D-PAGE 1D-LC o 2D-LC MALDI-ToF F MS Tandem MS (MS/MS) Ricerca in banca dati

16 2D-PAGE

17 I Dimensione: focalizzazione isoelettrica Supporto per IEF Alto ph Basso ph

18 I Dimensione: focalizzazione isoelettrica Alto ph Basso ph 8 Ore

19 I Dimensione: focalizzazione isoelettrica Le proteinemigrerannonelcampo elettricofinoa quandopi = ph dove la lorocaricanettasaràugualea zero Alto ph Basso ph 16 Ore

20 II Dimensione: : SDS-PAGE Gel di poliacrilammide

21 II Dimensione: : SDS-PAGE Setacciomolecolare Gel di poliacrilammide

22 II Dimensione: : SDS-PAGE Gel di poliacrilammide + ve + ve

23 Metodi di lisi

24 Metodi di lisi

25 Solubilizzazione, denaturazione e riduzione UREA DETERGENTI L urea è l agente denaturante più utilizzato, in casi specifici con problemi di solubilizzazione si può utilizzare la tiourea. Normalmente si utilizza urea 8M, ma anche miscele di tiourea 2M e urea 5-8M. I detergenti vengono aggiunti per rompere interazioni idrofobiche e incrementare la solubilità proteica. I detergenti devono essere non ionici o zwitterionici. Di solito viene utilizzato il CHAPS AGENTI RIDUCENTI Necessari per rompere i ponti disolfurici e mantenere in forma ridotta le proteina. Generalmente si utilizza o ditiotreitolo(dtt) o tributil-fosfina(tbp). ANFOLITI Per ogni range di ph una miscela di anfoliti carrier che aumentano la solubilità del campione e generano una conduttività uniforme attraverso il gradiente di ph durante l IEF

26 Solubilizzazione dei campioni biologici Tipo di campione Cellule eucariotiche Tampone di solubilizzazione urea 7M, tiourea 2M, CHAPS 2%, TX-100 2%, DTT 1%, Anfoline 1.6%, TRIS 15mM, PMSF 3mM Membrane cellulari, membrane globulo rosso urea 7M, tiourea 2M, CHAPS 2%, TX-100 2%, DTT 1%, Anfoline 1.6%, TRIS 15mM Tessuto muscolare tal quale urea 9.5M, CHAPS 2%, DTT 1%, Anfoline 2%, PMSF 3mM Tessuti già estratti ad esempio con guanidinio cloruro (es. muscolo, fegato, rene, ghiandola mammaria, cervello) Urea 8M, CHAPS 4%, DTT 1%, Anfoline 1.6%, TRIS 15mM Urine Urea 8M, CHAPS 4%, DTT 1%, Anfoline 1.6% Estratto da microrganismi Urea 8M, CHAPS 4%, DTT 1%, Anfoline 1.6%, TRIS 10mM Siero, plasma, liquido sinoviale Latte Urea 8M, CHAPS 4%, DTT 1%, Anfoline 1.6%, TRIS 15mM urea 7M, tiourea 2M, CHAPS 4%, DTT 1%, Anfoline 1.6%, TRIS 15mM

27 Gradienti di ph generati da anfoliti Miscele complesse di acidi poliammino-policarbossilici sintetici altamente solubili molecole anfoteriche(presenza contemporanea di gruppi basici e acidici => hanno un pi determinato da questi gruppi) alto poteretamponanteal loropi Quando èapplicato una voltaggio alla miscela di anfoliti, questi si muoveranno in base al loro pi allineandosi tra i due poli, creando un gradiente continuo di ph SVANTAGGI Il gradientenon èstabile neltempo (spostamento) e la forma del gradienteè influenzabile dalle molecole che vengono analizzate

28 Gradienti di ph immobilizzati Il gradiente di ph viene creato con setdi tamponi derivati dall acrilammide, copolimerizzazandoli entro le fibre della matrice CH 2 CH C N R R= -COOH oppure N(CH 3 ) 2 O H IMMOBILINE La copolimerizzazione di questi monomeri con diverso pkain diversa concentrazione permette di creare dei gradienti preformati di ph all'interno del gel. Una volta integrate nel gel, le immobiline conferiscono una capacità tamponante controllata e una bassa conduttività all'interno del gradiente

29 Gradienti di ph immobilizzati Sottili strisce di gel di poliacrilamideal 5% T polimerizzato su un supporto di plastica Utilizzano gradienti di ph immobilizzati Acquistate in commercio oppure prodotte direttamente in laboratorio Disponibili in differenti lunghezze e rangedi ph (7, 11, 13, e 18 e 24 cm) Disidratate Devono essere reidratate prima dell IEF

30 Vantaggi dei gradienti di ph immobilizzati Possibilità di reperire in commercio gel preformati minimizzando variazioni dovute alla preparazione dei gel I gel vengono preparati su una pellicola di plastica che ne facilita l utilizzo I gradienti di ph sono stabili nel tempo e non subiscono alterazioni dovute alla presenza del campione stesso Il gradiente pre-esiste al passaggio della corrente, essendo creato al momento della polimerizzazione I gradientisonopraticamentecontinuie possonoesserecostruitisecondodiverse esigenze: lineari/non lineari; ampi(ad esempio ph 3-10)/molto ristretti(ph 4-5)

31 Parametri per la reidratazione Nota:occorre rispettare i limiti di volume e quantitàdi proteina caratteristici del tipo di strip che si sta utilizzando Volumi maggiori entrata prefereneziale di molecole a basso peso molecolare (prima acquapoi altriionie per ultimeproteinead alto PM). Volumi minori il gel non si rigonfia alle opportune dimensioni. Le dimensioni dei pori della matrice non sono controllati e pari a quelli prestabiliti. Questo porta ad una difficolta nell analizzare proteine ad alto PM.

32 Reidratazione Le IPG strips sono reidratate over night La soluzione di reidratazione è applicata alle scanalature del supporto In ciascuna scanalatura viene posta una strip Ogni strip viene coperta con olio di paraffina per minimizzare l evaporazione e la cristallizzazione dell urea e per evitare il contatto con la CO 2 che, se adsorbita dal gel, può provocare un acidificazione della matrice con conseguente errata VALUTAZIONE dei punti isoelettrici Immobiline DryStrip reswelling tray

33 Reidratazione strip holder Ettan IPGPhor (Amersham Bioscience)

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35 Prima dimensione:ief Il punto Isoelettrico di una proteina Le proteine sono molecole anfipatichedotate di gruppi acidi e basici. ph<pi ph=pi ph>pi Ogni proteina ha un particolare punto isoelettrico. La carica netta della proteina dipende dal ph dell ambiente in cui essa si trova. Quando il ph èuguale al pi della proteina, la carica netta diventa ZERO.

36 Prima dimensione:ief ph basso: Le proteine vengono protonate Carica positiva Anodo Anodo IPG strip Campo elettrico Proteine acide ph alto: Le proteine vengono deprotonate carica negativa Le proteine cariche migrano all interno del gradiente di ph Catodo Quando le proteine raggiungono il valore di ph corrispondente al proprio pi, la loro carica netta diviene zero ed esse focalizzano come bande discrete Catodo Proteine basiche

37 Isoelettrofocalizzazione Non esiste un protocollo di isolelettrofocalizzazione universale ogni singolo passo deve/può essere ottimizzato in funzione del campione in esame Aumento progressivo dei voltaggi in modo tale che nelle prime fasi della IEF gli ioni presenti nel campione (ioni presenti nel campione, lysis buffer o controioni dei gruppiacidio basicidel gel) venganotrasportatifuoridalgel Temperatura: 20 C: più bassa l urea cristallizza, più alta (>37 C) l urea modifica le proteine Multiphor II Ettan IPGphor II

38 / V V V V V V V V V 3h 2h 2h 2h 2h 2h 2h 2h 48h La definizione dei metodi e di fondamentale importanza al fine di riprodurre al meglio le stesse condizioni in corse effettuate separatamente compensando eventuali variazioni dei voltaggi applicati dovute a variazioni della conducibilità(diversa resistenza dei campioni)

39 Passaggio dalla I alla II dimensione La transizione dalla prima alla seconda dimensione coinvolge l equilibratura della striscia in tampone contenente SDS e la riduzione ed alchilazione dei pondi disolfuro mediante l uso di DDT (ditiotreitolo) e IAM (iodoacetamide) al fine di bloccare i gruppi SH delle proteine prevenendo la formazione di ponti disolfuro durante la seconda dimensione S-S TBP or DTT - DTE H 2 O H + S-S TBP + H O - 2 H + S - - S TBP =O I NH 2 O = SH S HI =NH2 O

40 Equilibrio Tampone di Equilibrio (Tris-HCl 50 mm ph 8.4) mantiene il ph della strip nel range appropriato per l elettroforesi. Urea (6 M) Riduce gli effetti dell elettroendosmosi aumentando la viscosità del tampone. L elettroendosmosi(eeo) è dovuta alla presenza di cariche negative fissate sulla IPG strip. EEO causa un flusso di acqua che ostacola la migrazione delle proteine e può interferire con il trasferimento delle stesse dalla strip al gel della seconda dimensione Glycerol(30 %) Riduce gli effetti dell elettroendosmosie facilita il trasferimento delle proteine dalla strip al gel per la seconda dimensione. SDS (2 %) Denatura le proteine e le carica negativamente. Step 1: Ditiotreitolo(DTT) (2 %) 15 minuti Riduce i ponti disolfuro preservando lo stato denaturato delle proteine. Step 2: Iodoacetammide(IAA) (2.5 %) 10 minuti Alchila i gruppi tiolicidelle proteine prevenendo la riossidazionedei ponti disolfuricidurante l elettroforesi. Blu di Bromofenolo(BFB) (tracce) Colorante consente di seguire l andamento della migrazione.

41 II Dimensione: : SDS-PAGE Trasferimento della strip equilibrata sul gel SDS-PAGE ETTAN Daltsix MINI PROTEAN

42 Visualizzazione degli spot Al termine della seconda dimensione si procede alla colorazione del gel La scelta della colorazione dipenderà soprattutto dalla quantità di proteine caricate Le colorazioni non devono interferire con i processi successivi (es. spettrometria di massa) Nitrato di Argento meno di 1 ng sensibilità CommassieBrilliantBlue (CBB) Colloidale G-250: circa 5 10 ng Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 : circa ng Coloranti fluorescenti (SYPRO Ruby o Deep Purple) Colorantispecificiper proteinemodificatepost-traduzionalmente(pro Diamond e Emerald per fosfo- e glicoproteine, rispettivamente.

43 Esempio di elettroforesi bidimensionale ad elevata risoluzione E. coli 2-D map Lisato totale I dimensione: strip 18cm ph 3-10 NL II dimensione: gel di poliacrilammide con gradiente 9 16 %T colorato con Nitrato d argento.

44 Analisi d immagine Al termine della separazione delle proteine mediante 2DE, al fine di procedere all analisi d espressione differenziale, è indispensabile effettuare: 1. La digitalizzazione delle mappe bidimensionali 2. Il confronto degli elettroferogrammi ottenuti Algoritmi specifici permettono di rilevare gli spot (detection), rimuovere il rumore di fondo (background noise subtraction), allineare e confrontare (matching( matching) ) i gel, creando immagini sintetiche, e valutando i differenti livelli di espressione proteica sfuttando basi statistiche

45 Analisi d immagine Strumenti per l analisi d immagine Phosphoimager Marcaturacon 32 P e 35 S Fluoroimager Marcatura in fluorescenza Densitometro o Photo Scanner

46 Detection

47 Analisi d immagine A B C GEL SINTETICO A+B+C+D+E E D

48 Proteomica differenziale Mediante l utilizzo dei metodi di indagine proteomica è possibile effettuare un analisi quali/quantitativa delle proteine differenzialmente espresse.

49 Analisi d immagine ph 10 Non linear IPG 3-10 ph 3 ph 10 Non linear IPG 3-10 ph Mr kda 10 Differenze quantitative Differenze qualitative

50 chefare con le proteine separate mediante 2D-PAGE???

51 Taglio degli spot proteici

52 Digestione delle proteine Transfer Gel Piece to Test Tube Mass prep station Destain Dehydrate Rehydrate with Trypsin Solution Incubate at 37 C for16 h

53 Deposizione sul target plate del MALDI

54 Digestione delle proteine Per avere informazioni sull identità della proteina è necessario romperla in frammenti più piccoli!

55 Digestione delle proteine proteina ammino acido

56 Digestione delle proteine proteina Arginina Lisina

57 Digestione delle proteine Tripsina Riconosce e taglia le proteine quando sono presenti ammino acidi basici Arginina Lisina

58 Digestione delle proteine Arginina Lisina

59 Digestione delle proteine Arginina Lisina

60 Digestione delle proteine

61 Digestione delle proteine

62 Digestione delle proteine Una digestione triptica delle proteine fornisce frammenti più piccoli che possono essere analizzati mediante spettrometria di massa

63 Spettrometria di massa Metodica con la quale è possibile pesare una molecola dopo che essa è stata ionizzata, ovvero dopo che ad essa è stata impartita una carica elettrica. Analisi delle proteine

64 Voyager Spec #1[BP = , 24303] E Mass (m/z) 0 0 % Intensity DE GEL G5 SEQUENZE NUCLEOTIDICHE DA BANCA DATI gatctgaaat gttcgtcgat gggttcgtac aagggcctgt ESCISSIONE SPOT DIGESTIONE TRIPTICA SEQUENZE PROTEICHE DA BANCA DATI PEPTIDI PROTEOLITICI TEORICI RATETGMKAT MARIANNAPI GGAPADMCTA ADMRDGGFAD Voyager Spec #1[BP = , 24303] E Mass (m/z) 0 0 % Intensity Peptide mass fingerprint