UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia AA 2011-2012.

UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia AA 2011-2012 Mycobacterium spp

Nel 1993 l OMS dichiarò la tubercolosi Emergenza Mondiale a seguito della ripresa della diffusione dell epidemia; i fattori che hanno favorito e favoriscono tuttora l espansione della malattia sono principalmente quattro: 1. La concomitante diffusione dell HIV con il suo effetto devastante: infatti l una favorisce il propagarsi dell altra; un individuo HIV positivo presenta un rischio 100 volte superiore di ammalarsi di TBC, in quanto il deficit immunitario determinato dalla malattia, permette che altre infezioni possano essere acquisite; 2. L aumento soprattutto negli ultimi decenni di spostamenti per viaggi, attività lavorative tra paesi anche molto distanti tra loro; 3. La scarsa opera di prevenzione e cura in particolar modo a livello delle fasce sociali a maggior rischio di infezione; 4. L uso improprio dei farmaci che di fatto ha indotto la comparsa di ceppi batterici multi resistenti (MDR- TB) [5].

La risposta a questa situazione, individuata dall OMS nel 1995, si chiamò DOTS (Directly Observed Treatment Short-course), una terapia di breve durata, somministrata sotto il controllo medico, che risulta efficace nel 95% delle situazioni. Obiettivo dell Organizzazione è proprio quello di garantire la possibilità di accedere al trattamento DOTS, il cui costo è basso (10-15 dollari per ogni individuo), nei territori di maggiore diffusione e in quelli dove i casi sono limitati. La necessità di diffondere il trattamento è quella di prevenire il contagio: ogni persona affetta da tubercolosi polmonare attiva, se non curata, infetta dalle 10 alle 15 persone l anno. Ma ciò non fu più sufficiente e nel 2001 l OMS mette in campo una nuova strategia Stop TB strategy ; In pratica si tratta di un programma volto a potenziare quello del DOTS appunto andando a porre maggior attenzione ai casi di confezione HIV- TBC e di multi- resistenza ai farmaci.

Mycobacterium spp Ordine Actinomycetales Famiglia Mycobacteriaceae Genere Mycobacterium 100 specie

Micobatteri: carateri generali bacilli immobili non sporigeni aerobi obbligati 0.2-0.6 x 1-10 µm contenenti molecole a 60-90 atomi di C (ac. micolici) elevato contenuto Guanina Citosina (60-70%)

diversi dagli altri batteri per: struttura della parete (lipidi) patogenesi infezione diagnosi suscettibili a chemioterapici specifici

FATTORI DI VIRULENZA M. tuberculosisis : non produce esotossine, solo alcune emolisine e lipasi non e provvisto di endotossina non sintetizza la capsula I fattori di virulenza sono i componenti cellulari (lipidi, fattore cordale, cere) dotati di azione tossica nei confronti dei macrofagi, inibendo il killing macrofagico attraverso la mancata fusione del fagosoma-lisosoma e la mancata acidificazione del fagolisosoma

Regione RD1

Regione RD1 La regione RD1 è un frammento del genoma di 10.7 kb che codifica per molti geni, tra cui ESAT-6 e CFP-10. L ESAT-6 è in grado di indurre al formazione di pori nelle membrane dei vacuoli dei macrofagi il cui micobatterio si moltiplica e consentire la fuoruscita del micobatterio nel citoplasma. Tale regione comprende anche altre proteine che costituiscono l apparato secretorio e che la regione genomica codificante prende anche il nome di ESX. Nel genoma del M.tuberculosis sono presenti 5 cassette ESX che presentano un elevato grado di omologia.

Parete cellulare: ricca di lipidi resistenza a fattori ambientali (essiccamento) alcool-acido resistenza tempo di replicazione (12-24 ore) caratteristiche di crescita in vitro (colonie visibili dopo 40 gg) antigenicità (componente proteica)

Glicolipidi di superficie Acidi micolici Lipo-arabino-mannano Proteine Arabinogalactano P P Peptidoglicano

Cell wall La parete è molto complessa e ricca di lipidi La struttura della parete è alla base di: - alcool-acido-resistenza - lenta crescita - resistenza a molti detergenti e antibiotici - proprietà antigeniche (PPDs) - tendenza alla aggregazione (dimicolyltrealosio)

Lipidi : 60% del peso secco della parete cellulare 30% del peso secco del corpo batterico. Fattore cordale (dimycolyltrealosio) Cere (A, B, C, D) Proteine: 15% della parete cellulare (attività antigenica, attivazione della CMI) PPD: derivato proteico purificato

glico-lipidi di Mycobacterium = micosidi Acidi micolici: lipidi a 60-90 atomi di C + carboidrati (legame covalente) Fattore cordale (dimycolyl-trealosio): responsabile della crescita in forma di catene paralelle tossico se inoculato nel topo implicato nella virulenza dei micobatteri Cera D: responsabile della reazione di ipersensibilità di IV tipo

Classificazione (I) Mycobacterium tuberculosis complex M. tuberculosis M. bovis M. bovis BCG M. africanum M. microti Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) Mycobacterium leprae

Classificazione (II) Gruppo non-runyon Gruppi Runyon GRUPPO I crescita lenta, fotocromogeni GRUPPO II crescita lenta, scotocromogeni GRUPPO III crescita lenta, non cromogeni GRUPPO IV crescita rapida M. tuberculosis M. bovis M. bovis BCG M. africanum M. leprae M. kansasii M. marinum M. simiae M. scrofulaceum M. paratuberculosis M. szulgai M. xenopi M. avium M. intracellulare M. genavense M. haemophilum M. malmoense M. ulcerans M. fortuitum M. chelonae M. abscessus

Nonostante si conoscano circa 100 specie di micobatteri, più del 95% di tutte le infezioni nell uomo sono causate soltanto da 7 specie: M. tuberculosis M. leprae M. avium complex (M. avium, M. intracellulare) M. kansasii M. fortuitum M. chelonae M. abscessus

Genoma Nel 1998 è stato completamente sequenziato il genoma del ceppo H37Rv di M. tuberculosis, e ciò ha permesso di ricavare ulteriori informazioni riguardo gli aspetti distintivi del microorganismo. Il genoma circolare comprende 4.411.529 paia di basi che costituiscono circa 4000 geni; una caratteristica distintiva del genoma è rappresentata dall alto contenuto (circa 65.6% del totale) di guanine e citosine.

Circular map of the chromosome of M. tuberculosis H37Rv Positions of stable RNA genes (trnas are blue, others are pink) and the direct repeat region (pink cube); PPE family members (green); Scale in Mb, with 0 representing the origin of replication. coding sequence by strand (clockwise, dark green; anti-clockwise, light green); PE family members (purple, excluding PGRS); PGRS sequences (dark red) G + C content, with <65% G + C in yellow, and >65% G + C in red. repetitive DNA (insertion sequences, orange; 13E12 REP family, dark pink; prophage, blue);

CARATTERISTICHE DEL GENOMA DI M. TUBERCULOSIS H37Rv 4.411.532 bp G+C 65.6% 4.000 geni codificanti proteine 50 geni codificanti RNA stabile 52% funzione definita 48% funzione ipotetica o sconosciuta Oltre il 51% dei geni è derivato dalla duplicazione genica Il 3.4% del genoma è composto da sequenze di inserzione e profagi

CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DEI GENI DI M. TUBERCULOSIS H37Rv CLASSE FUNZIONE NUMERO DI GENI 0 Virulence, detoxification, adaptation 99 1 Lipid metabolism 233 2 Information pathways 229 3 Cell wall and cell processes 708 4 Stable RNAs 50 5 Insertion sequences and phages 149 6 PE and PPE proteins 170 7 Intermediary metabolism and respiration 894 8 Proteins of unknown function 272 9 Regulatory proteins 189 10 Conserved hypothetical proteins 1051

Mycobacterium tuberculosis Bacillo di Koch Premio Nobel, 1905

Patogenesi

Infezione da M. tuberculosis Malattia tubercolare se il sistema immunitario non riesce a controllare l infezione Infezione latente (assenza di malattia) se l infezione rimane sotto il controllo del sistema immunitario

M. tuberculosis, infezione Esposizione al M. tuberculosis Assenza di infezione (5%) Infezione (95%) TBC attiva (5%) (entro 2 anni) TBC latente (95%) Riattivazione (5%) nessuna riattivazione (90%)

Trasmissione dell infezione tubercolare

Le particelle infettanti Goccioline di Pflügge Sospensione nell aria Evaporazione e riduzione a dimensioni di 1-51 µm m con bacilli vivi e vitali Possibilità di inalazione fino al distretto livello alveolare

È pericoloso il contagio? Ogni paziente contagioso infetta il 40-50 % dei contatti stretti Nei contagiati il 5-105 % si ammala di TB 3-55 % malati nei primi 2 anni 2-55 % cumulativo per il resto della vita Nei malati: Probabilità di guarigione = 80 % Probabilità di morte = 1 %

Fattori di rischio per il contagio Carica batterica Contagiosità del paziente: Positività dell esame esame diretto dell espettorato espettorato Presenza di caverne Frequenza/durata di esposizione Luogo del contatto: Spazi piccoli e mal ventilati Condizioni di recettività (suscettibilità ospite) Ritardo di diagnosi e di inizio della terapia

Patogenesi della TB Infezione latente vs. malattia attiva Infezione tubercolare latente Infezione subclinica con bacilli tubercolari senza segni clinici, batteriologici o radiologici di malattia manifesta. Tipicamente si tratta di individui con intradermoreazione tubercolinica positiva ed un Rx torace normale, che possono essere contatti di un precedente caso di tubercolosi. Tubercolosi Stato di malattia manifesta dal punto di vista clinico, batteriologico e/o radiologico. Polmonare Malattia primaria Malattia postprimaria Extrapolmonare

TB Patogenesi La prima infezione L infezione tubercolare è il risultato dell inalazione di MTB se la carica batterica è elevata o le difese immunitarie sono inadeguate Ingresso di MTB negli alveoli Fagocitosi macrofagica Moltiplicazione di MTB nei macrofagi Diffusione per via linfatica (ed eventualm. ematica) Risposta linfocitaria (IFN-γ e altre CK) Infezione di altri macrofagi Risposta attivante i mφ Risposta danneggiante i tessuti (ipersensibilità ritardata)

Il ruolo dei linfociti T Patogenesi Essendo un microrganismo intracellulare, la risposta a MTB è basata sull immunità cellulo-mediata I linfociti T CD4 + riconoscono gli antigeni presentati e amplificano la risposta immune verso MTB soprattutto attraverso la produzione di IFN-γ reclutando altre cellule flogistiche Diversi fattori possono ridurre l efficienza dei linfociti T CD4 + : coinfezione di HIV età farmaci ad azione immunosoppressiva Rook G.A.W. et al. Eur Respir J 2001

Patogenesi della TB Dall infezione al granuloma Lo sviluppo dell immunità specifica e l accumulo di mφ attivati porta alla formazione di un granuloma (tubercolo) nel sito della lesione primaria. Si riscontrano quindi linfociti, mφ, cellule epiteloidi e cellule giganti. La necrosi caseosa centrale impedisce la moltiplicazione di MTB, che vi rimane confinato Il soggetto che supera la prima infezione ha: il vantaggio di possedere immunità acquisita nei confronti di MTB lo svantaggio di conservare nell organismo MTB dormienti Anche a guarigione avvenuta, per anni o per tutta la vita MTB può restare quiescente all interno dei macrofagi o del materiale necrotico

Infezione Inalazione bacilli tubercolari lesioni primarie: lobo medio dx; lobo sup sn (sede inf.); lobo inf. sn (sede sup) tubercolosi primaria asintomatica sintomatica evoluzione Guarigione Cronicizzazione tubercolosi secondaria (endogena/esogena) polmonare (apici) pleurica continuità tracheo-bronchiale digestiva ingestione miliare via ematica isolata d organo (SNC, rene, app. genitale, ossa)

Tubercolosi: lesione istopatologica specifica Inalazione bacilli Infiammazione aspecifica Sensibilizzazione (risposta immune specifica) Richiamo macrofagi alveolari Attivazione risposta T helper GRANULOMA TUBERCOLO FOCOLAIO DI GHON COMPLESSO DI GHON Cellule coinvolte MACROFAGI (ISTIOCITI, CELLULE EPITELIOIDI, CELLULE GIGANTI DI LANGHANS) LIFOCITI T CD4+, CD8+ FIBROBLASTI (tessuto cicatriziale, calcificazioni)

Risposta immune specifica Inalazione aerosols infetti fagocitosi da parte dei macrofagi alveolari blocco fusione lisosoma-fagosoma (fattore cordale, blocco della molecola ponte specifica EEA1) = patogeni intracellulari attivazione risposta immune cellulo-mediata = produzione di IL-12, IL-18, TNF-α (infiammazione, T CD4+ e CD8+, NK) Attivazione T CD4+ produzione di anticorpi (non proteggenti a causa della localizzazione intracellulare di BK) Produzione di IFN-γ e IL-2 attivazione dei macrofagi macrofagi attivati possono fagocitare e uccidere i micobatteri. Attivazione T CD8+ Lisi di cellule fagocitiche contenenti micobatteri in replicazione

GRANULOMA: al centro = istiociti-cellule epitelioidi + bacilli tubercolari In periferia = linfociti, fibroblasti TUBERCOLO: Granuloma + necrosi caseosa centrale TUBERCOLO zona centrale con materiale necrotico caseoso (materiale eosinofilico amorfo), circondata da cellule epitelioidi (istiociti) e linfociti tipica cellula di Langhans (nucleo a ferro di cavallo)

FOCOLAIO DI GHON Focolaio primario di infezione parenchimale (subpleurica) = lesione grigio-biancastra di 1-1.5 cm a livello sub-pleurico (espressione macroscopica del granuloma o tubercolo) COMPLESSO DI GHON (= complesso primario o di Ranke) Evoluzione possibile del focolatio di Ghon, con interessamento dei linfonodi peribronchiali o tracheobronchiali attraverso una stria linfangitica. Focolaio di Ghon + stria linfangitica + linfonodi regionali. Visibile all esame radiografico (da Anton Ghon (1866-1936), a Czech pathologist)

Tubercolosi: evoluzione delle lesioni Guarigione: fibrosi cicatrizazione calcificazione ossificazione con/senza bacilli vivi all interno Lesioni evolutive: necrosi tissutale (caseificazione) caverne tubercolari superinfezione delle caverne (Aspergillus sp) lesioni per diffusione per contiguità lesioni per diffusione ematogena

Evoluzione: calcificazione Sub-pleural fibro-calcific nodule (Healed Ghon focus)

Evoluzione: NECROSI CASEOSA Necrosi caseosa Lesione cavitaria Necrosi o caverne

Infezione Inalazione bacilli tubercolari lesioni primarie: lobo medio dx; lobo sup sn (sede inf.); lobo inf. sn (sede sup) tubercolosi primaria asintomatica Tubercolo, focolaio di Ghon, complesso di Ghon sintomatica evoluzione Guarigione Cronicizzazione Necrosi caseosa, caverne tubercolosi secondaria (endogena/esogena) polmonare (apici) pleurica continuità tracheo-bronchiale digestiva ingestione miliare via ematica isolata d organo (SNC, rene, app. genitale, ossa)

Epidemiologia

Epidemiologia Si stima che la TBC uccida ogni giorno 5000 persone OMS: 1,5-2 milioni il n di morti all anno 8-10 milioni il n di nuovi casi 30 milioni di pazienti con TB attiva Il 95% dei casi in paesi in via di sviluppo Problema sanitario, sociale, economico Le nuove migrazioni, l AIDS, la comparsa di nuove povertà hanno determinato un riemergere dell infezione anche nei paesi sviluppati. In Italia la situazione è sotto controllo, l incidenza è di 5-10/100.000 abitanti e si stima che circa la metà dei pazienti con TB sia rappresentata da emigrati da regioni al alta endemia di TB.

1.7 million people died from TB (including 380 000 women) in 2009, including 380 000 people with HIV, equal to 4700 deaths a day L Italia deve essere considerata Paese a bassa incidenza

Epidemiologia Una malattia persistente

Serbatoio: uomo con TBC aperta Trasmissione: inalazione di aerosol Soggetti a rischio: contatti di pz, tossicodipendenti, senzatetto, alcolizzati, carcerati, pz AIDS

La TBC primaria può evolvere in: A) Guarigione, spesso con calcificazione, senza distribuzione. Lo sviluppo della CMI è mostrata con il test di Mantoux positivo. PPD> a 10mm. B) TBC primaria progressiva: Si può sviluppare da una distribuzione locale attraverso il polmone e diffondersi fino alle pleure. C) TBC miliare: distribuzione: linfa--> sangue --> reni, cervello, o può rimanere senza sintomi, passare al successivo stadio latente.

Clinica

Fasi della infezione e della malattia tubercolare (American Thoracic Society, 1993) PPD Rx Sintomi Batteriologia - - - - Contatto senza infezione + - - - Infezione + + + + TB attiva + + +/- - TB inattiva (stabile)

Manifestazioni cliniche Tubercolosi polmonare Malattia primaria - risultato dell iniziale infezione di MTB - si osserva spesso nei bambini -prevalentemente nei campi medi ed inferiori, accompagnata da linfoadenopatia ilare -nella maggioranza dei casi guarisce spontaneamente -negli immunocompromessi si può sviluppare una miliare

Manifestazioni cliniche Tubercolosi polmonare Malattia postprimaria deriva dalla riattivazione endogena di un infezione latente prevalentemente ai segmenti apicali e posteriori dei lobi superiori l estensione è variabile (da piccoli infiltrati ad estese malattie cavitarie) con la formazione di caverne, il contenuto necrotico viene eliminato nelle vie aeree e dà luogo a lesioni satelliti l interessamento massivo di segmenti o di lobi polmonari produce la polmonite tubercolare Frieden T.R. et al. Lancet 2003

Manifestazioni cliniche Tubercolosi polmonare Fasi precoci febbre (spesso di basso grado e intermittente) sudorazione notturna perdita di peso e anoressia malessere generale e astenia Fasi successive

Sintomatologia tosse (inizialmente non Tosse produttiva, poi con essudato purulento emottisi dolore toracico (se ci sono lesioni subpleuriche) dispnea (in caso di malattia estesa) Esame obiettivo di limitata utilità (spesso negativo, a volte rantoli o ronchi) Esami di laboratorio lieve anemia e leucocitosi a volte iponatriemia (per siadh)

Manifestazioni cliniche Tubercolosi extrapolmonare Sedi interessate linfonodi pleura tratto genitourinario ossa articolazioni meningi peritoneo Oggi la TB extrapolmonare è di più frequente riscontro, a causa della disseminazione ematogena nei soggetti infettati da HIV Yang Z. et al. Clin Infect Dis 2004

TBC primaria in immunocompetente : per di più asintomatica o paucisintomatica (febbre e malessere) TBC primaria in persone a rischio: TBC polmonare primaria progressiva (febbre, tosse, espettorazione, emottisi, dispnea) TBC secondaria (= post primaria): tosse cronica, espettorazione, emottisi, febbre, dispnea, dolore toracico, anoressia, dimagrimento, consunzione TBC extrapolmonare: può colpire vari organi e apparati: linfonodi 25%, pleura 20%, tratto genito-urinario 15%, ossa 10%, meningi 5%. TBC miliare: piccole lesioni a forma di seme di miglio, che si diffondono rapidamente dai polmoni ai visceri

Micobatteriosi non tubercolari Malattia polmonare: M. avium. kansasii, abscessus, xenopi, malmoense Linfadeniti: M. avium, scrofulacem, malmoense Malattie cutanee: M. marinum, fortuitum, chelonae, abscessus, ulcerans Malattia disseminata: M. avium, kansasii, chelonae, haemophylum

Diagnosi Esame microscopico Esame colturale Test molecolari Immunodiagnosi

I campioni biologici Espettorato Lavaggio broncolveolare Broncospirato Fluido pleurico Urina Aspirato bronchiale Liquor Midollo osseo Essudati Feci Materiale bioptico

Il Mycobacterium tuberculosis non si colora con la colorazione digram e non cresce nei normali terreni di coltura quindi...occorre richiedere specificamente la ricerca di BK!

Esame microscopico: tutte le colorazioni sfruttano la ALCOOL ACIDO RESISTENZA evidenziazione BAAR (bacilli alcool acido resistenti = AFB) colorazioni utilizzate: Ziehl-Neelsen (carbolfucsina a caldo) Kinyoun (carbolfucsina a freddo) Auramina (impiego dei flurocromi) Fluorescenza

Ziehl Neelsen micobatteri = batteri rossi in campo blu BAAR: bacilli alcool acido resistenti

Ziehl Neelsen Kinyoun Auramina O FITC

Valutazione Ziehl-Neelsen (Kent and Kubuka, 1985, CDC) BAAR/campi 0 / 300 1-2 / 300 1-9 / 100 1-9 / 10 1-9 / 1 > 9 / 1 Referto Negativo per BAAR Dubbio: ripetizione Positivo per BAAR + - - - Positivo per BAAR + + - - Positivo per BAAR + + + - Positivo per BAAR + + + + si leggono 300 campi a 1000 ingrandimenti

Ziehl-Neelsen Sensibilità 10.000 100.000 BAAR/ml campione Falsi negativi dipendono da: carica campione biologico errori tecnici operatore Specificità Falsi positivi: Nocardia spp, Rhodococcus, Legionella micdadei, cisti di Cryptosporidium spp. e Cyclospora spp.

inoltre L esame microscopico non fornisce alcuna informazione riguardo alla vitalità dei micobatteri osservati: in pazienti in terapia è possibile il reperto di esame microscopico positivo ed esame colturale negativo I micobatteri atipici possono variare nella capacità di colorarsi (trattenere la carbolfucsina dopo decolorazione)

Esame colturale è il gold standard Sensibilità: 10 100 BAAR/ml campione biologico Processazione del campione: Decontaminazione Fluidificazione Semina in terreni solidi Semina in terreni liquidi

Esame colturale Decontaminazione: NaOH al 10% Fluidificazione: N-acetilcisteina

Terreni solidi A base di uovo: Lowenstein-Jensen Petragnani Sintetici (agarizzati): Middlebrook 7H10-7H11 altre componenti: asparagina, verde malachite, glicerolo

Terreni solidi crescita lenta e/o difficile rilevazione manuale rilevazione colture miste analisi morfologia colonie determinazione carica

Quantificazione della crescita su terreni solidi ATS. Diagnosic Standars and Classification of Tuberculosis in Adults and Children Am J Respir Crit Care Med 161:1376-1395, 2000 N. COLONIE VISTE 0 < 50 50-100 100-200 200 500 > 500 (patina) REFERTO negativo N. colonie positivo 1 + positivo 2 + positivo 3 + positivo 4 +

TERRENI LIQUIDI sistema di rilevamento radiometrico sistema MGIT (Becton Dickinson) crescita più rapida rilevazione automatizzata necessità di sub-colture su solidi impossibilità di quantificare carica

Sistema MGIT (Becton Dickinson) Coltura in terreno liquido Middlebrook 7H9 Sul fondo della provetta è presente silicone contenente un composto fluorescente (complesso metallico di Rutenio), sensibile alla riduzione della tensione di ossigeno, che funge da sistema rivelatore Il consumo di O 2 ad opera del metabolismo dei micobatteri comporta l aumento dell emissione di fluorescenza + O 2 - O 2

Sistema BACTEC (Becton Dickinson) All interno di un flacone sigillato è presente un terreno di coltura liquido contenente acido palmitico marcato con 14 C. L utilizzo di tale sostanza da parte di micobatteri comporta la produzione di 14 CO 2 che si accumula all interno del flacone stesso. Il gas presente nel flacone sigillato viene analizzato automaticamente dallo strumento e la quantità di 14 CO 2 viene rilevata da un betacounter, quantificata ed espressa come indice di crescita. n.b.: non più in uso (meglio non usare isotopi..)

METODI GENOTIPICI Rilevazione diretta di acidi nucleici di Mycobacterium tuberculosis complex nei campioni biologici Probetec SDA (Strand Displacement Amplification), PCR amplificazione e determinazione del DNA target (IS 61 10) Test di amplificazione MTD MTD: Mycobacterium tuberculosis direct Rileva rrna 16S e 23S di Mycobacterium tuberculosis complex

IDENTIFICAZIONE TRADIZIONALE MOLECOLARE Morfologia delle colonie Prove biochimiche uso di sonde oligonucleotidiche: breve sequenze di nucleotidi complementari alla sequenza target (INNO-LiPA, AccuProbe) Sequenziamento genomico

Identificazione molecolare Si basa su: presenza nel genoma di sequenze nucleotidiche altamente conservate specie-specifiche uso di sonde oligonucleotidiche: breve sequenze di nucleotidi complementari alla sequenza target

AccuProbe bersaglio: 16S rrna INNO-LiPA bersaglio: regione spaziatrice presente tra il gene 16S e 23S rdna (ITS) M. tuberculosis complex M. kansasii M. gordonae M. avium M. intracellulare M. avium complex

Immunodiagnosi Mantoux: test alla tubercolina QuantiFERON : ELISA / ELISPOT per IFN-γ

La Mantoux Introdotta nel 1890, è il più vecchio test diagnostico di infezione tubercolare latente Si basa sull inoculo intradermico del PPD, (miscela di antigeni del M. tuberculosis, alcuni dei quali sono presenti anche nel BCG e nei micobatteri non tubercolari)

Test alla tubercolina Sistema di screening per valutare : Tubercolosi attiva Positivo Infezione latente Esposizione recente a M. tuberculosis Esposizione a micobatteri ambientali Vaccinazione con BCG

Mantoux Linfocita T Cellula presentante l Ag Rilascio di IFN-γ, TNF e IL8 richiamo e attivazione cellulare indurimento e arrossamento nel punto dell iniezione

Diagnosi di infezione latente Intradermoreazione di Mantoux PPD = derivato proteico purificato; 5 UI in 0.1ml A 48-72 ore. Area di induramento; non di eritema!

Test della tubercolina = intradermoreazione di Mantoux n.b.: PPD, Purified Proteic Derivative PPD 0,1 mg = 5UT per via intradermica valutazione della reazione dopo 48 h misurazione del diametro della lesione (infiltrato = nodulo)

Punti di forza della Mantoux Utile per predire la TBC attiva Il trattamento dei soggetti Mantouxpositivi riduce drasticamente il rischio di passaggio alla tubercolosi attiva Basso costo Non richiede l intervento del laboratorio

Limiti della Mantoux Falsi positivi - 5-60% dei vaccinati Tempo trascorso dalla vaccinazione Numero di vaccinazioni Età al momento della vaccinazione - Esposizione a micobatteri non tubercolari (NTM) - Effetto booster - Anergia (soggetti immunodepressi, malnutriti, con tubercolosi avanzata) Falsi negativi - Errori di inoculo - Errori di lettura (soggettività, inaccuratezza della misurazione) Problemi di ordine pratico - Doppia presentazione del paziente - Mancata lettura nel 30% dei casi

Produzione di interferone-γ (IFN-γ) L infezione tubercolare stimola la risposta della cellule T Le cellule-t attivate secernono citochine IFN-γ TNF IL8 Le cellule-t effettrici producono IFN-γ entro poche ore dalla stimolazione Le cellule-t memoria devono prima proliferare trasformandosi in cellule effettrici, non sono quindi in grado di produrre IFN-γ prima di 24h L IFN-γ non è normalmente presente in circolo, è stabile e misurabile

I test basati sull interferone-γ I linfociti del soggetto in esame vengono posti in contatto con l antigene, con un controllo negativo privo di antigene e con un controllo positivo contiene fitoemoagglutinina Ricerca dell IFN-γ dopo opportuna incubazione assenza di IFN-γ = ASSENZA DI INFEZIONE presenza di IFN-γ = INFEZIONE presenza di IFN-γ nel controllo NEG = TEST NON VALIDO assenza di IFN-γ nel controllo POS = DEFICIT IMMUNITARIO

La scelta degli antigeni I linfociti T dei soggetti con infezione tubercolare producono IFN-γ se vengono in contatto con uno o più antigeni del M. tuberculosis che sono: ESAT-6 (early secretory antigenic target 6) CFP-10 (culture filtrate protein 10) TB 7.7 Tali antigeni sono codificati in una regione genica (RD1) che manca nel BCG e in quasi tutti i micobatteri non-tubercolari

Specificità di ESAT-6 e CFP-10 Antigeni M tuberculosis + + Ceppi BCG gothenburg = tutti negativi - - moreau - - tice - - tokyo - - danish - - glaxo - - montreal - - pasteur - - NTM Antigeni ESAT-6 CFP-10 ESAT-6 CFP-10 M abscessus - - M avium - - M branderi - - M celatum - - M chelonae - - M fortuitum - - M gordonae - - M intracellulare - - M kansasii + + M malmoense - - M marinum + + M genavense - - M scrofulaceum - - M smegmatis - - M szulgai + + M terrae - - M vaccae - - M xenopi - -

TB - Diagnosi di infezione latente Test di laboratorio Test basati su IFN-γ test in vitro che misurano l IFN-γ rilasciato dai linfociti T in risposta ad antigeni tubercolari per la stimolazione vengono utilizzati gli antigeni ESAT-6 6 e CFP-10 10,, specifici per MTB ed assenti nel BCG QuantiFERON-TB Gold : misura la quantità di IFN-γ prodotto, attraverso tecnica Elisa T-SPOT. SPOT.TBTB : misura il numero di linfociti T che producono IFN-γ, attraverso tecnica Elispot Pai M. et al. Lancet Infect Dis 2004

QuantiFERON -TB GOLD Test IFN-γ 3 antigeni: ESAT-6, CFP-10, TB7.7 T T T T T T ELISA Test positivo: sviluppo di colore

Metodo ELISA K - ESAT-6 CFP-10 Mitogeno Sangue eparinato Trasferimento in pozzetti e aggiunta dell antigene Incubazione overnight a 37 o C Se sono presenti cellule-t T effettrici viene secreto IFN-γ COLORE Recupero del plasma e dosaggio dell IFN IFN-γ ( sandwich ELISA, incubazione 120 min) Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura DO 450nm IFN-γ IU/ml Misura della DO e dosaggio dell IFN IFN-γ contro una curva di taratura

Metodo ELISA in-tube Raccolta del sangue in provette eparinate Incubazione per 16-24h a 37 C K neg ESAT6 + CFP10 mitogeno centrifugazione COLORE Recupero del plasma e dosaggio dell IFN IFN-γ ( sandwich ELISA, incubazione 120 min) Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura DO 450nm IFN-γ IU/ml Misura della DO e dosaggio dell IFN IFN-γ contro una curva di taratura

Metodo ELISpot K - ESAT-6 CFP-10 Mitogeno Sangue eparinato Separazione e conteggio dei leucociti mononucleati Trasferimento dei linfociti (250.000 cell.) in pozzetti coated con Ab anti-ifn IFN-γ e aggiunta dell antigene COLORE Incubazione overnight a 37 o C Lavaggio e dosaggio dell IFN IFN-γ ( sandwich ELISA, incubazione 120 min) Conteggio degli spot, al microscopio o con lettore automatico

Test Quantiferon con metodo ELISpot Enzyme linked Immunospot ELISPOT = come un normale test ELISA, ma le cellule invece che essere in sospensione sono aderenti sul fondo del pozzetto Man mano che una cellula secerne IFN-γ, questo viene legato dagli Ab sottostanti, si forma quindi uno spot che si colora perché l anticorpo secondario modifica enzimaticamente un substrato contando il numero di spots si può valutare quante cellule producono IFN-γ

Metodo ELISpot: lettura Man mano che una cellula secerne IFN-γ questo viene legato dagli Ab sottostanti, si forma quindi uno spot POSITIVO: quando si hanno spot con almeno uno degli antigeni se il K-K ha 0-40 4 spot ed il pozzetto dell Ag ha più di 5 spot se il K-K ha >5 e <10 spot ed il pozzetto con l antigene l ha un numero di spot almeno doppio NON VALIDO se K- K >10 spot e/o K+ <20 spot

Correlazione IFN-γ/Mantoux IFN-γ Sensibilità 89.0% (105/118) Specificità 98.2% (213/217) Mantoux 65.7% (50/76; 5 mm) 35.4% (73/113; 10 mm)

Test IFN-γ vs. Mantoux Sensibilità relativa ai casi di TBC attiva: SOVRAPPONIBILE Sensibilità nei casi di sospetta infezione latente: MAGGIORE per IFN-γ I casi con Mantoux NEG e IFN-γ POS sono generalmente associati con l esposizione I casi con Mantoux POS e IFN-γ NEG non sono generalmente associati con l esposizione

Terapia, profilassi, controllo

Misure per il controllo della TB Tempestività della diagnosi Trattamento farmacologico e gestione dei pazienti con TB Directly-observed therapy (DOT) Identificazione, sorveglianza e trattamento dei gruppi ad alto rischio contatti di casi di TB persone con infezione da HIV altri gruppi a rischio Vaccinazione con BCG Altet G.M.N. et al. Arch. Broncopneumol 2003

Terapia combinata con farmaci attivi sulla parete e sulla sintesi di acidi nucleici Attivi sulla parete cellulare: Isoniazide Etionammide Etambutanolo Cicloserina Attivi sulla sintesi degli acidi nucleici: Rifampicina Chinoloni (levofloxacina)

Isoniazide e etionammide: influenzano la sintesi dell acido micolico Etanbutanolo: interferisce con la sintesi di arabinogalattano Cicloserina: inibisce due enzimi, la D-alanina sintetasi e l alanina racemasi, che catalizzano la sintesi della parete Antibiotici attivi sulla parete dei micobatteri

DOTS Protocollo terapeutico suggerito dall OMS (directly observed treatment short-course) e consiste nell assunzione simultanea di 3 farmaci (isoniazide, pirazinamide, e rifampicina eventualmente etambutolo) per i primi due mesi e da 2 farmaci isoniazide e rifampicina) per i restanti 4 mesi. Il trattamento con più farmaci contemporaneamente si rende necessario per evitare la comparsa di resistenze nel corso della terapia.

Prevenzione, Trattamento e Controllo Mycobacterium tuberculosis - isoniazide - rifampicina - pirazinamide - etambutolo (per 9 mesi, 2 volte a settimana) Chemioprofilassi: isoniazide (per 1 anno). Mycobacterium avium complex claritromicina o azitromicina combinata con etambutolo e rifabutina. Mycobacterium kansasii isoniazide, rifampicina ed etambutolo con o senza streptomicina. Micobatteri a rapida crescita: claritromcina, amikacina, imipenem, cefoxitina, sulfamidici.

Farmaci di II linea per il trattamento della MDR TB Aminoglicosidi Amikacina, Kanamicina Polipeptidi Capreomicina Farmaci di I linea + Fluorchinoloni Tioamidi Ciprofloxacina, Ofloxacin Etionamide, Protionamide Analoghi della serina Cicloserina PAS WHO. Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis. 2006.

Prevenzione, Trattamento e Controllo Problema attuale: ceppi MDRTB (multidrug resistant TB) resistenti a Isoniazide e Rifampicina e soprattutto XDRTB (extensively multidrug resistant TB) resistenti a isoniazide e rifampicina + chinolonici (kanamicina, amikacina)

Terapia antubercolare I principi che guidano la scelta della terapia antitubercolare devono tenere conto di un lungo trattamento, a causa della lenta moltiplicazione dei micobatteri, ma anche dell esistenza di 3 compartimenti di microrganismi: - un compartimento extracellulare metabolicamente attivo, - uno intracellulare relativamente inattivo, - uno localizzato all interno della sostanza caseosa.

La rifampicina ha azione battericida su tutti e 3 i compartimenti. L isoniazide e la streptomicina sono attive sul compartimento extracellulare. L isoniazide e la pirazinamide sono attive nei confronti del micobatterio intracellulare. L etambutolo è solo batteriostatico.

Prima scelta

MDR-TB

XDR-TB

IL vaccino anti-tbc Il bacillo di Calmette-Guerin (BCG) è ancora ad oggi l unico vaccino disponibile contro la TBC. Il BCG è un vaccino vivo ed attenuato ottenuto dopo 230 passaggi nell arco di 13 anni in terreno di patata glicerinata e biliata a partire da un ceppo virulento di M.bovis. Durante il processo di attenuazione il ceppo BCG ha perso numerosi frammenti di genoma, che prendono il nome di Regioni di differenza (RD). La regione importante è l RD1che contiene una regione del genoma che codifica per i geni Esat-6, cfp10, e più in generale per il cluster genico ESX1. L RD1 è essenziale per la virulenza di M.tuberculosis.

Il vaccino BCG La vaccinazione è iniziata nel 1921. Si somministra dopo la nascita per via sc e dopo un mese si verifica, l avvenuta immunizzazione mediante il test della tubercolina.