Attivitá e cinetica enzimatica PAS : Classe di insegnamento A60 Biologia e scienze A.A. 2013/2014 09/05/2014
Cinetica Enzimatica La cinetica enzimatica è misurata come velocità di conversione del substrato nel prodotto finale, ossia quantità di prodotto generato per unità di tempo
Cinetica Enzimatica La cinetica enzimatica è influenzata da vari fattori: - Concentrazione del enzima - PH nel mezzo di reazione (ogni enzima possiede un PH ottimale, generalmete intorno a valori medi) - Concentrazione del substrato - Presenza di eventuali inibitori e della loro concentrazioni (gli inibitori allosterici sono generalmente più potenti degli inibitori competitivi)
(Abs/time) Substrato enzimatico Quando la concentrazione enzimatica è mantenuta constante, un incremento della concentrazione del substrato porta ad un aumento della velocità di reazione fino al raggiungimento della velocità massima (Vmax) La concentrazione di substrato cui la velocità di reazione è ½ Vmax è definita come constante di Michaelis, Km La saturazione dei siti attivi si ha con il raggiungimento di Vmax (mm)
Inibitori enzimatici Gli inibitori enzimatici agiscono riducendo la velocità di reazione enzimatica - Inibitori competitivi: legame al sito attivo (linibizione competitiva può essere superata aumentando le concentrazioni del substrato) - Inibitori allosterici: legano l enzima al di fuori del sito attivo (sito allosterico) inducendone un cambiamento conformazionale - Inibitori non-competitivi: legano l enzima nel sito attivo ed anche il complesso enzima-substrato NB: la cellula preferisce limitare l attività di un enzima attraverso la modulazione delle concentrazioni di substrato oppure mediante l azione di enzimi con attività opposta, piuttosto che mediante l impiego di inibitori (gli inibitori delle ribonucleasi ne sono un raro esempio)
Fosfatasi alcalina La fosfatasi alcalina è un enzima che si trova prevalentemente nel sangue, nell intestino, nel fegato e nel tessuto osseo. Alterati livelli di questa proteina nel sangue possono essere indicativi di diversi fenomeni patologici. La fosfatasi alcalina catalizza l idrolisi di fosfati monoestere per generare gruppi fosfato inorganici
Saggio della fosfatasi alcalina La fosfatasi alcalina ha un attività maggiore a PH alcalini (PH 8.0). Il saggio più comune per la rilevazione dell attività della fosfatasi alcalina prevede l impiego di p-nitrofenil fosfato (o 4-nitrofenil fosfato), un substrato cromogenico. La quantità di prodotto enzimatico formato (p-nitrofenolato) può essere misurata mediante uno spettrofotometro NB: nei saggi di rilevazione dei livelli di fosfatasi alcalina la quantità di substrato prodotto è impiegata come misurazione indiretta della quantità di enzima
Spettrofotometro Lo spettrofotometro misura in maniera quantitativa la frazione di luce che attraversa una determinata soluzione campione. L assorbanza (o densità ottica OD) è la grandezza (priva di unità di misura) utilizzata in spettrofotometria per misurare la quantità di luce assorbita da una soluzione. L assorbanza è determinata dalla formula: A = ε x l x C ε: coefficiente di assorbimento molare La differenza tra la luce incidente e la luce trasmessa determina l assorbanza del campione l: cammino ottico della cuvetta C: concentrazione di soluto (mol/l)
Molarità La molarità (M) è un'unità di misura della concentrazione di una specie chimica in una soluzione, è definita come le moli di soluto presenti in un litro di soluzione (mol/l). La mole di una sostanza contiene tante entità elementari quanti sono gli atomi contenuti in 12 grammi dell'isotopo 12 del carbonio: tale numero è noto come numero di Avogadro, pari a 6,022 10 23. Nel caso di un composto chimico, si può definire la mole come la quantità di sostanza avente massa, espressa in grammi, numericamente uguale alla massa molecolare della singola molecola (peso molecolare). NB: nelle reazioni in vitro, si impiegano concentrazioni di reagenti nell ordine del milli molare (mm) ma nei sistemi cellulari le sonstanze (inclusi i substrati enzimatici) hanno concentrazioni nel nano o micro molare (nm, um)
Utilizzo delle pipette Gilson p10 p20 p200 p1000
Utilizzo di Excel
Utilizzo di Excel Equazione di regressione logaritmica Y Y = a x ln(x) + b a: pendenza B: intercetta X
Utilizzo di Excel Y Approssimazione di Vmax Vmax Vmax si ottiene al raggiungimento del plateau di reazione La pendenza della curva (a) rappresenta l incremento di velocità di reazione (reaction rate) X: tempo Y: Abs X
PEROSSISOMA: organello cellulare presente in tutte le cellule eucariotiche, separato dal citoplasma mediante membrana, al cui interno si svolgono diverse reazioni metaboliche tutte caratterizzate dalla formazione di H 2 O 2.
FUNZIONE DEI PEROSSISOMI Reazioni di ossidazione che utilizzano O2 per rimuovere H2 da un substrato organico (R) come ad esempio l ossidazione degli acidi grassi o dell etanolo RH2 + O2 R + H2O2 Il perossido di idrogeno é altamente tossico per le cellule (interferenze con ioni metallici delle proteine e mutazione del DNA) e i perossisomi lo eliminano grazie alla catalasi Catalasi 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2
REAZIONI NEI PEROSSISOMI Degradazione degli acidi grassi a catena molto lunga Da: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk21624/figure/a 4363/?report=objectonly
CATALASI Enzima localizzato nei perossisomi indispensabile per l eliminazione del perossido di idrogeno all interno della cellula L eliminazione del perossido di idrogeno deve essere immediata: ogni secondo una molecola di catalasi puó degradare milioni di molecole di H 2 O 2. La velocitá della reazione é garantita da un gruppo eme, uno per ogni subunitá della proteina. La concentrazione dell enzima varia a seconda dell organismo e del tessuto (molto alta in fegato) ph ottimale ca. 7 (variabile a seconda della specie)
ESPERIENZA DI LABORATORIO Obiettivo: Riconoscere l attività enzimatica della catalasi e valutare in quali circostanze viene alterata. In particolare vedremo: - Attivitá della catalasi in prodotti di origine animale e vegetale - Effetto del calore e del ph sull attivitá enzimatica
Prodotti utilizzati e frasi di rischio H 2 O 2 H302 Nocivo se ingerito. H318 Provoca gravi lesioni oculari. HCl H290 Può essere corrosivo per i metalli. H314 Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. H335 Può irritare le vie respiratorie NH 3 H221 Gas infiammabile. H280 Contiene gas sotto pressione; può esplodere se riscaldato. H314 Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. H331 Tossico se inalato. H400 Molto tossico per gli organismi acquatici.