Le connettiviti autoimmuni

Dossier N.14 Le connettiviti autoimmuni Aggiornamento tecnico scientifico a cura di: Dr.ssa Simonetta Signorini

Dossier N. 14 Ottobre 2011 i. autoimmunologia 4 Citochine 8 Classificazione delle malattie autoimmuni 10 Inquadramento clinico delle malattie autoimmuni non organo specifiche 12 II. Diagnostica 15 Nuove prospettive 23 Algoritmo diagnostico 24 Conclusioni 27 Riferimenti bibliografici 27 3

I. AUTOIMMUNOLOGIA Introduzione Il sistema immunitario ha la funzione di proteggere il nostro organismo dalle infezioni mediante il riconoscimento dei microrganismi, l impedimento della loro crescita e l eliminazione delle cellule senescenti e delle macromolecole. Questi sistemi di difesa sono in grado di fornire uno stato di immunità contro le infezioni e i loro meccanismi e costituiscono le basi del campo di studio definito Immunologia. Per adempiere a questi compiti, deve distinguere le molecole self e nonself. La tolleranza immunologica consiste nell incapacità da parte dell organismo di reagire verso determinati stimoli antigenici per un inibizione specifica del sistema immunitario. I meccanismi di tolleranza immunologica agisc o no sia a livello centrale che periferico. La tolleranza centrale si verifica quando i linfociti incontrano il rispettivo antigene durante il loro processo maturativo a livello degli organi linfatici centrali (midollo osseo per i linfociti B, timo per i linfociti T) (fig. 1) Le alterazioni dei meccanismi di controllo della tolleranza immunologica possono determinare le reazioni autoimmuni verso le molecole self e quindi le malattie autoimmuni. CELLULA TIMICA LINF. T Il recettore del linfocito T combacia perfettamente con il complesso HLA- auto antigene presente nel timocita: l interazione è ad alta affinità e il linfocito viene eliminato Nucleosoma Il recettore non riconosce per niente il complesso HLA-autoantigene: il linfocito viene eliminato perché inutile Il recettore del linfocito T riconosce debolmente il complesso HLA-autoantigene: Ottamero istonico Istone H1 DNA il linfocita non viene eliminato perché potenzialmente utile Fig. 1: Tolleranza centrale verso i linfociti T. I linfociti T immaturi con TCR ad elevata affinità per il complesso peptide-mhc vanno incontro ad un processo di morte programmata o apoptotica (delezione clonale). Legenda: n = Autoantigene n = Molecola HLA n = Recettore del Linfocita T (TCR) 4

La tolleranza centrale per i linfociti B autoreattivi avviene a livello del midollo osseo mediante una delezione dei linfociti B immaturi che hanno recettori ad elevata affinità per gli autoantigeni presenti nel microambiente midollare. La tolleranza periferica è più importante di quella centrale, poiché agisce sui linfociti T e B che sono sfuggiti ai meccanismi di delezione clonale e morte apoptotica, e che si trovano a contatto con gli autoantigeni. La tolleranza periferica per i linfociti B si verifica quando incontrano l autoantigene specifico nei tessuti periferici in assenza del linfocito T helper specifico; i linfociti B autoreattivi diventano incapaci di rispondere all antigene. Inoltre i linfociti B possono essere esclusi dai follicoli linfatici mediante le perdita dei recettori per le chemochine, che attraggono normalmente i linfociti B maturi all interno dei follicoli. La tolleranza periferica nei confronti dei linfociti T viene regolata mediante i seguenti meccanismi principali: Soppressione da linfociti Inibizione della risposta immunitaria ad opera di citochine prodotte dai linfociti T soppressori. L attivazione di questi linfociti sembra dipendere dalla dose dell antigene nonché dalla formazione del complesso antigene-anticorpo. Oltre ai principali meccanismi sopra-menzionati ci sono altri sistemi per il controllo della tolleranza periferica: L ignoranza clonale, intesa come incapacità dei linfociti autoreattivi di rispondere agli autoantigeni senza tuttavia essere sottoposti ai meccanismi visti precedentemente. L isolamento anatomico per impedire la possibilità di contatto con i linfociti e quindi una reazione immunitaria specifica. I confinamento in organi che normalmente non esprimono l MHC di classe II determina l impedi mento alla reazione immunologica per un mancato riconoscimento. Anergia clonale Il linfocita T maturo riconosce il complesso peptide- MHC della cellula presentante l antigene, tuttavia manca la sua attivazione completa per assenza delle molecole cosiddette co-stimolatorie, oppure il peptide presenta residui aminoacidici alterati nella zona di contatto con TCR. Delezione clonale La delezione clonale nei linfociti T maturi è determinata dalla persistente stimolazione da parte dell antigene, con conseguente attivazione di un processo noto come morte cellulare indotta dall attivazione ( activation-induced cell death AICD). La AICD è una forma di apoptosi indotta da segnali che originano da recettori di morte presenti sulla membrana, il più importante di quali è il Fas. Il Fas, interagendo con il suo ligando (FasL), attiva nelle cellule delle cistino-proteasi dette caspasi che determinano la morte apoptotica. La deficienza e/o l alterazione dei meccanismi responsabili del mantenimento della tolleranza possono provocare l insorgenza di fenomeni di autoimmunizzazione. L autoimmunità può ovviamente risultare da anomalie dei linfociti B, dei linfociti T o di entrambe le popolazioni linfocitarie. Le anomalie dei linfociti T sono più importanti, perché i linfociti T rappresentano le cellule centrali di tutte le risposte immuni nei confronti degli antigeni proteici, sia con riferimento alle reazioni cellulo-mediate che alla produzione di autoanticorpi. I deficit dei meccanismi di tolleranza immunologica possono manifestarsi a livello centrale o a livello periferico. I deficit dei meccanismi di tolleranza centrale possono spiegare la presenza in circolo di cellule T autoreattive, tuttavia questo difetto può essere controllato a livello periferico. 5

I difetti dei meccanismi di tolleranza periferica possono essere determinati da: processi infiammatori che possono attivare le APC in fase di riposo presenti a livello tessutale, inducendo su tali cellule l espressione aberrante delle molecole co-stimolatorie necessarie alla presentazione di autoantigeni; difetto di espressione o di funzione delle molecole coinvolte nella inattivazione dei processi di co-stimolazione; mutazioni che interferiscono con la morte apoptotica dei linfociti maturi; difetto nei meccanismi di soppressione mediati dai linfociti T, in particolare di quelli capaci di produrre citochine regolatorie. Altre cause di alterazioni dei meccanismi di controllo sono: Attivazione policlonale dei linfociti Th Attivazione policlonale dei linfociti B Liberazione di antigeni sequestrati: l alterazione della barriera anatomica tessutale, determina l esposizione di autoantigeni sconosciuti al sistema immunitario Mimicrismo molecolare: Cross-reattività immunologica di alcuni antigeni estranei con le molecole self Superantigeni: antigeni in grado di indurre una risposta immunologica dei linfociti T molto più elevata rispetto alla reazione per gli antigeni proteici convenzionali Alterazioni del controllo idiotipo/anti-idiotipo: la parte variabile degli anticorpi (idiotipo) con la funzione di riconoscere antigeni è immunogenica e genera anticorpi anti-idiotipo. Un alterazione a carico di questo network idiotipico può determinare la perdita della tolleranza al self 6

Heat shock proteins (HSP): famiglia di proteine prodotte in gran quantità quando si è sottoposti a stress fisico e metabolico con funzione di coadiuvare la ristrutturazione e la funzionalità delle proteine denaturate. Infezioni e reinfezioni persistenti determinano una continua esposizione al SIC delle HSP batteriche inducendo una risposta immunitaria anche contro le HSP espresse dalle cellule umane con una conseguente risposta autoimmune Età Il sesso: nelle donne le malattie autoimmuni sono più frequenti, circa 10 volte superiori a quella degli uomini Deficit immunitari Infezioni e neoplasie Farmaci Fattori genetici: aplotipi HLA e non HLA Il sistema HLA (Human Leucocyte Antigen) è il principale responsabile per il riconoscimento delle cellule self e non self, in quanto rappresenta il prodotto dei loci genici del Complesso Maggiore di Istocompatibilità (MHC), il cui compito principale è la presentazione dei peptidi ai linfociti T. La regione che codifica per HLA è localizzata sul braccio corto del cromosoma 6 (fig. 2). Per alcune malattie autoimmuni esiste una correlazione tra la presenza di determinati alleli HLA e una predisposizione ad una particolare patologia autoimmune; inoltre la diversa associazione tra gli alleli HLA, esprime un alta o bassa prevalenza di predisposizione alla patologia. HLA Classe II DP, DQ, DR HLA Classe III Complemento C4, C2, e FB, TNF HLA Classe I Antigeni B A C G Fig. 2: Cromosoma 6 7

Citochine Le citochine sono prodotte soprattutto dai linfociti T helper (Th) e macrofagi, e la loro attività è relativa alla differenziazione e proliferazione delle cellule immuni: regolano l intensità e la durata della risposta immunitaria, sia cellulare che umorale; regolano la proliferazione e il differenziamento di varie cellule; inducono la risposta infiammatoria; regolano l ematopoiesi; agiscono sulla fisiopatologia dell endotelio vascolare e sulla riparazione dei tessuti. Le citochine sono prodotte dal sistema immunitario durante la fase effettrice dell immunità naturale e di quella specifica, per mediare e controllare la risposta immunitaria, la reazione infiammatoria e la fagocitosi. L azione delle citochine è determinata dal legame al recettore specifico alla cellula bersaglio. Tale legame, attraverso un secondo messaggero intracellulare (solitamente una tirosina chinasi), altera l espressione genica cellulare che si traduce nell aumento o diminuzione dell espressione delle proteine di membrana (incluso i recettori per le citochine), nella proliferazione, nella secrezione di molecole effettrici. Citochine è una denominazione generica, si suddividono in: Linfochine (citochine prodotte dai linfociti) Monochine (citochine prodotte da monociti) Interleuchine (citochine prodotte da un leucocita e che agiscono su altri leucociti). Le caratteristiche principali delle citochine sono: possono agire sulle cellule stesse che le producono (azione autocrina), sulle cellule vicine (paracrina), o in alcune circostanze su cellule distanti (endocrina); differenti tipi cellulari secernono le stesse citochine o una citochina prodotta può agire su differenti tipi cellulari; sono ridondanti nella loro attività poiché funzioni similari possono essere stimolate da differenti citochine; una citochina può indurre nelle cellule target la produzione di citochine addizionali; possono anche agire sinergicamente (due o più citochine agiscono insieme) o in modo antagonista (le citochine causano opposte attività). Il dosaggio delle citochine è limitato dalle seguenti caratteristiche: emivita breve concentrazione plasmatica bassa pleiotropia: le citochine svolgono differenti effetti su diversi tipi di cellule bersaglio ridondanza: più citochine mediano le stesse attività biologiche sinergismo: l effetto combinato di più citochine può risultare maggiore della somma degli effetti biologici delle singole citochine. La determinazione necessita quindi di diversi sistemi di indagine: l analisi dell espressione dei geni implicati nella sintesi delle citochine; misura dell attività delle citochine Un altro gruppo di citochine include interferoni e chemochine. Gli interferoni IFNα e IFNβ inibiscono la replicazione virale nelle cellule infettate, mentre l IFNγ stimola anche l espressione MHC delle cellule presentanti l antigene. Le chemochine attraggono i leucociti nei siti di infezione, hanno residui di cisteina conservati che le classificano in 4 gruppi: C-C chemochine (CC Beta) ( ad es. RANTES, MCP-1, MIP-1α e MIP-1β); C-X-C chemochine (CXC Alfa) (ed es. IL-8); C chemochine (C Gamma) (linfoattine); CXXXC chemochine (fractaalkine). 8

La produzione delle citochine è regolata da segnali specifici sulla membrana delle cellule. Le citochine agiscono sulle cellule target legando recettori specifici di membrana. I recettori e le corrispondenti citochine sono suddivisi in diverse famiglie: Famiglia dei recettori dell ematopoietina Famiglia dei recettori per interferoni Famiglia per i recettori del Tumor Necrosis factor, che hanno 4 domain extracellulari, che includono i recettori per TNFα e TNFβ, il CD40 legato alla membrana (importante per l attivazione delle cellule B e dei macrofagi), e il Fas (che segnala le cellule di procedere all apoptosi) Famiglia di recettori per le chemochine, che hanno 7 eliche transmembrana ed interagiscono con le G protein. Questa famiglia include i recettori per IL8, MIP-1 e RANTES. La principale attività delle citochine è indurre la proliferazione e la differenziazione delle cellule immuni: in particolare, per quanto riguarda le cellule T helper, l azione delle citochine determina la differenziazione in Th1 o Th2. Le cellule T helper hanno due importanti funzioni: Stimolare le cellule immunitarie e infiammatorie Stimolare le cellule B a produrre anticorpi L equilibrio tra l attività Th1 e Th2 può guidare la risposta nella direzione dell immunità umorale o cellulomediata. Nelle malattie autoimmuni l immunità cellulo-mediata e in particolare la risposta linfocitaria T svolge un ruolo patogenetico importante. In particolare, nelle malattie autoimmuni organo-specifiche sono coinvolti i meccanismi patogenetici sostenuti da risposte di tipo Th1, mentre nelle malattie autoimmuni sistemiche sono prevalentemente coinvolti i meccanismi di tipo Th2. Tab. 1: Elenco citochine ed attivita CELLULE T CITOCHINE ATTIVITA Th1 IL-2, IFNγ, TNFb Cellule T e macrofagi, stimolazione delle cellule immunitarie e dell infiammazione. Immunità cellulo-mediata Stimola la produzione dei leucociti a livello del midollo osseo IL-3 e GM-CSF Th2 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 Produzione di anticorpi dalle cellule B. Immunità umorale e ipersensibilità tipo I (IgE) 9

Classificazione delle malattie autoimmuni Le malattie autoimmuni sono classificate in organo e non organo specifiche in base al tipo di autoanticorpo coinvolto nella malattia. In realtà esiste anche un terzo tipo di malattia autoimmune che è definita intermedia, poichè gli autoanticorpi coinvolti sono non-organo specifici (contro antigeni nucleari, mitocondri, gammaglobuline), tuttavia sono presenti infiltrati linfocitari limitati ad un solo organo o apparato (parotide, fegato, colon). La alterazioni a livello dei tessuti sono mediate dalle immunoreazioni definite da Coombs e Gell in quattro tipi principali di ipersensibilità, con aggiunta di un quinto di tipo stimolatorio. In particolare, nelle malattie autoimmuni organo specifiche le lesioni indotte a livello dell organo bersaglio vengono indotte da immunoreazioni di tipo II, IV, V; nelle malattie autoimmuni non organo specifiche o sistemiche le alterazioni prodotte sono indotte da meccanismi immunopatogeni di tipo III; nelle malattie autoimmuni intermedie le immunoreazioni sono mediate da meccanismi di tipo II, III, o IV. Di seguito le tabelle riassuntive relative ai bersagli antigenici specifici e malattie autoimmuni associate. Tab. 2: Malattie autoimmuni organo specifiche ORGANO ANTICORPO PATOLOGIA AUTOIMMUNE Stomaco Pancreas Surrene, Ovaio Tiroide Anti fattore intrinse Anti-cellule parietali gastriche Anti insula pancreatica = ICA Anti decarbossilasi dell acido glutammico 65 = Gad 65 Anti tirosina fosfatasi = IA2 Anti insulina = IAA Anti-cortico-surrenale Anti-21 idrossilasi Anti ovaio Anti-recettori del TSH= TRAK Anemia perniciosa Gastrite atrofica tipo A Diabete Mellito tipo I Malattia di Addison Menopausa precoce Malattia di Basedow Anti-tireoperossidasi = TPO Tiroidite Hashimoto- Mixedema primitivo Anti-tireoglobulina = Tg Rene, Polmone Anti membrana basale del glomerulo = GBM Sindrome di Goodpasture Giunzione neuromuscolare Anti-recettori dell acetilcolina = Ach Anti Proteina Chinasica Specifica = MuSK Anti muscolo striato Anti canali del calcio Miastenia Gravis Sindrome miastenica di Lambert-Eaton 10

Tab. 3: Malattie autoimmuni intermedie ORGANO ANTICORPO PATOLOGIA AUTOIMMUNE Fegato Anti-mitocondri di tipo 2 (anti-piruvato deidrogenasi) = PDH Anti-muscolo liscio Anti- F Actina Anti-antigene solubile epatico = SLA/LP Cirrosi biliare primitiva Epatite autoimmune tipo I Anti-microsomi epatici e renali di tipo anti-citocromo P450 II D6 = LKM1 Anti-citosol epatico = LC1 Cute Anti-sostanza inter-cellulare (Desmogliena 1 e 3) Anti-membrana basale epidermica (BP180 e 230) Anti-transglutaminasi e Anti-endomisio Epatite autoimmune tipo II Pemfigo Pemfigoide Herpes gestationis Dermatite erpetiforme Intestino Anti-SSA Anti-transglutaminasi Anti-endomisio Anti-gliadina Anti-saccharomyces cerevisiae = ASCA Lupus cutaneo subacuto Malattia celiaca Morbo di Crohn Tab. 4: Malattie autoimmune non organo specifiche ANTICORPO Anti-nucleo; Anti-Dna nativo Anti-nucleosoma Anti-Sm, anti-ssa/ro Anti-Ribosoma Anti-nucleo Anti SSA/Ro, anti SSb/La Anti-nucleo Anti-RNP Anti-nucleo; Anti-Jo1; Anti-Pm-Scl Anti-aminoacil trna sintetasi (PL-12, PL-7, EJ, OJ, KS) Anti-Mi-2; Anti-SRP Anti-nucleo Anti-Scl70 Anti-centromero Anti-cardiolipina LAC Anti-Beta2 glicoproteina I Anti-citrullina Fattore reumatoide PATOLOGIA AUTOIMMUNE Lupus Eritematoso Sistemico (LES) Sindrome di Sjögren Malattia mista del tessuto connettivo (MCTD) Polimiosite Dermatomiosite Sclerosi Sistemica Sindrome di CREST Anti-fosfolipidi Artrite reumatoide 11

Inquadramento clinico delle malattie autoimmuni non organo specifiche Lupus eritematoso sistemico (LES) Prevalenza: 14.6 a 50.8 per 100.000 abitanti. In Italia 20 ogni 100.000 abitanti. Incidenza: 2.6 a 4.6 ogni 100.000 abitanti CRITERI CLINICI Alterazioni ematologiche: anemia emolitica leucopenia linfocitopenia Trombocitopenia Disordini immunologici: autoanticorpi anti dsdna autoanticorpi anti Sm positività degli anticorpi antifosfolipidi (LAC) aumentati livelli di anticardiolipina IgG o IgM autoanticorpi anti nucleo (ANA) CRITERI DIAGNOSTICI Eritema a farfalla Eritema discoide Fotosensibilità Ulcere orali Artrite Sierosite (pericardite e/o polmonite) (proteinuria > 0.50 g/die e/o cilindri) Manifestazioni neurologiche (psicosi/convulsioni) Artrite reumatoide (AR) Prevalenza 500 casi /anno. Incidenza 1 milione /anno. La diagnosi è principalmente clinica. CRITERI CLINICI Rigidità mattutina della durata di almeno un ora Artrite a livello di almeno 3 articolazioni, interessate simultaneamente, con tumefazione e versamento rilevati da un medico. Artrite delle mani a livello delle articolazioni interfalangee, prossimali, metacarpofalangee o radio-carpiche. Artrite simmetrica ad interessamento simultaneo delle stesse articolazioni. Noduli reumatoidi sottocutanei sulle superfici ossee estensorie o iuxtaarticolari, osservate da un medico. FR presente a livello del siero. Segni radiologici (osteoporosi iuxtaarticolare o erosioni a livello delle mani o polsi). CRITERI DIAGNOSTICI FR presente nel 70% dei casi Anti CCP presente nell 80% dei casi Esami sul liquido sinoviale, caratteristiche chimico-fisiche: Volume: > 4 ml Colore: giallo carico Trasparenza: opaco Viscosità: ridotta Coagulo: friabile Cellule/mm3 : 2000-50000 Polinucleati (%): > 70 12

E inoltre possibile eseguire i seguenti esami nel liquido sinoviale ma con una sensibilità e specificità non adeguate e sufficienti ai fini diagnostici : Proteine che sono aumentate fino a 4-7 g/dl Glucosio diminuito Frazioni del complemento diminuite FR che si comporta come nel siero e talvolta può essere presente nel liquido sinoviale ma assente nel siero e quindi utile per le AR sieronegative. Conteggio dei globuli bianchi tra 2000 e 50000 ed il 90% sono granulociti neutrofili Livelli elevati di tutte le citochine proinfiammatorie IL1, IL6, IL8, TNFα, IL1β. TNFα e IL1β sono i maggiori responsabili del danno articolare. L esame sul liquido sinoviale nei pazienti in corso di Artrite Reumatoide può risultare utile per identificare l origine flogistica del campione, potendo fornire informazioni al clinico sia di tipo prognostico che di un efficace terapia, anche se non è possibile raggiungere una diagnosi precisa. Sindrome Sjögren (SS) e crioglobulinemia mista I dati di prevalenza ed incidenza della SS non sono noti. CRITERI CLINICI Sintomi oculari: risposta affermativa ad almeno 1 delle 3 domande validate Sintomi orali: risposta affermativa ad almeno 1 delle 3 domande validate Segni oculari: risultato positivo al test di Schirmer I e/o test con Rosa bengala Analisi istopatologica delle ghiandole salivari minori Coinvolgimento delle ghiandole salivari Autoanticorpi: presenza di anticorpi anti-ssa o anti-ssb o entrambi Per la definizione di SS primaria La presenza di almeno 4 su 6 dei precedenti criteri, di cui uno almeno istopatologico e uno almeno sierologico. Criteri di esclusione Irradiazione testa-collo, infezione da HCV e HIV, linfoma pre-esistente, sarcoidosi, GVHD, uso di farmaci anticolinergici. CRITERI DIAGNOSTICI Leucopenia (<4000/ul) Linfopenia (<1500/ul) ANA ( 1/80) speckled Anti SSA Anti SSB Fattore Reumatoide (>20UI/ml) Crioglobuline Ipergammaglobulinemia (> 1800 mg/ml) Componente monoclonale sierica C3 ridotto C4 ridotto LDH elevato Beta2-microglobulina sierica elevata 13

Poli/Dermatomiositi Gli autoanticorpi anti nucleo ANA si rilevano nel 60-80% dei pazienti con miopatia autoimmune. Tuttavia il test ANA non è specifico e risulta negativo nel 20% dei pazienti con miosite autoimmune. Il test ANA deve essere affiancato da test più specifici per la ricerca delle specificità antigeniche. Di seguito i tests specifici e le ricerche autoanticorpali associate alla Miosite. CRITERI DIAGNOSTICI Miosite specifici Gli anticorpi miosite-specifici (MSA) sono caratteristici di miosite e considerati markers di malattia: Anti-Jo1 (istidil-trna sintetasi) Anti-aminoacil trna sintetasi (PL-12, PL-7, EJ, OJ, KS) Anti-Mi-2 Anti-SRP CRITERI DIAGNOSTICI Topoisomerasi I (Scl70) nel 70% in SSc cutanea diffusa Centromero nel 70-80% in SSc cutanea limitata RNA pol I 4% dei casi (marker diagnostico) Fibrillarina 8% dei casi (marker diagnostico) PM-Scl 3% dei casi To/Th rara Ku rara NOR-90 rara Sclerosi sistemica progressiva Prevalenza 240-280 casi per milione, incidenza 18-20 casi per milione di abitanti/anno. CRITERI CLINICI Malessere generalizzato (astenia, calo ponderale, febbricola) interessamento cutaneo (diffuso, limitato) Fenomeno Raynaud interessamento gastrointestinale interessamento polmonare interessamento cardiaco interessamento renale CRITERI DIAGNOSTICI Topoisomerasi I (Scl70) nel 70% in SSc cutanea diffusa Centromero nel 70-80% in SSc cutanea limitata RNA pol I 4% dei casi (marker diagnostico) Fibrillarina 8% dei casi (marker diagnostico) PM-Scl 3% dei casi To/Th rara Ku rara NOR-90 rara 14

II. DIAGNOSTICA 1. Linee Guida Il metodo di riferimento per la ricerca degli autoanticorpi anti nucleo è l immunofluorescenza indiretta su cellule Hep-2 2. Con questa metodica è possibile rilevare la presenza di autoanticorpi che riconoscano antigeni nucleari e citoplasmatici senza identificarli in modo specifico: quindi, in caso di positività per gli autoanticorpi anti nucleo è consigliata la ricerca specifica degli antigeni nucleari estraibili (ENA screen) ed ENA profilo come conferma. Con la metodica in Immunofluorescenza indiretta, in caso di esito positivo vengono descritti i seguenti quadri fluoroscopici o patterns 2 : Quadri fluoroscopici più comuni: PATTERN ANTIGENI ASSOCIAZIONE CLINICA Omogeneo Istoni,dsDna, Complessi Dna-istoni LES, LES indotto da farmaci Granulare (punteggiato) Nucleolare Centromerico (CENP-A; B, C) Sm, RNP, SSA(Ro), SSB(La) fibrillarina, RNA polimerasi, NOR90, Scl70, PM/Scl Proteine centromeriche A,B,C Malattie autoimmuni reumatiche, LES, MCTD, SS Malattie autoimmuni reumatiche, LES, Sclerodermia, Miositi Sclerodermia, Sindrome CREST Nuclear Dots Sp 100, PBC 95 NSpl (proteina 95/100 kd) Malattie autoimmuni epatiche e reumatiche Quadri fluoroscopici mitotici: PATTERN ANTIGENI ASSOCIAZIONE CLINICA Fuso mitotico NUMA Fibre del fuso mitotico Midbody Proteina 235-kDa Antigeni dei poli del fuso comprendenti la tubulina Antigeni presenti nel solco di clivaggio delle cellule in divisione LES e altre patologie reumatiche Non definite SSc Cetrioli Antigeni del centrosoma Non definite raramente SSc 15

Quadri fluoroscopici Citoplasmatici: PATTERN ANTIGENI ASSOCIAZIONE CLINICA Mitocondri Ribosoma Antigeni associati al complesso Piruvato Deidrogenasi Fosfoproteine dei ribosomi P0, P1, P2 Tipo M2-M4 Cirrosi Biliare Primitiva LES con coinvolgimento del sistema nervoso centrale Lisosoma Antigeni lisosomiali Non definite Golgi Proteine del Golgi Non definite Granulare (Jo1) Istidil-tRNA sintetasi PM Citoscheletro Actina, Vimentina, Citocheratina Epatopatie, AR, MCTD Quadri fluoroscopici rari: PATTERN ANTIGENI ASSOCIAZIONE CLINICA PCNA Proliferating Nuclear Antigen LES CENP-F Proteina Centromerica F Tumori, malattie croniche epatiche, malattie sistemiche reumatiche Nuclear Matrix hnrnp LES, SSc, MCTD NOR90 Nucleolar Organizing Regions SSc Membrana nucleare Lamine nucleari A,B,C, e pori nucleari Epatopatie autoimmuni Legenda: LES = Lupus Eritematoso sistemico; SS = Sindrome di Sjögren; SSc = Sclerosi Sistemica cutanea; MCTD = Malattie del Tessuto Connettivo Miste; PM = Polimiosite; AR = Artrite Reumatoide; CREST = Calcinosi, fenomeno di Raynaud, Esofagodattilia, Sclerodattilia, Telangectasia. 16

2. Descrizione degli antigeni e associazioni cliniche SSA L antigene intracellulare SS-A/Ro è un bersaglio per la risposta autoimmune in molti pazienti con Lupus Eritematoso Sistemico (LES), Sindrome di Sjögren (SS) ed altre malattie del connettivo 2. Gli studi hanno dimostrato che gli anticorpi anti-ss-a/ro si trovano nel 95% dei pazienti con la Sindrome di Sjögren primaria e nel 30-50% dei pazienti con LES, essendo associati particolarmente con dermatite fotosensibile. Gli autoanticorpi si trovano spesso anche nella maggioranza di pazienti con Lupus Eritematoso cutaneo subacuto o LES anticorpo antinucleare negativo. ANTICORPI ANTI SSA (Ro) 52 kd ANTICORPI ANTI SSA (Ro) 60 kd L antigene SSA (Ro) è costituito da due proteine 52 kd e 60 kd. La positività solo per autoanticorpi anti SSA 52 kd, secondo alcuni studi, è rilevabile quasi esclusivamente in soggetti con SS (Sindrome di Sjögren), mentre la presenza di solo autoanticorpi anti SSA 60 kd è rilevabile nei soggetti affetti da LES 2. Inoltre la positività soprattutto per anticorpi anti SSA 52 kd, ma anche per SSA 60 kd nel siero materno, possono causare lo sviluppo del LES neonatale, con conseguente manifestazione clinica del blocco atrio-ventricolare congenito. SSB L antigene intracellulare SS-B/La è un bersaglio per la risposta autoimmune in molti pazienti con Sindrome di Sjögren (SS), Lupus Eritematoso Sistemico (LES), e altre malattie del connettivo. Gli studi hanno dimostrato che gli anticorpi anti-ss-b/la si trovano nell 87% dei pazienti con la Sindrome di Sjögren primaria e nel 15% circa dei pazienti con LES. Gli autoanticorpi si trovano spesso anche in presenza di anti-ss-a/ro. SM L antigene intracellulare Sm è un bersaglio per la risposta autoimmune in molti pazienti con Lupus Eritematoso Sistemico (LES) ed è considerato altamente specifico per questa malattia 2. Gli anticorpi anti-sm reagiscono con le piccole ribonucleoproteine nucleari (snrnp) che contengono almeno 9 polipeptidi. Gli studi di immunoblotting hanno comunque dimostrato che gli anticorpi anti-sm si legano principalmente alle proteine SmB, SmBI e SmD. Gli studi hanno anche dimostrato che gli anticorpi anti-sm si manifestano nel 30-40% dei pazienti con LES, ma sono state osservate percentuali più elevate in pazienti non caucasici. SM/RNP L antigene intracellulare Sm/RNP è un complesso di componenti Sm e RNP. Il complesso antigene Sm/ RNP è un bersaglio per la risposta immune in molti pazienti con la malattia mista del connettivo (MCTD), Lupus Eritematoso Sistemico (LES), Sindrome di Sjogren primaria (SS) e Sclerodermia (PSS)2. Gli studi hanno dimostrato che gli anticorpi anti-sm/rnp si manifestano in oltre il 95-100% dei casi di MCTD, nel 35-45% dei pazienti con LES e nel 30% circa dei pazienti con SS. ANTICORPI ANTI RNP ANTI RNP 68 ANTI RNP A Gli autoanticorpi anti RNP (ribonucleoproteina) riconoscono nella maggior parte dei casi gli antigeni U1 68-70 kd e U1-A. La positività per questi antigeni si rileva nei pazienti affetti da Artrite reumatoide, miocardite e nei pazienti affetti da LES. Gli autoanticorpi anti RNP sono presenti in pazienti affetti da LES con una sensibilità diagnostica del 30% e 40%, ma hanno una bassa specificità, poiché presenti in elevata percentuale nei soggetti con MTCD (malattie del tessuto connettivo miste). Sono significativi quando presenti a titolo elevato poiché sono criterio diagnostico importante nei pazienti affetti da MTCD, anche se il dato quantitativo non correla con l andamento della patologia. Non sono indicativi di patologia specifica quando presenti in basse concentrazioni perché sono rilevabili in altre malattie reumatiche come la sclerosi sistemica e l artrite reumatoide. 17

Tuttavia è stato recentemente dimostrato un ruolo predittivo nel lupus, dato che possono essere evidenziati nel siero fino a 7 anni prima della comparsa della patologia. SCL70 L antigene intracellulare Scl-70 è un bersaglio per la risposta autoimmune in molti pazienti con Sclerodermia o Sclerosi Sistemica Progressiva (SSP) ed è considerato specifico per questa malattia. Gli anticorpi anti-scl-70 si trovano nel 20-30% circa dei pazienti affetti da Sclerodermia 2. Circa il 20-30% dei pazienti affetti da Sclerodermia presentano caratteristiche sintomatologiche tipiche della sindrome di CREST (Calcinosi-Raynaud-Esofagodattilia-Sclerodattilia-Telangectasie). JO1 L antigene ENA Jo-1 è un bersaglio per la risposta autoimmune in molti pazienti con Polimiosite e Dermatomiosite e gli anticorpi anti Jo-1 sono considerati indicatori per queste malattie. Nella Polimiosite il muscolo striato si infiamma e la fibra muscolare si degrada 2. Quando sussiste questa condizione, assieme ai cambiamenti tipici cutanei, è conosciuta come Dermatomiosite. Circa il 25% dei pazienti affetti da queste malattie autoimmuni dimostrano livelli superiori di anticorpi anti-jo-1. Gli anticorpi Jo-1 sono inoltre associati alla fibrosi polmonare ed al fenomeno di Raynaud (estremo spasmo dei vasi sanguigni in risposta al freddo o allo stress). ANTI CENTROMERO CENP-B Gli anticorpi anti centromero riconoscono una famiglia di proteine localizzata nella regione centromerica delle cellule eucariotiche. Le proteine associate al centromero sono CENP-A, CENP-B, CENP-C, CENP-D, CENP-E, CENP-F e CENP-G. Le tre principali proteine sono CENP-A, CENP-B, CENP-C. La positività per gli anticorpi anti centromero è associata alla Sclerosi Sistemica Cutanea limitata (lcssc), soprattutto la sua variante limitata o CREST. Gli anticorpi anti centromero possono essere identificati anche in altre condizioni patologiche come AR, LES, SS e PBC (Cirrosi Biliare Primitiva) 2. La SSc limitata cutanea è una patologia limitata alla pelle, alle estremità delle braccia, basse gambe e talvolta faccia e collo. E denominata anche CREST (Calcinosi, fenomeno Raynaud, Esofagodattilia, Sclerodattilia, Telangectasia). L utilizzo diagnostico di questo test è stimato con una sensibilità del 33% e una specificità del 99.9%. L utilizzo come marcatore prognostico e di definizione del subset cutaneo limitato è caratterizzato da una sensibilità del 61% e specificità del 84%, mentre non si riscontra una rilevanza clinica come marcatore per il monitoraggio della patologia. ANTI DNA NATIVO o dsdna (double-strand DNA = DNA a doppia elica) Il DNA è un antigene presente sia sotto forma di doppia elica (ds = double strand) o nativo che in singola elica (ss = single strand). La ricerca degli autoanticorpi è rivolta soprattutto verso la forma nativa del DNA o a doppia elica perché è più specifico per la patologia LES. Ci sono due importanti ma differenti utilizzi diagnostici della ricerca degli autoanticorpi anti Dna nativo: screening e ausilio diagnostico in caso di sospetta malattia autoimmune monitoraggio clinico di pazienti affetti da LES In pazienti con LES in fase attiva si rilevano livelli elevati di autoanticorpi anti dsdna, mentre in pazienti in fase di remissione questi autoanticorpi sono presenti in basse concentrazioni, o assenti. Gli autoanticorpi presenti in circolo, tuttavia, comprendono una popolazione anticorpale che differisce per: Avidità (bassa o alta avidità) Classe immunoglobulinica Specificità antigenica 18

Per la diagnosi del LES il test utilizzato per la ricerca degli autoanticorpi anti ds-dna deve avere un elevata specificità, tuttavia per quanto riguarda l avidità anticorpale, questa caratteristica è inversamente proporzionale alla sensibilità del test; infatti per rilevare gli autoanticorpi a bassa avidità è necessario utilizzare metodi con una maggiore sensibilità a scapito della specificità. Esiste una correlazione tra l avidità anticorpale e l implicazione dell organo: gli anticorpi ad alta avidità sono correlati all implicazione renale, mentre gli anticorpi a bassa avidità sono presenti anche in patologie reumatiche diverse dal LES oppure in pazienti con forme di LES meno aggressive o con bassa frequenza di episodi di nefrite. CELLULA TIMICA LINF. T Per i motivi sopra descritti in funzione della diversa avidità anticorpale, per lo screening è consigliabile eseguire un metodo con un elevata sensibilità e successivamente, in caso di positività, eseguire un secondo test con elevata specificità. ANTI ssdna (single-strand DNA = DNA a singola elica) Gli autoanticorpi anti ssdna sono rivolti contro la componente basica che nel DNA a doppia elica (dsdna) è mascherata all interno della struttura a elica. Sono presenti nell 87% dei pazienti affetti da LES nelle fasi acute e nel 43% dei pazienti nelle fasi inattive. Rappresentano un utile strumento diagnostico nella diagnosi differenziale tra LES e LES indotto da farmaci, tuttavia sono rilevabili in concentrazioni elevate anche in pazienti affetti da Mononucleosi, Epatite e varie forme di Leucemia. ANTICORPI ANTI CROMATINA (NUCLEOSOMA) Il DNA nella cellula è presente complessato in nucleosomi che rappresentano la struttura base della cromatina. I nucleosomi sono costituiti da un dimero di quattro proteine istoniche H2A, H2B, H3, H4 complessate con il DNA. I nucleosomi sono uniti tra loro mediante un filamento di DNA a cui è attaccato la proteina istonica H1. Ottamero istonico Istone H1 DNA Fig. 3: Nucleosoma Gli autoanticorpi anti nucleosomi sono presenti in diverse patologie autoimmuni, anche se prevalenti nel LES (3) : Nucleosoma Tab. 5: Patologie autoimmuni e anticorpi anti nucleosoma PATOLOGIA % ANTICORPI ANTI NUCLEOSOMA LES (Lupus Eritematoso Sistemico) 85.1% AR (Artrite Reumatoide) 45.4% MTCD (Malattie del tessuto connettivo miste) 41.1% SSc (Sclerosi Sistemica cutanea) 36.3% SS (Sindrome di Sjögren 10% 19

Data la maggiore prevalenza di positività nel LES, la presenza di questi anticorpi potrebbe precedere la formazione di anticorpi specifici anti nucleari come anti ds-dna e anti istoni (8). Esistono dati contrastanti relativamente all utilità diagnostica della ricerca degli autoanticorpi anti nucleosomi, al significato clinico e specificità di questi autoanticorpi per il LES, ed il loro utilizzo come indicatori per il monitoraggio della patologia e di coinvolgimento d organo. Da alcuni studi è emerso che proprio per la maggiore prevalenza di positività nella patologia LES possono essere inseriti come test aggiuntivo nella diagnostica della patologia per le seguenti caratteristiche (7) : per alcuni pazienti affetti da LES sono presenti in maggiore prevalenza rispetto agli autoanticorpi anti dsdna presentano una migliore correlazione con il lupus nefritico o l attività della patologia nel LES rispetto agli anticorpi anti dsdna la reattività per gli autoanticorpi anti nucleosomi può essere rilevata nel 40% dei pazienti con lupus che sono negativi per gli autoanticorpi anti dsdna ANTICORPI ANTI ISTONI Gli autoanticorpi anti istoni sono rivolti contro le proteine H1, H2A, H2B, H3, H4, e sono presenti in diverse patologie autoimmuni, sistemiche e organo specifiche come LES (Lupus Eritematoso Sistemico), AR (Artrite Reumatoide), Artrite cronica giovanile, Cirrosi biliare primitiva, Epatite Autoimmune, Polimiosite/Dermatomiosite. Inoltre sono presenti in pazienti con patologie autoimmuni indotte da farmaci, patologie neurologiche e infettive. A differenza degli autoanticorpi anti nucleosoma la positività per gli anticorpi anti istoni non è indicativa di patologia, data anche la loro presenza in diverse patologie: quindi non hanno nessuna utilità dal punto di vista diagnostico e prognostico. Il valore prognostico degli autoanticorpi anti nucleosomi per la progressione della patologia ed il monitoraggio nelle fasi culminanti della malattia autoimmune non è ancora chiaro. Secondo altri studi, nonostante l elevata prevalenza di presenza di questi autoanticorpi in pazienti affetti da LES, non sono ancora ben chiari alcuni punti: se rappresentano markers specifici della patologia; se sono effettivamente indicatori utili per il monitoraggio; se esiste un effettiva correlazione tra la positività per questi autoanticorpi, l attività della malattia e il danno renale(3). 20

Il metodo di riferimento per la ricerca degli autoanticorpi per le patologie sistemiche non organo-specifiche è l immunofluorescenza indiretta. Questa metodica prevede l utilizzo di un substrato costituito da cellule Hep-2 (cellule epiteliali da carcinoma di laringe). Il siero viene dispensato su questo substrato ed incubato per la ricerca degli eventuali autoanticorpi presenti. Per l identificazione anticorpale e la visione mediante microscopia a fluorescenza si utilizza un coniugato associato ad un fluoroforo FITC specifico. Questa metodica è caratterizzata da un elevata sensibilità perché permette di rilevare autoanticorpi contro tutti gli antigeni nucleari e citoplasmatici, ma ha una scarsa specificità poiché non riesce ad individuare in modo specifico l antigene. Per l identificazione degli antigeni nucleari e citoplasmatici specifici (ENA) è necessario procedere all approfondimento diagnostico con Ena profilo cioè il dosaggio degli antigeni: Ssa, SSb, Sm, Sm/RNP, Jo1, Scl70, CENP-B. La metodica in immunofluorescenza presenta delle limitazioni determinate da: perdita di alcuni antigeni critici (Ssa, SSb, Jo1, Ribosoma P, RNP) legato alla metodica stessa o per difficoltà interpretative difficoltà di riproducibilità dei dati legato alla lettura soggettiva a microscopio e alla metodica tempistica di refertazione bassa specificità Fig. 4: Immagini di autoanticorpi anti nucleo con metodica immunofluorescenza indiretta. Substrato cellule Hep-2 21

Per i motivi sopra descritti, sono state valutate metodiche di screening alternative. Le metodiche valutate sono ELISA e nuove tecnologie (chemiluminescenza, luminescenza), che utilizzano substrati costituiti da un mix di antigeni nucleari e citoplasmatici specifici per le connettiviti autoimmuni. Le caratteristiche di sensibilità e specificità dei differenti metodi sono di seguito riportate: Tab. 6: Specificità dei differenti metodi METODI % SENSIBILITÀ E SPECIFICITÀ IFA (Immunofluorescenza indiretta) sensibilità 92% specificità 65% ELISA sensibilità compresa tra 32% e 69% specificità compresa tra 68% e 98% MULTIPLEX LUMINEX sensibilità compresa tra 77% e 100% specificità compresa tra 92% e 100% CHEMILUMINESCENZA sensibilità 96.30% specificità 97.60% Le linee guida per la ricerca degli autoanticorpi anti nucleo (2), identificano come test di riferimento la metodica in immunofluorescenza indiretta su cellule Hep- 2, tuttavia è possibile utilizzare un metodo di screening alternativo solo se soddisfa i seguenti requisiti: Concordanza con il metodo IFA non inferiore al 90% (livello decisionale > o = 1/160) Ogni laboratorio deve valutare l applicabilità di questi livelli decisionali in base alle caratteristiche della propria casistica/popolazione Riconoscere autoanticorpi importanti dal punto di vista prognostico, come quelli diretti verso i nucleoli o la membrana nucleare I risultati positivi devono essere successivamente confermati con il metodo IFA, con specificazione del pattern e del titolo I dati discordanti (positivi con metodo di screening e negativi in IFA) vanno valutati per la presenza di anti-ssa e Jo1; se questi antigeni sono negativi la positività con il metodo di screening è da considerarsi come falso positivo, tranne in caso di sospetto clinico di MAIS (Malattie autoimmuni immunitarie sistemiche), dove i pazienti vanno monitorati nel tempo. 22

Nuove prospettive La disponibilità di nuove tecnologie ci ha permesso di valutare metodiche alternative all immunofluorescenza indiretta: in particolare abbiamo analizzato 1205 sieri richiesti in routine per la ricerca degli autoanticorpi antinucelo con la metodica in immunofluorescenza indiretta e con la tecnologia Multiplex Luminex, median te la strumentazione automatica Bioplex 2200. A seguito di questo studio descritto in un poster presentato al Congresso Internazionale di Autoimmunità tenutosi a Porto nel Settembre 2008, BioPlexTM2200 MULTIPLEX ANASCREEN ASSAY: A NOVEL AP PROACH FOR THE DETECTION OF ANTINUCLEAR AUTOANTIBODIES, abbiamo inserito questo sistema per lo screening degli autoanticorpi anti nucleo. Il nuovo test ANA screen prevede la ricerca degli autoanticorpi contro gli antigeni dsdna, Cromatina (nucleosoma), P-ribosoma, SSA, SSB, Sm, snrnp, Sm/ RNP, Scl-70, Jo1, centromero CENP-B per le malattie autoimmuni non organo specifiche, connettiviti autoimmuni: Lupus Eritematoso Sistemico (LES), Malattie del Tessuto Connettivo Miste (MCTD), Polimiositi/Dermatomiositi (PM/DM), Artrite Reumatoide (AR), Sclerosi Sistemica cutanea (SSc), Sindrome di Sjögren (SS), Sclerodermia, CREST (Calcinosi, fenomeno di Raynaud, disfunzione esofagea, sclerodattilia e telangectasia) (tab. 7). Questa tecnologia consente l identificazione di diversi analiti contemporaneamente sullo stesso campione, utilizzando beads (microsfere) magnetiche con adesi gli antigeni nucleari e citoplasmatici. Il siero viene incubato con la miscela delle beads e dopo l aggiunta di un anticorpo anti IgG umano legato ad un secondo fluoroforo specifico, le beads passano attraverso un citometro a flusso che identifica e quantifica il segnale. Il sistema prevede inoltre l utilizzo di 3 beads specifiche per la verifica del funzionamento del sistema di lettura, delle interferenze causate da legami aspecifici, della presenza del volume di campione necessario per l esecuzione del test. Le caratteristiche principali del test ANA screen, in confronto alla metodica in Immunofluorescenza Indiretta, sono rappresentate dalla possibilità di rilevare gli autoanticorpi contro antigeni critici non rilevabili con la metodica in Immunofluorescenza Indiretta, dalla standardizzazione e riproducibilità dei dati, in particolare per i campioni con esiti di dubbia o bassa positività, e dalla riduzione delle tempistiche di refertazione. identificazione di autoanticorpi contro gli antigeni critici per la metodica immunofluorescenza indiretta (IFI), quali: Ssa/Ro con la possibilità di distinguere e dosare SSA 52 kd e 60 kd, Jo1, P Ribosoma, U1 snrnp distinto nelle frazioni A e 68 kd associati alle Malattie del Tessuto Connettivo Miste (MCTD) standardizzazione e riproducibilità dei dati riduzione delle tempistiche di refertazione Il test in immunofluorescenza indiretta viene utilizzato solo a seguito della positività del test ANA screen con metodica Multiplex Luminex. Il test in Immunofluorescenza Indiretta viene comunque eseguito su richiesta per i pazienti con patologie autoimmuni in monitoraggio (Artrite Reumatoide, Epatopatie Autoimmuni etc.), o pazienti con forte sospetto e sintomatologia decisamente suggestiva di patologia autoimmune, con esito ANA screen negativo. Queste richieste particolari e le informazioni cliniche del paziente vengono raccolte mediante una Scheda Anamnestica che abbiamo consegnato a tutti i nostri punti prelievo e ai nostri laboratori clienti service. E molto utile quindi per la diagnostica delle patologie autoimmuni avere le informazioni cliniche del paziente e una collaborazione diretta con il Medico/Specialista. 23

Algoritmo diagnostico Per le richieste di screening per le Connettiviti Autoimmuni abbiamo introdotto il seguente algoritmo diagnostico: ANA screen Multiplex Luminex dsdna Multiplex Luminex ENA screen Multiplex Luminex POS/DUB NEG POS/DUB NEG POS NEG IFT REF* IFT REF ENA REF Prof. Fig. 5: Screening per le Connettiviti Autoimmuni *In caso di esiti negativi per ANA screen e forte sospetto di malattia autoimmune e/o su richiesta specifica del Medico/ Specialista eseguiamo il test in Immunofluorescenza Indiretta. Legenda: IFA= Immunofluorescenza Indiretta; REF=Refertazione 24

In tabella 6 riportiamo l elenco degli antigeni, utilizzati per lo screening degli autoanticorpi antinucleo mediante tecnologia Multiplex Luminex, con la descrizione dell origine dell antigene e le associazioni cliniche. Tab. 7: Elenco antigeni e associazioni cliniche ANTIGENI ORIGINE ANTIGENI ASSOCIAZIONI CLINICHE DsDNA(1) Sintetizzato da PCR LES 40-80% CROMATINA (3) Nucleoistone purificato LES AR MTCD SSc SS SSA (4,5) SSA 52 kd SSA 60 kd SSB (4,5) SM (4,5) SM/RNP (1,4,5,) Antigene purificato per affinità Antigene purificato per affinità Antigene purificato per affinità Antigene nativo purificato SS, LES, LES neonatale incluso il blocco cardiaco congenito LES SS PERCENTUALE PREVALENZA ANTICORPALE 85.1% 45.4% 41.1% 36.3% 10% LES 25-40% MTCD LES 25-30% LES 40% SS 15% 50-60% di solito associati a SSA 95% 30-70% RNP (4,5) Antigene ricombinante MTCD 46% RNP 68 kd RNPA CENTROMERO CENP B (6) Antigene ricombinante CREST Sclerosi cutanea limitata (lcssc) 70-80% P RIBOSOMA( 1,7) Antigene purificato per affinità SCL 70 (4,5,6) Antigene ricombinante Sclerodermia SSc diffusa LES associato con nefrite e coinvolgimento del SNC, incluso epilessia e disordini psichiatrici 10-40% 20-28% 70% Jo1 (4,5) Antigene ricombinante Polimiosite 18-36% Legenda: LES= Lupus Eritematoso Sistemico. SS= Sindrome di Sjögren. SSc= Sclerosi Sistemica cutanea CREST= Calcinosi, fenomeno di Raynaud, disfunzione esofagea, sclerodattilia e telangectasia. MCTD= Malattia del Tessuto Connettivo Mista 25

Per ottimizzare ed utilizzare al meglio le potenzialità di questa nuova tecnologia, consigliamo di seguire il seguente algoritmo diagnostico: ANA SCREEN MULTIPLEX LUMINEX (ANA-ENA SCREEN-dsDNA) POS/DUBBIO NEG PANNELLI SPECIFICI MULTIPLEX LUMINEX: Connettiviti LES MCTD SS Sclerodermia/SSP In caso di forte sospetto di malattia autoimmune e/o richiesta specifica del Medico/ Specialista, si procede con l esecuzione del test Immunofluorescenza Indiretta su cellule Hep-2. Per sospetto di Polimiosite/Dermatomiosite e patologie autoimmuni del fegato si procede con l esecuzione dei test specifici in Immunoblot Fig. 6: Seguente algoritmo diagnostico Legenda: Pannello connettiviti Pannello LES Pannello MCTD Pannello SS Pannello sclerodermia (SSP)/CREST DsDNA, Cromatina, Ssa (52&60 kd), SSb, Sm, Sm/RNP, RNP(A&68 kd), Scl70, Jo1, Ribosoma P, CENP-B dsdna, Cromatina, Ssa (52&60 kd), SSb, Sm, Sm/RNP, Ribosoma P RNP68&A kd Sm/RNP Ssa52&60 kd SSb Scl70, CENP-B 26

CONCLUSIONI RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI Con questa brochure abbiamo tracciato un percorso sintetico relativo alle nozioni base di immunologia, le problematiche immunologiche che possono determinare le patologie autoimmuni, la descrizione delle patologie stesse e i metodi diagnostici. La diagnostica di queste patologie è tuttavia complessa e la Medicina di Laboratorio può solo fornire un supporto al clinico che in funzione della sintomatologia valuterà attentamente tutto il quadro degli esami eseguiti. Per questo il nostro Laboratorio è sempre attento alle nuove tecnologie che possano facilitare ed aiutare lo specialista nell inquadramento delle patologie autoimmuni in tempistiche ristrette mantenendo la qualità del dato analitico o in alcuni casi migliorandola. I nuovi algoritmi diagnostici proposti hanno proprio l obiettivo di snellire la richiesta di questi esami e di fornire utili informazioni per gli eventuali approfondimenti diagnostici specifici. Per la caratteristica di questa diagnostica sempre in evoluzione, a questa prima edizione della Brochure relativa all autoimmunità faranno seguito degli aggiornamenti. 1) R.Tozzoli, N. Bizzarro, D. Villalta, E. Tonutti. Il laboratorio nelle malattie reumatiche autoimmuni. 2). R. Tozzoli; N. Bizzarro. La diagnostica di laboratorio delle malattie autoimmuni sistemiche. La Medicina di Laboratorio Vol. IX N.1, 1998. 3) P. Quattrocchi e coll. Ruolo degli anticorpi anti-nucleosoma nel lupus eritematoso sistemico. Risultati di uno studio condotto in pazienti con lupus eritematoso sistemico ed altre connettiviti sistemiche. Reumatismo, 2005; 57(2):109-113. 4) White, R. H.; Robbins, D. L: Clinical Significance and Interpretation of Antinuclear Antibodies. West. J. Med. 1987, 147, 210-213. 5) Maddison, P. J.; Skinner, R. P.; Vlachoyannopoulos, P. ; Brennand, D. M. ; Hough, D. Antibodies to nrnp, Sm, Ro(SSA) and La(SSB) detected by ELISA: their specificity and inter-relations in connective tissue disease sera. Clin.Exp. Immunol. 1985, 62 337-345. 6) D. Bassetti. Gli esami di autoimmunologia nella diagnosi e nel monitoraggio della Sclerosi Sistemica. La risposta del laboratorio. RIMeL/IJLaM 2007; 3 (suppl). 7) Y.Sherer, Y. Shoenfeld. Autoantibodies guide in Systemic Lupus Erythematosus. First Edition. E. Jenny Heathcote Management of Primary Biliary Cirrhosis. Hepatology Vol 31, No. 4, Aprile 2000. 27

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