Molecole Adesione Integrine 1. Introduzione http://www.uphs.upenn.edu/news/news_releases/mar07/integrin highres.jpg Le integrine interrogano costantemente il loro ambiente circostante mediante la loro capacità di interagire con la matrice extracellulare Desgrosellier JS, Cheresh DA. Integrins in cancer: biological implications and therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer. 10:9 22, 2010. Engler AJ, Humbert PO, Wehrle Haller B, Weaver VM. Multiscale modeling of form and function. Science. 2009 Apr 10;324(5924):208 12. Integrin signaling regulates: proliferation differentiation Motility Survival http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/f06pm/lect06.htm 1
Integrine [1] Principali molecole di collegamento delle cellule con la Matrice ExtraCellulare (MEC) e di risposta a segnali provenienti dalla MEC Sono costituite da due subunità glicoproteiche transmembrana (α e β) di dimensioni 120 170 kda e 90 100 kda, rispettivamente, associate in modo non covalente, entrambe delle quali contribuiscono al legame con la MEC o con le altre cellule. Alcune integrine sembrano legarsi soltanto ad un singolo tipo di macromolecola della matrice (ad es. fibronectina o laminina) Altre invece si legano a più di un tipo: ad es. collagene + fibronectina + laminina. Integrine [2] Alcune integrine riconoscono la tripleta di aminoacidi RGD (arginina glicina acido aspartico) Altre riconoscono altre sequenza aminoacidiche o domini proteici La stessa molecola di integrina in tipi cellulari diversi può avere diverse cinetiche di legame con il ligando. Ci sono fattori aggiuntivi, specifici per il tipo cellulare, che interagiscono con le integrine per modulare la loro attività Alberts Alberts Integrine [3] Integrine (4) Il legame Integrina Ligando è Ca 2+ o Mg 2+ dipendente (ci sono da 3 a 4 siti di legame per ione divalente nel dominio extracellulare della catena α). Il tipo di catione influenza l affinità per il ligando e la specificità del legame con il ligando La stessa proteina extracellulare può essere riconosciuta da diverse integrine. Ad es: o Fibronectina: riconosciuta da > 8 integrine o Laminina: > 4 Sono noti attualmente almeno 24 tipi diversi di integrine, dati dalla combinazione di 8 tipi diversi di subunità β 18 tipi diversi di subunità α La diversità delle integrine è aumentata dalla possibilità di diversi tipi di splicing sullo stesso mrna. Alberts Alberts Francavilla C, Maddaluno L, Cavallaro U. The functional role of cell adhesion molecules in tumor angiogenesis. Semin Cancer Biol. 19:98 309, 2009. (1) La combinazione delle subunità α e β determina la specificità di legame e le proprietà di segnalamento delle singole integrine. Alcune integrine (es. α5β1) riconoscono principalmente un singolo ligando. Altre (es. αvβ3) possono legarsi a diversi ligandi. Integrine FUNZIONI 2
Principali funzioni delle integrine FUNZIONI DELLE INTEGRINE NEI LEUCOCITI (1) Collegamento della cellula alla matrice extracellulare (MEC). Trasduzione di segnale tra la MEC e la cellula. Hanno inoltre una gran varietà di attività biologiche, che includono il pattugliamento immunologico, la migrazione cellulare e il legame alle cellule di certi virus, quali l adenovirus, l ecovirus, lo hantavirus e virus che provocano patologie alla bocca e al piede. Una importante funzione delle integrine si vede nella molecola GPIIbIIIa, un integrina presente sulla superficie delle piastrine, responsabile dal collegamento alla fibrina all interno di un coagolo sanguigno in formazione. Questa molecola aumenta in modo dramatico la sua affinità di legame per la fibrina/fibrinogeno mediante associazione delle piastrine con i collageni esposti nel sito della ferita. Dopo associazione delle piastrine con il collagene, la GPIIbIIIa cambia forma, permettendole di legarsi alla fibrina e ad altri componenti del sangue per formare la matrice del coagolo e fermare la perdita di sangue. FUNZIONI DELLE INTEGRINE NEI LEUCOCITI (2) FUNZIONI DELLE INTEGRINE NEI LEUCOCITI (3) Integrine CONCETTI GENERALI http://www.uib.no/rg/matrix/nyheter/2009/05/integrins during evolution Integrine Grande famiglia di molecole di adesione coinvolte nell adesione cellula cellula e nelle interazioni delle cellule con proteine della matrice extracellulare (ECM) (es. laminina, collagene, fibronectina, vitronectina). I domini extracellulari sono di solito collegati alle proteine della ECM; I domini intracellulari sono collegati funzionalmente al citoscheletro. Mediano la comunicazione fra gli ambienti extra e intracellulari: L interazione integrina citoscheletro influenzano l affinità e l avidità delle integrine verso i ligandi nella ECM («inside out signalling») Le interazioni ECM integrine portano ad alterazioni nelle forma e composizione dell archittetura cellulare («outside in signalling»). Tutte le interazioni integrina ligando dipendono alla presenza di cationi divalenti (Ca 2+, Mg 2+ e Mn 2+ ). 3
Struttura: subunità α e β [1] Struttura: subunità α e β [2] Sono glicoproteine transmembrana eterodimeriche, che consistono in due subunità α e β legate in modo noncovalente. Nell Uomo sono state descritte 18 subunità α e 8 subunità β che si assemblano in 24 integrine diverse. Le subunità α e β non condividono alcuna omologia, essendo due polipeptidi distinti con strutture a domini specifiche. I domini extracellulari di entrambe le subunità contribuiscono al sito di legame dell eterodimero con il ligando. Il dominio extracellulare della subunità α contiene sette ripetizioni di circa 60 residui, che si ripiegano formando una struttura ad elica con sette pale con foglietti β disposti attorno ad un asse centrale. Un sotto insieme di catene α delle integrine ha un dominio di inserzione (αa) che contiene un sito di legame per i cationi, localizzato fra le ripetizioni due e tre dell elica. Il C terminale dell elica è un dominio tipo immunoglobulina detto «Thigh» (coscia), seguito da due moduli a «β sandwich», Calf 1 e Calf 2 («calf»: polpastrello) e un piccolo dominio transmembrana. I domini intracellulari delle subunità α mostrano poca omologia, tranne che per un motivo conservato prossimo alla regione transmembrana che si associa con la coda citoplasmatica della subunità β. Integrin structure. (A) Schematic diagram of integrin structure. The overall structure is that of a head region [propeller and thigh domains of the α subunit and the βa (also known as βi), hybrid and PSI domains of the β subunit] supported on two legs that are made up of the calf1 and calf2 domains in the α subunit and the EGF repeats and β tail domain in the β subunit. The binding of ligands takes place at an interface between the propeller domain and βa domain Askari JA, Buckley PA, Mould AP, Humphries MJ. Linking integrin conformation to function. J Cell Sci. 2009 Jan 15;122(Pt 2):165 70. (B) Ribbon diagram of the structure of the ectodomain of integrin αvβ3 in complex with the highaffinity ligand cyclic RGD peptide (Xiong et al., 2002). The α subunit is shown in red, the β subunit in blue; peptide is shown as a ball and stick model with atoms in green. Metal ions (silver spheres) occupy the base of the propeller and the top face of the βa domain. The protein is in a closed form, which is bent at the knees or genu (arrow). Some β subunit domains are not visible in the structure. (C) Ribbon diagram of the structure of the head region of integrin αiibβ3 in complex with the high affinity ligand eptifibatide (Xiao et al., 2004). Colour coding is the same as in B. In this open structure the hybrid domain has swung outwards and the leg regions (not present) would be unbent so that the integrin is in an extended conformation, similar to that depicted in A. Askari JA, Buckley PA, Mould AP, Humphries MJ. Linking integrin conformation to function. J Cell Sci. 2009 Jan 15;122(Pt 2):165 70. Subunità α Struttura: subunità α e β [3] Integrin α subunit domains:top: Linear domain arrangement. Middle: The globular structure formed by protein domains. Bottom: simplified version of the integrin α subunit as represented throughout this manual. The αi domain is present in some subtypes of α subunit. La regione extracellulare delle subunità β delle integrine contengono un dominio ibrido, un dominio «plexin semaphorin integrin» (PSI), quattro ripetizioni tipo «Epidermal Growth Factor» (EGF) e un dominio di coda β. Il dominio ibrido è un dominio Ig like che comprende un motivo tipo αa (dominio βa) inserito fra due β foglietti. Il dominio βa contiene un motivo di legame ai metalli che si lega a cationi divalenti quando la subunità α non contiene il dominio αa. Il dominio PSI forma un β foglietto antiparallelo a due filamenti fiancheggiato da due corte eliche e contribuisce all attivazione delle integrine. Le code citoplasmatiche delle catene β delle integrine sono corte e altamente conservate e contengono due motivi di fosforilazione. Le code reclutano proteine quali la talina, che si lega ai filamenti di actina, con ciò collegando le integrine al citoscheletro di actina. Le interazioni integrine citoscheletro sono essenziali per l attivazione delle integrine. http://www.mechanobio.info/home/glossary of terms/mechano glossary g/integrin family 4
Subunità β Integrin β subunit domains:top: Linear domain arrangement. Middle: The globular structure formed by protein domains. Bottom: simplified version of the integrin β subunit L eterodimero delle integrine La struttura extracellulare degli eterodimeri di ittegrine consiste in una «testa» e in due «gambe». La «testa», che media le interazioni integrina ligando, è il principale punto di contatto tra le subunità α e β. I contatti sono formati da interazioni fra la elica (catena α) con il dominio βα (catena β). Le «gambe» sono formate dai domini Thigh («coscia») e Calf 1 («polpaccio) della subunità α e i domini PSI, EGF, e βtd della subunità β. Le «ginocchia» permettono alle integrine di adottare una conformazione ripiegata o dritta, che è fondamentale per l attivazione delle integrine. Ulteriori contatti fra le subunità α e β hanno luogo fra Calf 1 e EGF3, fra Calf 2 e EGF4, fra Calf2 e βtd e fra le code citoplasmatiche di α e β. Legame integrina ligando (2) Legame integrina ligando (3) Le integrine sono classificate a seconda della presenza o assenza del dominio αa. Quattro catene α contenenti αa (α1, α2, α10 e α11) si combinano con β1 per dare una sottofamiglia distinta di legame con laminina/collagene. Le integrine non contenenti αa (α3β1, α6β1, α7β1 e α6β4) sono recettori selettivi per la laminina e si legano a siti sulla laminina diversi da quelli a cui si legano le integrine contenenti il dominio αa. Le integrine αv e α5β1, α8β1 e αiiiβ3 riconoscono la sequenza RGD (arginina glicina acido aspartico), che è importante per il legame delle integrine alla fibronectina, vitronectina e collagene. Nonostante molte integrine che si legano a RGD interagiscano con gli stessi ligandi, esse si legano con affinità diverse, riflettendo la precisione dell incastro del motivo RGD con le tasche di legame con il ligando, creati dalle diverse combinazioni tra catene α e β. Le integrine α4β1, α4β7, α9β1 e αeβ7 riconoscono un motivo acido LDV (leucina acido aspartico valina) che si trova nella fibronectina e in alcuni membri della IgSF. Le integrine β2 (αdβ2, αlβ2, αmβ2 e αxβ2) si legano ad un motivo LEV simile, in cui l acido aspartico (D) è sostituito dal glutamato (E). Hynes RO. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 2002 Sep 20;110(6):673 87. 5
Definizioni Catene β1 Affinità: forza di legame tra una integrina singola e il suoi ligando. Questa può essere alterata da alterazioni conformazionali nella struttura dell integrina. Avidità: misura della forza complessiva di legame di integrine aggregate. Evans R, Patzak I, Svensson L, De Filippo K, Jones K, McDowall A, Hogg N. Integrins in immunity. J Cell Sci. 2009 Jan 15;122(Pt 2):215 25. Formano dimeri con 9 tipi di catena α (si trovano in quasi tutte le cellule dei vertebrati): α 5 β 1 : recettore per la fibronectina (VLA) α 6 β 1: recettore per la laminina. Il più importante membro della subfamiglia delle integrine β 1 dei leucociti é il Very Late Antigen 4 (VLA 4, CD49d/CD29, α 4 β 1 ). Il VLA 4 si lega al suo ligando VCAM 1, ed é il principale responsabile dell adesione dei linfociti all endotelio vascolare e del reclutamento dei leucociti alle zone infiammate. http://bme.virginia.edu/ley/vla 4.html Catene β2 (a) Le integrine β 2 sono espresse esclusivamente dai leucociti e subiscono un alterazione conformazionale che coinvolge la fosforilazione della subunità β nel processo di attivazione. Tuttavia, questa fosforilazione non é nè necessaria nè sufficiente per l attivazione conformazionale. Lo stato di attivazione é controllato dal sito GFFKR (Gly Phe Phe Lys Arg) immediatamente adiacente al dominio transmembrana della catena α. 6
Catene β2 (b) Le integrine β 2 includono 4 diversi eterodimeri CD11a/CD18 [Lymphocyte Function Associated Antigen 1] (LFA 1) l integrina β2 predominante. CD11b/CD18 (Mac 1), esclusiva dei granulociti e monociti CD11c/CD18 (p150,95) CD11d/CD18. Una mutazione nel gene che codifica per la molecola β2 (CD18) provoca una malattia genetica, la LAD, Leukocyte Adhesion Deficiency. I pazienti con LAD hanno infezioni batteriche ricorrenti dovuto all incapacità di reclutare attivamente i granulociti in risposta alle infezioni. http://bme.virginia.edu/ley/images/integrins.gif http://bme.virginia.edu/ley/lfa 1.html http://bme.virginia.edu/ley/mac 1.html 7
Catene β 3 Sono espresse da diversi tipi cellulari (es. piastrine) Si legano a diverse proteine della matrice extracellulare, incluso fibrinogeno nel processo di coagulazione del sangue Malattia di Glanzmann: deficienza di catene β 3, eccessivo sanguinamento. 8
Integrine LEGAME CON IL CITOSCHELETRO 9
Legame con il citoscheletro (1) Le integrine fungono da collegamenti (o integratori ) transmembrana, mediando le interazioni fra il citoscheletro e la matrice extracellulare richiesti per permettere alle cellule di aggrapparsi alla matrice. La maggior parte delle integrine è collegata ai filamenti di actina. L integrina α 6 β 4, che si trova negli emidesmosomi, è un eccezione, dato che è collegata funzionalmente ai filamenti intermedi. Dopo il legame di una integrina al suo ligando nella matrice, la coda citoplasmatica della subunità β si collega a diverse proteine intracellulari di ancoraggio, che includono la talina, la α actinina e la filamina. A loro volta, queste proteine di ancoraggio si possono legare strettamente all actina o ad altre proteine di ancoraggio come la vinculina, perciò collegando funzionalmente l integrina ai filamenti di actina della corteccia cellulare. Legame con il citoscheletro (2) Nelle condizioni giuste, questo collegamento porta all aggregazione delle integrine e alla formazione di adesioni focali tra la cellula e la matrice extracellulare. Se il dominio citoplasmatico della subunità β viene deleto con tecniche di DNA ricombinante, le integrina più corte si legano ancora ai loro ligandi, ma non mediano più un adesione forte, e non sono più in grado di aggregarsi nelle adesioni focali. Sembrerebbe che le integrine debbano collegarsi al citoscheletro per collegare fortemente le cellule alla matrice, così come le caderine debbono interagire con il citoscheletro per collegare le cellule in modo efficace. Il collegamento al citoscheletro potrebbe aiutare le integrine ad aggregarsi, producendo un legame di aggregazione più forte; inoltre blocca l integrina in una conformazione che le permette di collegarsi al suo ligando specifico in modo più stretto. Legame con il citoscheletro (3) Così come le caderine promuovono l adesione cellula cellula senza formare giunzioni aderenti mature, le integrine possono mediare l adesione cellula matrice senza formare adesioni focali mature. In entrambi i casi, tuttavia, le molecole di adesione transmembrana possono ancora legarsi al citoscheletro. Per quanto riguarda le integrine, questo tipo di adesione ha luogo quando le cellule si espandono o migrano e dà origine alla formazione dei complessi focali. Perchè i complessi focali maturino in adesioni focali è necessaria l attivazione della piccola GTPasi Rho. L attivazione di Rho porta al reclutamento di ulteriori filamenti di actina ed di integrine verso il sito di contatto. Collegamento con il citoscheletro ASSE INTEGRINE FILAMENTI INTERMEDI http://www.biology online.org/js/tiny_mce/plugins/imagemanager/files/boa002/an nothingf01.jpg; Emidesmosomi. (A) Gli emidesmosomi graffettano le cellule epiteliali alla lamina basale, collegando la laminina fuori dalla cellula ai filamenti di cheratina all interno della cellula. (B) Componenti molecolari di un emidesmosoma. Un integrina specializzata (integrina α 6 β 4 ) attraversa la mmbrana, collegando i filamenti di cheratinaintracellularmentemedianteproteinediancoraggiochiamateplectinae distonina, con la la laminina extracellularmente. Il complesso adesivo contiene inoltre, in parallelo all integrina, un membro insolito della famiglia dei collageni, il collagene di tipo XVII; questo ha un dominio di attraversamento della membrana collegato alla sua pozione di tipo collagene extracellulare. Difetti in qualsiasi di questi componenti possono dare origine a patologie vescicolose della pelle. 10
Asse Integrine Filamenti intermedi (1) Le membrane basali («Basement Membranes», BMs) sono strati densi di matrice extracellulare che fungono da barriere strutturali che separano le cellule epiteliali, cellule endoteliali, assoni dei nervi periferici, cellule adipose e cellule muscolari dal sottostante stroma. Le BMs fornisce sostegno strutturale, separano i tessuti in compartimenti e regolano il comportamento cellulare. Tutti i tipi cellulari producono componenti della BM: collagene di tipo IV, laminina, fibronectina, proteoglicani ad eparan solfato e nidogeno/entattina oltre a componenti minori. La composizione molecolare della BM varia nei differenti tessuti conferendo ad essi una specificità di segnalamento importante per definire le funzioni specializzate delle cellule epiteliali ed endoteliali nei diversi organi. Tutte le BM contengono laminine, una famiglia di 16 glicoproteine eteropolimeriche generate dalla combinazione di catene 5α, 4β e 3γ. Wickstrom et al. In: Extracellula matrix Biology, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2012 Asse Integrine Filamenti intermedi (2) Quando presenti in concentrazione sufficiente, le laminine possono autoassemblarsi in polimeri che interagiscono con altre componenti della ECM, nonchè con recettori sulla superficie cellulare quali le integrine e il distroglicano. Le isoforme di laminina presenti nei tessuti sono regolate in modo tessuto specifico e regolato nel tempo durante lo sviluppo embrionale. La laminina 332 (che contiene catene α3, β3 e γ2; preferenzialmente nota come laminina 5) è un componente delle BM epiteliali, e quindi è presente nella pelle, mucosa squamosa stratificata, amnio, e cornea. La sua principale funzione è quella di mantenere l integrità epiteliale e la coesione epitelio mesenchima in tessuti esposti a forze meccaniche elevate. Questa funzione è facilitata dalla capacità unica della laminina 332 di interagire con integrine distinte. La sua interazione conl integrina α3β1 porta all assemblaggio dei canonici punti di adesione focale (FA), mentre l interazione con le integrine α6β4 porta alla formazione di emidesmosomi. Wickstrom et al. In: Extracellula matrix Biology, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2012 Asse Integrine Filamenti intermedi (3) Emidesmosomi: struttura e assemblaggio (1) Gli emidesmosomi sono complessi multiproteici presenti negli epiteli semplici e stratificati. Ci sono due tipi che si distinguono in base alla composizione molecolare. Tipo I (emidesmosomi classici): si trovano negli epiteli stratificati (es. pelle) e contengono tre proteine transmembrana: Integrina α6β4, tetraspanina CD151, e collagene di tipo XVII («antigene 180 bullous pemphogoid, [PD]). Tipo II: si trovano negli epiteli semplici (es. Intestino) e contengono solo l integrina α6β4. Wickstrom et al. In: Extracellula matrix Biology, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2012 Wickstrom et al. In: Extracellula matrix Biology, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2012 Asse Integrine Filamenti intermedi (3) Emidesmosomi: struttura e assemblaggio (2) L aspetto unico degli emidesmosomi è che essi collegano la ECM alla rete dei filamenti intermedi (FI). Ques interazione è stabilita da due proteine della famiglia delle placchine: plectina e BP230 (anche nota come BPAG1), di cui sono la plectina è presente sia negli emidesmosomi di tipo I che di tipo II. Le plectine sono grandi proteine citoplasmatiche, che nel loro C terminale contengono sei ripetizione di tipo placchina. Una sequenza di residui basici che collega la 4 a e la 5 a ripetizione placchina media le interazioni della plectina con i FI. Il N terminale contiene due domini «calponin homology» (CH) che costituiscono un dominio di legame con l actina. Mediante il dominio di legame con l actina le plectine si possono associare sia con il dominio citoplasmatico dell integrina α6β4 oppure con i filamenti di actina in modo mutuamente esclusivo, che spiega l assenza di actina negli emidesmosomi. Wickstrom et al. In: Extracellula matrix Biology, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2012 Herrmann H, Aebi U. Intermediate filaments and their associates: multi talented structural elements specifying cytoarchitecture and cytodynamics. Curr Opin Cell Biol. 2000 Feb;12(1):79 90. 11
Integrina α6β4 Plectina http://xtal.cicancer.org/research.html http://xtal.cicancer.org/graphics/hemidesmosome_scheme01.jpg Collagene di tipo XVII (noto anche come BP180) (1) Asse Integrine Filamenti intermedi (3) Emidesmosomi: struttura e assemblaggio (3) Proteina transmembrana che gioca un ruolo critico nel mantenimento del collegamento tra gli elementi strutturali intracellulari e extracellulari coinvolti nell adesione dell epidermide. E un eterotrimero con tre catene α1 (XVII). Proteina transmembrana di tipo II. Ogni catena di 180 kda contiene un dominio intracellulare globulare di circa 70 kda che interagisce con la subunità β4 delle integrine, con la plectina e con la BP230 ed è necessaria per il collegamento stabile degli emidesmosomi ai filamenti intermedi di cheratina. L interazione della plectina on la coda citoplasmatica dell integrina α6β4 è considerato il passo iniziale per la formazione degli emidesmosomi. La coda dell integrine α6β4 è insolitamente lunga e non condivide alcuna omologia con le altre subunità β delle integrine. La sua interazione con la plectina induce un alterazione conformazionale nella coda dell integerina. Poichè il reclutamento del collagene di tipo XVII e della placchina BP230 ai desmosomi richiede una previa interazione della plectina con la β4, questo cambiamento conformazionale potrebbe facilitare le interazioni di entrambe le proteine con l integrina. http://en.wikipedia.org/wiki/collagen,_type_xvii,_alpha_1 http://en.wikipedia.org/wiki/collagen,_type_xvii,_alpha_1 Collagene di tipo XVII (noto anche come BP180) (2) Il grande ectodominio C terminale di circa 120 kda consiste in 15 subdomini collagenosi, caratterizzati dalle tipiche sequenze ripetute G X Y dei collageni. La struttura globale dell ectodominio è quella di una triplice elica flessibile con una significativa stabilità termica. La parte prossimale alla membrana dell ectodominio, all interno degli aminoacidi 506 519, è responsabile del legame con la subunità α6 dell integrina aspetto apparentemente importante per l integrazione del collagene di tipo XVII nell emidesmosoma. Il maggiore dominio colalgenoso, Col15, che contiene 232 aminoacidi (aa 567 808) contribuisce significativamente a stabilizzare l omotrimero del collagene XVII. Il C terminale del collagene XVII si lega alla laminina 5 e la corretta integrazione della laminina 5 nella ECM richiede il collagene XVII. http://1.bp.blogspot.com/ _bygtpoeoto/ulzfa957 3I/AAAAAAAAAMw/hamuKgX6KQw/s640/hemidesmosome_scheme01.jpg http://en.wikipedia.org/wiki/collagen,_type_xvii,_alpha_1 http://www.oulu.fi/iho/kuvat/projekti2/1.jpg 12
Collegamento con il citoscheletro ASSE INTEGRINE FILAMENTI DI ACTINA Wickstrom et al. In: Extracellula matrix Biology, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2012 http://jcs.biologists.org/content/122/2/199/f1.large.jpg L asse integrine actina (1) Al contrario di quanto avviene con α6β4, la maggior parte delle integrine sono collagate funzionalmente con il citoscheletro di actina in seguito a legame con il ligando. Un ligando fondamentale delle integrine associate all actina è la fibronectina (FN) che nell Uomo e nei topi è riconosciuta da 11 eterodimeri di integrine. La fibronectina è una grande glicoproteina che esiste in due forme: Fibronectina cellulare: presente nei tessuti dove si assembla in una matrice fibrillare. Fibronectina plasmatica: prodotta dagli epatociti e secreta nel sangue dove rimane in forma solubile non fibrillare, oppure, quando penetra nei tessuti rimane incorporata nella ECM La fibronectina si trova solo nei Vertebrati ed è fondamentale per lo sviluppo della vascolarizzazione dove si trova fra l endotelio e le cellule perivascolari. Wickstrom et al. In: Extracellula matrix Biology, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2012 Wickstrom et al. In: Extracellula matrix Biology, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2012 L asse integrine actina (2) La fibronectina (FN) è un dimero legato da ponti disolfuro e la sua deposizione in una matrice fibrillare è un processo cellulare che dipende in modo critico dalle integrine. Le integrine α5β1, αvβ3, α4β1 e αiibβ3 inducono la fibrillogenesi in vitro. Queste integrine si legano alla FN, che è secreta come struttura compatta globulare in cui i siti di legame per altre molecole di FN sono sepolti all interno della proteina. Il legame è seguito dall attivazione del segnalamento mediato da integrine, portando al reclutamento di proteine citoplasmatiche per formare complessi di adesione focale (FCs). Diversi componenti delle adesioni focali sono proteine che legano e modulano l actina permettendo il reclutamento e la riorganizzazione del citoscheletro di actina verso questi siti e la loro maturazione in FAs. L asse integrine actina (3) La principale integrina formante fibrille di FN, α5β1, lascia le FA e si muove lungo la F actina per formare adesioni fibrillari e facilitare la generazione di tensione meccanica tramite il citoscheletro di actina, portando allo stiramento della molecola di FN legata che provoca l emersione dei siti di auto assemblamento criptici e, infine, al legame di altre molecole di FN, con la risultante produzione di fibrille di FN. Wickstrom et al. In: Extracellula matrix Biology, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2012 Wickstrom et al. In: Extracellula matrix Biology, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2012 http://www.ks.uiuc.edu/research/fibronectin/images/fn int.jpg 13
Interazioni tramite il motivo RGD L adesione cellulare dipende in modo critico dal motivo arginina glicina acido aspartico (Arg Gly Asp; RGD) che è riconosciuto dalle integrine α5β1, dalla famiglia αv, da α8β1, α9β1 e dalla proteine specifiche delle piastrine αiibβ3. Streching a fibronectin type III module FN-III1. Click here for a movie (MPEG, 1.7M) showing the unfolding of the module. http://www.ks.uiuc.edu/research/fibronectin/ Attivazione delle integrine (1) Integrine ATTIVAZIONE Le integrine manifestano tre stati di attivazione principali:: inattivo (bassa affinità), attivo (alta affinità)) e occupato dal ligando. Nel modello detto «switchblade» (cambia lame) un integrina inattiva è ripiegata su se stessa, facendo che la tasca di legame con il ligando sia sotterrata. Le integrine sono attive quando dritte, posizione in cui espongono interamente la tasca di legame con il ligando. Kinbara K, Goldfinger LE, Hansen M, Chou FL, Ginsberg MH. Ras GTPases: integrins' friends or foes? Nat Rev Mol Cell Biol. 2003 Oct;4(10):767 76. Conformazioni inattiva e attiva (a) Evans, 2009: http://jcs.biologists.org/content/122/2/215/f1.large.jpg Campbell ID, Humphries MJ. Integrin structure, activation, and interactions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Mar 1;3(3). 14
Cambiamento di conformazione di una molecola di integrina quando essa si lega ad un ligando. Strutture attiva (stesa) ed inattiva (piegata) di un integrina basate su dati di cristallografia a raggi X. La struttura delle subunità di una integrina attiva, che collega la matrice extracellulare al citoscheletro di actina. La testa della molecola di integrina si collega direttamente ad una proteina extracellulare tipo fibronectna; la coda intracellulare dell integrina si collega alla talina, che a sua volta si collega all actina filamentosa. Un insieme di altreproteineintracellularidi ancoraggio, che includono la α actinina, la filamina e la vinculina, aiutano a rafforzare il legame. Pinze per ceppi. Quando si prendono le maniglie le pinze afferrano il ceppo; se si chiudono le pinze sul ceppo, le maniglie si avviccinano. Inoltre, quanto maggiore é la tensione sulle lingue laterali, tanto più forte è la presa ad entrambe le estremità. In una molecola di integrina, i dettagli del legame sono differenti, ma i principi meccanici sono simili: i cambiamenti conformazionali nelle estremità opposte della molecola sono accoppiati, e avvicinando le maniglie si ha una presa più forte. LE INTEGRINE POSSONO CAMBIARE DA UNA CONFORMAZIONE ATTIVA AD UNA INATTIVA (1) LE INTEGRINE POSSONO CAMBIARE DA UNA CONFORMAZIONE ATTIVA AD UNA INATTIVA (2) Una cellula che striscia in un tessuto ad es. un fibroblasto o un macrofago o una cellula epiteliale che migra lungo la lamina basale deve essere in grado sia di stabilire che di rompere i collegamenti con la matrice, e di farlo rapidamente in modo da viaggiare rapidamente. Allo stesso modo, un leucocita circolante deve essere in grado di attivare che di disattivare la sua capacità di legarsi alle cellule endoteliali in modo da strisciare fuori da un vaso sanguigno in un sito di infiammazione, nelle circostanze appropriate. Inoltre, se si deve applicare delle forze laddove esse sono richieste, il fare e disfare dei collegamenti extracellulari in tutti questi casi devono essere accoppiati all assemblaggio e disassemblaggio rapido dei collegamenti al citoscheletro all interno della cellula. Le molecole di integrine che attraversano la membrana e mediano i collegamenti non possono essere oggetti semplicemente passivi ed inerti con porzioni appiccicose ad entrambe le estremità. Esse debbono essere in grado di alternare fra un stato attivo in cui rapidamente formano collegamenti e uno stato inattivo in cu non lo fanno; inoltre, il collegamento con i loro ligandi da un lato della membrana deve alterare la propensione a legare un diverso insieme di ligandi dall altro lato. 15
LE INTEGRINE POSSONO CAMBIARE DA UNA CONFORMAZIONE ATTIVA AD UNA INATTIVA (3) La base di questi fenomeni dinamici é la regolazione allosterica; quando un integrina si lega o si distacca dai suoi ligandi, essa subisce dei cambiamenti conformazionali che influenzano sia le estremità intracellulari che extracellulari della molecola. Le alterazioni strutturali da una parte sono accoppiate ad alterazioni strutturali dall altra, cosicchè le influenze possono essere trasmesse in qualsiasi direzione attraverso la membrana cellulare. Le pinze per il legname che i boscaioli usano per afferrare i ceppi possono essere prese per analogia LE INTEGRINE POSSONO CAMBIARE DA UNA CONFORMAZIONE ATTIVA AD UNA INATTIVA (4) Le alterazioni strutturali delle integrine possono essere dimostrate prendendo una preparazione purificata di molecole di integrine esaminandole ad alta risoluzione con microscopia elettronica. Se le integrine sono mantenute in un medium ricco di Calcio simile al liquido extracellulare normale, ma senza un ligando extracellulare, e in seguito rapidamente preparate per la microscopia elettronica, esse si presentano come oggetti a forma di V strettament ripiegati. Ma se si aggiunge al mezzo un piccolo peptide sintetico contenente la sequenza che imita il dominio di legame con l integrina di una proteina della matrice extracellulare naturale, le integrine si legano a questa molecola e si estendono adottando una forma diversa in cui le due gambe non sono più piegate strettamente, ma invece si distendono e si separano una dall altra, reggendo una regione di testa ben sopra di esse. LE INTEGRINE POSSONO CAMBIARE DA UNA CONFORMAZIONE ATTIVA AD UNA INATTIVA (5) Queste coppie di strutture possono essere paragonate con dati pù dettagliati di cristallografia di raggi X che rivelano che le due gambe corriondono alle catene α e β delle integrine. La rgione della testa, dove esse si incontrano, contiene il sito di legame per il ligando extracellulare. Il legame con il suo ligando distorce questa regione in modo da favorire la scelta di una conformazione attiva, distesa; vice versa, la scelta di della conformazione distesa crea un sito di legame più favorevole, con maggiore affinità per il ligando. Come é che questi cambiamenti nella regione extracellulare dell integrina si collegano agli eventi che occorrono all estremità intracellulare della molecola di integrina? Nella loro conformazione ripiegata, inattiva, le porzioni intracellulari delle catene α e β rimangono molto vicine e aderiscono una all altra. Quando il dominio extracellulare si allarga, questo contatto si rompeeleporzioniintracellulari(etransmembrana)diqueste catene si separano. Come risultato, il sito di legame per la talina sulla coda della catena β viene esposto. Il legame con la talina porta a sua volta all assemblamento di filamenti di actina ancorati all estremità intracellulare dell integrina. In questo modo, quando una integrina si aggrappa al suo ligando fuori dalla cellula, la cellula reagisce collegando il suo citoscheletro alla molecola di integrina, in modo tale da potere applicare delle forze a questo punto di attacco. Ciò viene noto come attivazione outside in. La catena di causa ed effetto può anche funzionare in senso opposto, dall interno verso l esterno invece che dall esterno verso l interno (segnalamento «inside out»). La talina compete con la catena α per il suo sito di legame sulla coda della catena β. Perciò, quando la talina si lega alla catena β, essa disfa il legame α β, permettendo alle due gambe della molecola di integrina di scattare e di separarsi. Ciò guida la porzione extracellulare dell integrina verso la sua conformazione estesa, attiva. Questa attivazione inside out viene scatenata da molecole regolatorie intracellulari. Queste includono il fosfoinositide PIP 2, che si ritiene sia in grado di attivare la talina in modo tale che essa si lega in modo forte alla catena β dell integrina. In questo modo, un segnale generato all interno della cellula scatena un processo tramite il quale le molecole di integrina afferrano e tengono saldamente i loro ligandi extracellulari. Le molecole intracellulari come il PIP 2 sono esse stesse prodotte in risposta a segnali ricevuti dall esterno della cellula mediante altri tipi di recettori di superfcie, quali i recettori accoppiati a proteine G e i recettori ad attività tirosina chinasica, che possono quindi controllare l attivazione delle integrine. Viceversa, l attivazione delle integrine mediante legame alla matrice può influenzare il ricevimento dei segnali mediati da altre vie di signalling. L interazione di tutte queste vie di comunicazione, trasmettendo i segnali in entrambe le direzioni attraverso la membrana cellulare, permette che abbiano luogo interazioni complesse fra le cellula e il ambiente fisico chimico. 16
Figure 19-48b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 19-49 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Conformazioni inattiva e attiva (b) Model of αiibβ3/skelemin tertiary complex. Skelemin interaction with integrin cytoplasmic complex might initiate and/or stabilize receptor activation in two possible ways. I, skelemin may disrupt the αiibβ3 cytoplasmic complex but keep αiib and β3 CTs in close proximity by sitting in between and binding to both subunits. II, skelemin may bind to the individual αiib and β3 CTs from two different heterodimers, thus separating αβ intraclasp while connecting two adjacent receptors. Tendency of SkIgC5 domain to oligomerize further stimulates and stabilizes integrins cluster formation by promoting both homo and hetero oligomerization. Deshmukh L, Tyukhtenko S, Liu J, Fox JE, Qin J, Vinogradova O. Structural insight into the interaction between platelet integrin alphaiibbeta3 and cytoskeletal protein skelemin. J Biol Chem. 2007 Nov 2;282(44):32349 56. http://www.jbc.org/content/282/44/32349/f5.expansion Attivazione delle integrine (2) Quando sono inattive, le integrine si legano ai ligandi con bassa affinità. Questa interazione a bassa affinità stimola segnali intracellulari che attivano la proteina del citoscheletro talina, che si lega alla coda citoplasmatica della subbunità β. Questo legame rompe l associazione inibitoria fra le catene α e β, permettendo che le regioni citoplasmatiche e transmembrana delle due catene si separino e porta alla condizione in cui il dominio extracellulare cambi da una conformazione ripiegata ad una forma distesa che permette un legame con il ligando ad alta affinità. Nonostante le integrine si leghino ai loro ligandi con alta affinità in seguito all attivazione «inside out», il legame stabile richiede che i loro domini citoplasmatici siano ancorati al citoscheletro. Il legame integrina ligando scatena l aggregazione delle integrine sulla superficie cellulare e porta al reclutamento di enzimi e di molecole adattatatrici che formano complessi di adesione che legano le integrine al citoscheletro. Legame integrina ligando (1) Le integrine possono legarsi a cationi divalenti mediante due domini diversi: αa e βa. Il dominio αa si trova nelle catene α (α1, α2, α11, αm, αx e αd) e quando presente media il legame con i cationi. Se il dominio αa è assente, il legame con il catione ha luogo mediante il dominio βa che si trova in tutte le catene β. La tasca di legame con il ligando si forma all interfaccia fra le lame 2 e 3 del dominio a elica della subunità α e il dominio βa della catena β. Il suo orientamento si altera leggermente a seconda che la subunità α abbia o meno il dominio αa. 17
Hynes RO, Naba A. Overview of the matrisome an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2012 Jan 1;4(1):a004903. http://www.stonybrook.edu/biochem/biochem/facultypages/holdener/figures/mesd/fig9talin.gif Talina (1) Fornisce un collegamento tra i microfilamenti di actina. E una proteina di dimensioni abbastanza grandi (MW 270 kda; 235 kda nei gel, donde il meme orignario di p235). Nuclea l assemblaggio di actina e si lega alla vinculina oltre che a un gran numero di proteine leganti l actina e altre proteine sopratuttto nelle adesioni focali. Oltre che legarsi alla vinculina, che di per se si associa ai lipidi, è stato riportato che la talina è in grado di legarsi direttamente ai lipidi. Talina (2) E una proteina dimerica testa coda che adotta una forma a manubrio. E facilmente digerita (trombina, calpaina II) in due domini si 47 kda e di 200 kda. Il frammento di 47 kda è il N terminale e si lega a lipidi anionici La coda C terminale di maggiori dimensioni forma un gran numero di ripetizioni. Si ritiene che contienga tre siti diversi di legame con l actina. Il rapporto della talina con l actina è complesso: Da una parte riduce la lunghezza dei filamenti di actina e la viscosità delle soluzioni di actina. Dall altro è in grado di nucleare l assemblaggio dell actina. L interazione actina talina è molto sensibile al ph. http://www.bms.ed.ac.uk/research/others/smaciver/encyclop/abp t/talin.htm 18