Richiesta nuovo Assegno di Ricerca Tutor proponente: Prof. Davide Pettener TITOLO: Analisi di marcatori uniparentali mediante sequenziamento massivo parallelo in popolazioni umane di origine europea OBIETTIVI DEL PROGETTO DI RICERCA Nonostante il continuo progresso degli approcci sperimentali e di analisi dati nell ambito della genomica di popolazioni, lo studio della variabilità dei polimorfismi del DNA mitocondriale e del cromosoma Y continua a rappresentare uno strumento estremamente informativo per la ricostruzione della storia genetica dei vari gruppi umani. In particolare, l eredità uniparentale di questa tipologia di polimorfismi ne fa tuttora i marcatori genetici ideali per la descrizione dettagliata di processi demografici (es. migrazioni) e/o micro-evolutivi (es. flusso genico o isolamento) che possono aver interessato in maniera differenziale la componente femminile e quella maschile di una popolazione. Per tale motivo, notevoli passi avanti sia dal punto di vista delle tecnologie impiegate sia per quanto riguarda le metodologie di analisi dei dati generati sono stati compiuti anche in questo ambito specifico dello studio dell evoluzione umana. Il costante perfezionamento dei protocolli sperimentali e la riduzione dei costi legati all utilizzo di piattaforme per il sequenziamento massivo parallelo (next generation sequencing, NGS) hanno infatti permesso di aumentare progressivamente il livello di risoluzione dell analisi di questi marcatori ad eredità uniparentale, permettendo una caratterizzazione sempre più dettagliata di linee e sottolinee filogenentiche. Sulla base di queste premesse, il presente progetto si pone l obiettivo di effettuare un analisi approfondita della variabilità del DNA mitocondriale e del cromosoma Y in un ampio pannello di campioni provenienti da diverse popolazioni di ancestralità europea, che saranno selezionati e raccolti secondo i più stringenti criteri attualmente in uso in questo tipo di studi (Sarno et al. 2014). Le popolazioni oggetto d indagine saranno scelte in modo da massimizzare le informazioni su quei gruppi europei per i quali al momento non sono disponibili dati di tipo genomico e/o generati ad un elevato livello di risoluzione per quanto riguarda il DNA mitocondriale (es. genoma completo) o il cromosoma Y. Ciò permetterà di integrare i dati attualmente a disposizione con preziose informazioni sulle popolazioni che rappresentano dei veri e propri tasselli mancanti nel quadro della variabilità genetica europea e approfondire pertanto gli aspetti filogenetici e filogeografici che caratterizzano l ampia biodiversità umana osservabile all interno del continente in questione. Sarà così possibile
confrontare in maniera esaustiva i dati relativi ai marcatori uniparentali con la prospettiva complementare offerta dall analisi dei marcatori autosomici per ricostruire i principali processi demografici e popolazionistici che hanno caratterizzato la storia antica e recente del continente, permettendo un analisi ad ampio spettro della variabilità umana non solo da un punto di vista sincronico, ma anche diacronico grazie al confronto con campioni antichi. Il progetto avrà inoltre l obiettivo metodologico di disegnare e mettere a punto una serie di pannelli di marcatori del cromosoma Y destinati al sequenziamento massivo parallelo mediante tecnologia Ion Torrent (piattaforma Ion S5, Thermo Fisher Scientific) o Illumina (piattaforme MiniSeq o MiSeq) e di perfezionare il protocollo di sequenziamento di genomi mitocondriali completi recentemente sviluppato dal gruppo di ricerca (De Fanti et al. 2016). ARTICOLAZIONE DEL PROGETTO E TEMPI DI REALIZZAZIONE Il progetto è strutturato in tasks volti a raggruppare le attività previste dal piano di ricerca sulla base delle sue fasi consequenziali. Task 1: Selezione delle popolazioni da analizzare, campionamento ed estrazione del DNA (mesi: 1-3) Le popolazioni oggetto di studio saranno scelte al fine di massimizzare le informazioni su quei gruppi europei per i quali non sono disponibili dati di tipo genomico e/o generati ad un elevato livello di risoluzione per quanto riguarda il DNA mitocondriale (es. genoma completo) o il cromosoma Y. Ciò comporterà pertanto un attenta analisi della letteratura e dei database di dati genetici/genomici attualmente disponibili. Una volta selezionate le popolazioni, i campioni di DNA da analizzare saranno scelti sulla base dei criteri più stringenti attualmente in uso in questo tipo di studi (Sarno et al. 2014), in parte tra quelli già presenti all interno della biobanca del Laboratorio di Antropologia Molecolare e in parte mediante campionamenti ex novo. Questi saranno basati su di una preliminare raccolta di dati biodemografici tra gli individui della popolazione in esame al fine di selezionare solo quelli che presentano una ancestralità chiaramente radicata sul territorio da diverse generazioni. Il campionamento di materiale biologico (saliva) da cui estrarre il DNA sarà effettuato utilizzando il kit Oragene@DNA (OG-500, DNAGENOTEK). In seguito alle fasi di estrazione e purificazione il DNA sarà quantificato attraverso l impiego del fluorimetro Qubit 3.0 utilizzando il kit Qubit dsdna BR Assay (Life Technologies) che permette di quantificare in modo preciso il DNA a doppio
filamento al fine di verificare che la quantità e la qualità dello stesso soddisfi i requisiti necessari per la costruzione delle librerie per il sequenziamento NGS del genoma mitocondriale completo e di porzioni target del cromosoma Y. Task 2: Costruzione delle librerie e sequenziamento NGS del DNA mitocondriale (mesi 3-6) Il protocollo messo a punto dal gruppo di ricerca per il sequenziamento dei genomi mitocondriali sarà ulteriormente perfezionato e applicato per la tipizzazione dei campioni selezionati nell ambito delle attività del Task 1. Tale protocollo prevede l amplificazione dell intero genoma mitocondriale mediante la produzione di due ampliconi che vengono poi sottoposti ad una frammentazione fisica tramite sonicazione per mezzo dello strumento Bioruptor (Diagenode). Tale frammentazione permetterà di ottenere librerie di segmenti di mtdna delle dimensioni adatte ad essere sequenziate con tecnologia Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific). Le librerie saranno quindi barcodate utilizzando il kit Ion Xpress Barcode Adapters (Life Technologies) al fine di poter processare più campioni contemporaneamente e saranno quantificate attraverso approcci di qpcr (saggio TaqMan, Ion Library Quantitation Kit, Life Technologies) o grazie all impiego del BioAnalyzer Instrument 2100 (High Sensitivity DNA Analysis Kits, Agilent Technologies) per garantire l accorpamento dei campioni in concentrazione equimolare, al fine di ottenere il minor numero possibile si sfere policlonali durante la reazione di PCR in emulsione. La PCR in emulsione sarà effettuata con l impiego dello strumento One Touch 2 System mediante l utilizzo di un kit recentemente reso disponibile (Ion Hi-Q OT2 Kit, Life Technologies) e sarà seguita dal sequenziamento dei genomi mitocondriali grazie all impiego del kit Ion Hi-Q Sequencing (Life Technologies). Le sequenze ottenute saranno processate avvalendosi sia di tools bioinformatici implementati nella Torrent Suite sviluppata da Life Technologies e collegata alla piattaforma di sequenziamento utilizzata, sia mediante l utilizzo di una pipeline di analisi sviluppata ad hoc. Task 3: Costruzione delle librerie e sequenziamento NGS di STRs e SNPs caratterizzanti aplogruppi del cromosoma Y (mesi 7-10) L analisi dei polimorfismi del cromosoma Y sarà effettuata in collaborazione con il Reparto Investigazioni Scientifiche (RIS) dell Arma dei Carabinieri di Parma e prevede la caratterizzazione di un set di marcatori STRs secondo il pannello di più recente sviluppo al momento dell inizio dei lavori e proposto dalla ditta Thermo Fisher Scientific per la piattaforma di sequenziamento di nuova generazione Ion S5. L applicazione di una piattaforma NGS per l analisi di loci STRs permetterà di aumentare notevolmente il livello di risoluzione dell analisi generando un vero e proprio dato di
sequenza e non limitandosi solamente alla tradizionale determinazione del numero di copie della sequenza ripetuta. Attraverso un accurata inferenza degli aplogruppi mediante l utilizzo di tools bioinformatici quali Haplogrep2.0 e Haplogroup Predictor sarà poi possibile determinare quali marcatori SNPs possano essere più informativi per la conferma e la discriminazione ad alta risoluzione della filogenesi dei cromosomi Y esaminati. La collaborazione con i RIS dell Arma dei Carabinieri di Parma permetterà infine di mettere a punto un pannello di SNPs da caratterizzare mediante piattaforma Ion S5 (Thermo Fisher Scientific) la cui elevata informatività potrà essere sfruttata non solo per studi di tipo popolazionistico ma anche per possibili future applicazioni in ambito forense. Task 4: Analisi filogenetiche e filogeografiche dei dati ottenuti (mesi: 11-12) Per quanto riguarda l analisi delle sequenze di DNA mitocondriale generate, ciascun campione sarà assegnato all aplogruppo di riferimento e alla relativa sottolinea di appartenenza mediante confronto con la più recente filogenesi mitocondriale (PhyloTree) grazie all utilizzo di tools specificatamente sviluppati per l analisi di genomi mitocondriali completi (Haplofind). Per l analisi dei dati ottenuti per il cromosoma Y si seguirà un approccio simile avvalendosi di tool appositamente sviluppati per l inferenza dell aplogruppo di appartenenza a partire dai marcatori STRs analizzati (Haplogrep2.0, Haplogroup Predictor). Le frequenze e la distribuzione geografica delle linee così individuate saranno confrontate con quelle osservate in altre popolazioni Europee e del bacino del Mediterraneo, sfruttando sia dati di letteratura sia dataset messi a disposizione da collaborazioni nazionali e internazionali. Saranno inoltre calcolati indici di diversità nucleotidica e effettuate analisi multivariate mediante l utilizzo di specifici packages implementati in ambiente R. L analisi filogenetica delle sequenze mitocondriali ottenute e di quelle di confronto, nonché la datazione delle singole sottolinee sarà effettuata mediante un approccio Bayesiano che sfrutta algoritmi basati sulle catene di Monte Carlo Markov Chain (MCMC) e implementato nel software BEAST. Le relazioni all interno di specifiche sottolinee saranno infine valutate mediante ricostruzione di network (Network 4.6.11) ed eventuali strutture star-like rappresentative di segnali d espansione saranno ulteriormente datate mediante l estimatore rho utilizzando un mutation-rate specifico per il tipo di marcatore oggetto di indagine.
PROGRAMMA FORMATIVO Il piano di formazione proposto permetterà all assegnista di acquisire competenze nell'ambito dell applicazione delle più innovative tecnologie di sequenziamento massivo parallelo e delle più recenti metodologie di analisi bioinformatiche necessarie per processare tale tipologia di dato. Considerando che l esperienza nell analisi di mitogenomi e marcatori del cromosoma Y maturata dal gruppo di ricerca che propone il progetto è ormai consolidata sia dal punto di vista laboratoristico che di analisi dati, il carattere innovativo del progetto sarà incentrato sull acquisizione di conoscenze e sull ottimizzazione di protocolli per il sequenziamento massivo parallelo mediante la nuova piattaforma di sequenziamento Ion S5 recentemente sviluppata da Thermo Fisher Scientific e sul design e la messa a punto di un pannello di SNPs che possa essere altamente informativo per la discriminazione degli aplogruppi del cromosoma Y di popolazioni di origine europea. Tali competenze, i protocolli sperimentali e le pipeline di analisi sviluppate nell ambito del progetto potranno così essere acquisite e fatte proprie da tutto il personale BiGeA che usufruisce delle strumentazioni e dei servizi del Centro dipartimentale di Biologia Genomica, ponendo le basi per la loro modificazione e ottimizzazione per il sequenziamento di DNA mitocondriale di specie di interesse zoologico o botanico, e di genomi batterici o eucariotici di piccole dimensioni, nonché di porzioni di genomi non mitocondriali (mediante un approccio basato su ampliconi). Dal momento che esperimenti di sequenziamento massivo parallelo prevedono sempre quattro fasi principali nella procedura di preparazione e processamento dei campioni da analizzare (costruzione delle librerie di DNA, preparazione delle sequenze di template, sequenziamento, allineamento delle sequenze ottenute e chiamata delle varianti), il piano formativo proposto sarà strutturato in modo da seguire tali fasi logiche (Task1, Task2, Task3) al fine di favorire l acquisizione di competenze differenti, ma complementari, e indispensabili per l adattamento del workflow sopra descritto al sequenziamento dell intero genoma mitocondriale e del pannello di SNPs disegnato per l analisi della variabilità del cromosoma Y. Un ulteriore fase di formazione prevede sia il processamento dei dati grezzi sia l analisi filogenetica e filogeografica dei dati ottenuti (Task2, Task3, Task4). Durante questa fase del progetto è prevista la collaborazione con gruppi di ricerca nazionali ed esteri specializzati nell analisi bioinformatica di dati NGS e nell analisi della variabilità genetica delle popolazioni umane. Il processamento del dato grezzo sarà infatti effettuato sia avvalendosi dei tools contenuti all interno della Torrent Suite sviluppata da Life Technologies e abbinata alla piattaforma di sequenziamento utilizzata, sia attraverso la messa a punto di pipeline di analisi dedicate.
A tal proposito, l assegnista acquisirà le competenze necessarie per l utilizzo dei tools implementati nella Torrent Suite e di software open source per condurre: allineamento delle sequenze ottenute al genoma di riferimento e controllo di qualità delle stesse (Ion Alignment) analisi della profondità e uniformità del coverage ottenuto (Ion coverageanalysis, GATK) chiamata delle varianti di singola base e di piccole inserzioni/delezioni (Ion variantcaller, Ion variantcallermito, SAMTools, VarScan) annotazione delle varianti individuate (Ion ReporterUploader). Una volta individuate le varianti caratterizzanti le sequenze generate l assegnista effettuerà una serie di analisi volte alla ricostruzione dell evoluzione delle relative linee e sottolinee filogenetiche. A tale scopo, e per confrontare le sequenze ottenute con il maggior numero possibile di sequenze europee e mediterranee, l assegnista collaborerà con lo Human Genome Diversity Lab diretto dal Prof. David Comas del Department of Experimental and Health Sciences dell Università Pompeu Fabra di Barcellona, acquisendo competenze necessarie per: determinazione delle sottolinee degli aplogruppi di appartenenza dei campioni esaminati (Haplofind, Haplogroup Predictor) confronto delle frequenze e delle distribuzioni spaziali delle linee identificate con quelle ottenute da dati di confronto (packages implementati in ambiente R) indagine delle relazioni filogenetiche delle sottolinee osservatee relativa datazione (BEAST, Network). Infine, in parallelo con la fase dedicata all analisi dei dati generati dagli esperimenti di sequenziamento, l assegnista avrà la possibilità di maturare ulteriormente la propria capacità di divulgare i risultati ottenuti attraverso la presentazione degli stessi a congressi nazionali ed internazionali e la stesura di articoli destinati alla pubblicazione su riviste scientifiche internazionali.