LA LETTURA DEL LIBRO DELLA VITA: DA MENDEL AL PROGETTO GENOMA UMANO (E OLTRE) Fabio Marroni Dipartimento di Scienze Agrarie e Ambientali, Università di Udine fabio.marroni@uniud.it
Prima della genomica: la genetica Secondo James Watson, fu il biologo britannico William Bateson a coniare il termine genetica per la disciplina dell'ereditarietà. Tuttavia gli agricoltori hanno utilizzato la genetica per secoli, usando il principio empirico che da piante o animali che producono molto si ottengono piante o animali che producono molto.
Johann Gergor Mendel (1822-1884) Mendel nacque in Moravia, in quella che oggi è la Repubblica Ceca. Oltre agli studi seminariali (Mendel infatti era prete), proprio grazie all'appoggio dei suoi superiori, Mendel poté condurre numerosi studi nel campo delle Scienze Naturali. Il suo interesse maggiore era però la botanica, e in particolare egli era interessato alla trasmissione dei caratteri fenotipici dai genitori ai figli. Condusse in merito numerosi esperimenti utilizzando quale organismo modello la pianta di pisello (Pisum sativum). Il suo paper più famoso, che contiene praticamente tutte le leggi di Mendel, fu pubblicato nel 1866 e praticamente ignorato per 30 anni. Se il genoma è il libro della vita, Mendel effettuò i suoi esperimenti senza nemmeno sapere dove fosse il libro della vita!
Un po' di terminologia Gene: nell'ambito della genetica classica, un gene è un fattore ereditato che determina una qualità particolare. Oggi sappiamo che i geni sono l'unità molecolare dell'ereditarietà e si trovano sui cromosomi. Allele: ogni diversa forma in cui un gene può presentarsi. Locus: posizione del cromosoma in cui si trovano uno o più geni. Genotipo: la serie di alleli posseduti da un singolo individuo. Omozigote: un individuo si dice omozigote per un determinato gene quando presenta due alleli identici del gene. Se invece presenta due alleli diversi si dice eterozigote. Fenotipo: manifestazione del genotipo.
Un po' di terminologia Gene: Unità molecolare dell'ereditarietà e si trovano sui cromosomi (R o V) Allele: ogni diversa forma in cui un gene può presentarsi (R1 o R2) Locus: posizione del cromosoma in cui si trovano uno o più geni (L o M) Genotipo: la serie di alleli posseduti da un singolo individuo (R1/R2). Omozigote: (V1/V1) Eterozigote: (R1/R2) Fenotipo: manifestazione del genotipo. Gene R Gene V R1 V1 R2 V1 Locus L Locus M
La prima legge di Mendel La prima legge di Mendel, detta anche principio della segregazione, afferma che i due alleli di un individuo diploide si separano (segregano) quando si formano i gameti, e ciascun gamete contiene un solo allele. Inoltre gli alleli si suddividono nei gameti con frequenze equivalenti.
La prima legge di Mendel P=0.5
La seconda legge di Mendel Detta anche principio dell'assortimento indipendente. Tale legge afferma che gli alleli in loci indipendenti segregano in modo indipendente uno dall'altro.
La seconda legge di Mendel Il principio dell'assortimento indipendente ci dice che gli alleli del locus R e quelli del locus Y si distribuiscono nei gameti in modo indipendente. Questo, unito al già noto principio della segregazione, ci consente di prevedere l'esito dell'incrocio a lato.
Esercizio pratico Immaginiamo di aver incrociato due piante omozigoti di piselli, una liscia e una rugosa, e di aver osservato nella progenie 45 piante a semi lisci e 10 a semi rugosi. Come facciamo a sapere se l'incrocio avviene rispettando la prima legge di Mendel? Il rapporto fenotipico dovrebbe essere 1/3 qui è 1/4.5. Ci vuole un test statistico. Noi useremo il test del chi-quadro che misura lo scostamento dei valori osservati da quelli attesi in base a certe ipotesi (in questo caso in base all'ipotesi nulla). Il chi quadro si calcola così Expected Observed 2 = Expected 2
Il test del chi-quadro Expected Observed 2 = Expected 2 Il valore del chi-quadro, a seconda dei gradi di libertà (numero di classi 1, in genere) ha una probabilità associata. Più piccola è la probabilità, minore è la probabilità che tale differenza tra osservati e attesi sia dovuta a oscillazioni casuali. Se il p-value è < 0.05 possiamo/dobbiam rifutare l'ipotesi nulla e dire che i dati non seguono la legge di Mendel. Se il p-value è >0.05 non possiamo/dobbiamo rifiutare l'ipotesi nulla e cioè non possiamo confutare il fatto che i dati seguano la legge di Mendel (ok, in pratica possiamo dire che i dati seguono la legge di Mendel).
Esercizio in aula Facciamo qualche esercizio relativo alla prima legge di Mendel e al chi-quadro. Per casa invece vi lascerò da fare alcuni esercizi relativi alla seconda legge di Mendel.
La teoria cromosomica dell'ereditarietà Mendel enunciò le sue leggi sulla base delle sue osservazioni, dal momento che all'epoca non erano disponibili grandi conoscenze di genetica. Oggi, grazie alle conoscenze in nostro possesso, possiamo dare una realtà fisica a questi fenomeni. Basti pensare che i geni sono sui cromosomi (questa ipotesi è alla base della teoria cromosomica dell'ereditarietà e fu sviluppata indipendentemente da Walter Sutton e Theodor Boveri). Ogni coppia omologa di cromosomi è costituita da un cromosoma di origine paterna e uno di origine materna. Durante la meiosi, le due copie di cromosomi di ciascun cromosoma segregano, e solo uno andrà nel gamete. Poi, il gamete maschile e quello femminile si fonderanno a dare lo zigote. Quindi, ritornando all'analogia con il libro della vita, grazie al lavoro di Sutton e Boveri abbiamo almeno scoperto dove si trova il libro della vita: nei cromosomi.
Thomas Hunt Morgan Non era del tutto convinto della teoria cromosomica dell'ereditarietà. In particolare, la sua obiezione era che se i geni si trovano sui pochi cromosomi che abbiamo allora molti caratteri dovrebbero viaggiare insieme. Da buon scienziato, si mise subito al lavoro per falsificare questa ipotesi con tutte le sue forze... e finì invece col verificarla e diventare una delle figure più importanti della genetica!
Crossing-over (o ricombinazione) In particolare, Morgan, studiando la Drosophila, scoprì il fenomeno del crossing-over. Questo fenomeno è importantissimo per la variazione genetica, ma è anche stato importantissimo per creare mappe genetiche e localizzare geni implicati in malattie o particolari caratteristiche.
DNA vs Proteine Per molto tempo si è discusso se la molecola responsabile dell'eredità fosse il DNA o le proteine. All'epoca si sapeva che i cromosomi contenevano tale molecola, ma dal punto di vista biochimico i cromosomi contengono sia DNA che proteine. Inoltre, secondo molti, il DNA, con sole 4 basi, non conteneva abbastanza informazioni per dare orgine a segnali complessi come quelli necessari per la trasmissione ereditaria dei caratteri. La vittoria del DNA fu decretata da una serie di esperimenti ad opera di Avery, McLeod e McCarthy, pubblicati nel 1944.
La doppia elica del DNA Scoperta da Watson e Crick (con contributi di Wilkins e Franklin). Ritornando alla nostra analogia, grazie al lavoro di Watson e Crick abbiamo imparato quali sono i simboli alfabetici che compongono tutte le parole del libro della vita. Ma dovevamo ancora imparare a leggere!
Il sequenziamento A partire dagli anni 60, in seguito alle scoperte relative alla struttura e funzione del DNA nacque una nuova scienza, anch'essa strettamente connessa alla genomica: la Biologia Molecolare. Un passo molto importante fu l'invenzione delle tecniche che consentono di sequenziare il DNA, cioè sapere da quali basi è composto. Un metodo di sequenziamento molto diffuso fu inventato da Fred Sanger. Grazie a questo metodo, possiamo leggere il libro della vita. Fred Sanger ha vinto il Nobel per la messa a punto della tecnica di sequenziamento che porta il suo nome. In precedenza aveva messo a punto una tecnica per sequenziare le proteine. Anche quella scoperta gli fruttò un Nobel.
La PCR Fu inventata nel 1983 dalla Cetus Corporation, ad opera di un tipo decisamente originale, Kary Mullis. La PCR consente di ottenere DNA in abbondanza in modo relativamente rapido. Per la sua invenzione, Mullis ha ricevuto il nobel per la chimica nel 1993. Quando lo ha ricevuto aveva 49 anni.
Il dogma Proposto da Francis Crick DNA -> RNA -> proteine
Il dogma Proposto da Francis Crick DNA -> RNA -> proteine srna rrna DNA mrna trna lncrna Proteine
Introni ed esoni Procarioti -> Non hanno introni Eucarioti -> Hanno introni Quiz: Perché esistono gli introni?
Le proteine Solo pochi anni dopo, eravamo già in grado di capire cosa una certa sequenza di DNA significasse in termini di aminoacido. Già nel 1966, grazie all'intuizione di Marshall Nirenberg e alla perseveranza di Gobind Khorana si conosceva l'aminoacido sintetizzato da ognuna delle 64 possibili triplette di RNA.
Il genoma umano Così James Watson descrive il genoma umano, nel suo libro DNA, the secret of life. The human genome is the great set of assembly instructions that governs the development of every one of us. Human nature itself is inscribed in that book.
Il progetto genoma umano Queste le parole con cui Bill Clinton annunciò, Lunedì 26 Giugno 2000, il completamento della prima bozza del genoma umano. "Today, we are learning the language in which God created life. With this profound new knowledge, humankind is on the verge of gaining immense, new power to heal."
La storia del progetto genoma umano Tra i primi a pensare di sequenziare il genoma umano furono, University of California Santa Cruz e il Department of Energy. Ironicamente, l'nih (che poi sarà il leader del progetto) ridicolizzò l'idea, ritenendola infattibile.
Il comitato HGP Sponsorizzato dalla National Academy of Sciences (NAS), comprendeva nomi molto importanti tra cui David Botstein, Wally Gilbert e lo stesso James Watson. Tale comitato stimò i costi del progetto e redasse una road-map.
Digressione su Wally Gilbert A metà degli anni ottanta, abbandonò il comitato HGP per tentare la strada del sequenziamento con una industria privata da lui fondata. Il piano fallì, per il semplice motivo che Gilbert era troppo avanti. Craig Venter ebbe la sua stessa idea dieci anni dopo e riuscì nell'impresa. Gilbert nel 1980 ricevette il premio Nobel (insieme a Sanger) per l'invenzione di un metodo di sequanziamento, anche se quello poi divenuto di uso comune fu quello di Sanger. Gilbert fu uno dei fondatori della Myriad Genetics.
Il costo del progetto genoma umano Il costo era un grande problema. La prima stima fu: 3 miliardi di basi, 3 miliardi di dollari. Però, tutti conoscevano la legge di Moore (decrescita dei prezzi dei PC) e sapevano che valeva anche per il sequenziamento. Il piano fu pertanto quello di inserire nel progetto il sequenziamento di altri organismi con genom apiù piccolo (E. Coli, lievito, Cenorabditis, Drosofila) in modo che i primi anni, quando le tecnologie erano più costose e i ricercatori meno esperti, si sarebbe lavorato soprattutto con i problemi piccoli e poi, quando gli investimenti per i progetti piccoli avrebbero consentito di avere un calo dei prezzi del sequenziamento e un'abilità maggiore nell'affrontare i problemi tecnici e bioinformatici, si sarebbe potuto attaccare il vero obiettivo.
Mappa genetica e fisica del genoma umano La prima cosa da fare, in attesa di sequenziare come pazzi, era ottenere la mappa genetica e la mappa fisica del genoma umano. La mappa genetica si ottiene usando le leggi della segregazione (come Morgan aveva fatto quasi un secolo prima per Drosophila), mentre la mappa fisica si ottiene sequenziando dei sottoinsiemi del genoma (spesso i cloni BAC). La mappa genetica consente di stabilire la posizione relativa dei marcatori in termini di frequenza di ricombinazione. La mappa fisica invece consente di sapere la distanza in termini di bp tra due marcatori. L'integrazione delle due mappe consente di sapere su quale cromosoma, a quale distanza, in quale ordine si trovano le sequenze che noi otteniamo.
Dal comitato HGP all'ncgr Nonstante le esitazioni iniziali, l'nih fu uno dei grandi finanziatori del progetto, tanto che nel 1990 fondò il National Center for Genome Research, con James Watson come direttore. L'NCGR diventò in seguito l'nhgri.
Suddivisione del lavoro Buona parte del lavoro fu assegnato agli Stati Uniti, gli unici che potessero destinare un discreto quantitativo di soldi. Anche Inghilterra (con una fondazione privata, in realtà, di nome Wellcome Trust), Francia, Germania e Giappone dettero disponibilità sostanziali. Tra i grandi assenti: Russia (eravamo praticamente ancora in piena guerra fredda), Italia e Spagna. Furono scelti alcuni laboratori che sarebbero stati attrezzati con numerosi sequenziatori. Questo perché centralizzando il lavoro si sarebbe sicuramente risparmiato sui costi. Tra i laboratori scelti: Sanger Center a Cambridge, UK. Washington University in St. Louis, Stanford and UCSF in California, US, University of Michigan ad Ann Arbor, MIT in Cambridge, Massachussetts e i laboratori del DOE, prima a Los Alamos, poi a Walnut Creek, California.
Innovazione Una delle speranze dei ricercatori era che l'innovazione tecnologica consentisse di accelerari i tempi e ridurre i costi. Guardando a posteriori, non ci fu una grande innovazione per quanto riguardava le macchine e le tecniche di sequenziamento. Invece vi fu una innovazione biotecnologica molto importante: il massiccio utilizzo della PCR per amplificarre i frammenti di DNA. Se non ci fosse stata la PCR effettivamente il genoma umano sarebbe costato molto di più.
Digressione sulla PCR La fase di allungamento avviene grazie alla DNA Polimerasi di Thermus aquaticus. I primi tempi la PCR era molto costosa a causa delle elevate royalties imposte dalla Hoffman-LaRoche, la ditta che aveva comprato il brevetto dalla Cetus Corporation e da Kary Mullis.
Robotica La PCR fu una scoperta molto utile. Altrettanto utile fu l'utilizzo di robot (oggi noti col nome di termociclatori) che effettuassero reazioni di PCR in rapida successione. Altro contributo importante fu l'automazione e parallelizzazione del sequenziamento Sanger. Il metodo rimase lo stesso per 30 anni, ma grazie a migliorie tecnico/robotiche divenne molto più veloce. I più attivi nell'automazione del sequenziamento furono un group leader, Lee Hood e due suoi discepoli : Lloyd Smith e Mike Hunkapiller. Oggi, Mike Hunkapiller è il CEO di Pacific Biosciences, una ditta che ha commercializzato un nuovo tipo di sequenziamento.
Ci si prepara allo sprint Come vi spiegherò meglio in seguito, a un certo punto il progetto genoma umano diventa un vero e proprio sprint tra varie realtà concorrenti. Da un lato tutti i giocatori che conosciamo, e dall'altra Craig Venter, un ambizioso ex ricercatore dell'nih che riuscì a mettere in piedi un consorzio privato in grado di dare del filo da torcere ai ben più quotati avversari. Piccola nota di colore: al momento di decidere i ruoli nel progetto genoma umano, sembrava che a Venter sarebbe spettato un ruolo molto importante, in virtù dell'abilità da lui dimostrata, ma all'ultimo minuto fu scartato e sostituito da un altro ricercatore. Proprio nel momento in cui lo sprint fu dichiarato James Watson fu incoraggiato a dimettersi da direttore dell'nhgri, e fu rimpiazzato da Francis Collins.
E lo sprint inizia La più grande ditta di sequenziatori era all'epoca l'applied Biosystems, diretta da Mike Hunkapiller. Egli propose a Venter di formare una compagnia privata finanziata in parte dall'applied Biosystems stessa, per competere contro il consorzio pubblico del progetto genoma umano. Venter accettò, nacque quella che poi sarà la Celera Genomics, e la gara ebbe inizio.
BAC-by-BAC vs WGS I due concorrenti scelsero due approcci diversi. NHGRI si affidò cautamente al metodo BAC-by-BAC, mentre il TIGR rischiò, con il Whole Genome Shotgun (WGS).
BAC-by-BAC Porzioni di genoma vengono inserite in cromosomi batterici (BAC). Questi BAC sono già stati mappati geneticamente e fisicamente. Quindi, quando si sequenziano, sappiamo già dove si trovano. Vantaggi: Si decompone il problema. Invece di sequenziare un genoma enorme, si sequenzia una piccola parte di genoma. Qundi, è poi più facile scoprire come ordinare le sequenze che abbiamo ottenuto all'interno di questo piccolo BAC. Svantaggi: Lento e costoso.
Whole genome shotgun Il mio preferito! Si prende il genoma e si sequenzia tutto senza pietà. Poi, usando algritmi bioinformatici si cerca di mettere insieme tutte le sequenze ottenute, ricostruendo il genoma. Vantaggi: rapido ed economico Svantaggi: problema computazionalmente difficile. Ci sono regioni complesse che non possono essere risolte con WGS.
Polemiche Le polemiche fioccarono subito. Craig Venter era da sempre un insider della ricerca pubblica. Tutte le informazioni generate dal progetto genoma umano venivano rilasciate all'istante al pubblico, e Venter ne usufruiva e ne aveva usufruito per anni. Se Venter non avesse avuto accesso ai dati aggironati di mappe fisiche e genetiche non sarebbe mai riuscito nel suo scopo. Al contrario, la ditta di Venter rilasciava pubblicamente le informazioni relative al genoma solo dopo un embargo di tre mesi, al fine di poter monetizzare.
Non solo sequenziamento La corsa al sequenziamento era partita, e stava accelerando. Tuttavia oltre a sequenziare era necessario dare almeno altre due informazioni: 1) Assemblare il genoma umano partendo dai piccoli pezzi disponibili 2) Scoprire quali e quanti sono i geni del genoma Per Celera, l'uomo assembly era Gene Myers, mentre per il consorzio pubblico fu Jim Kent, un giovane laureato della University of California Santa Cruz.
And the winner is... Il completamento della bozza del genoma umano fu annunciato il 26 Giugno del 2000, in contemporanea da Bill Clinton e Tony Blair. Si celebrò il risultato come un arrivo in contemporanea dei gruppi pubblico e privato. Un pareggio, insomma. In realtà, il genoma era ancora incompleto, il completamento è continuato in seguito, semplicemente fu scelto uno spartiacque.
Utilità dei risultati del progetto genoma umano Probabilmente uno dei più grandi e immediati contributi del progetto genoma umano è stato nel rivoluzionare le tecniche di mappatura genica o gene hunting. Le tecniche di mappatura dei geni resposnabili di malattie vengono in genere divise in linkage mapping e association mapping. Una delle caratteristiche di questi studi è la necessità di avere molti marcatori molecolari nel genoma. La conoscenza del genoma umano ha accelerato la scoperta di marcatori molecolari. In pochi anni, da pannelli di 400 marcatori microsatelliti, si è passati a pannelli di centinaia di migliaia di SNPs, tutto grazie alla conoscenza della sequenza del genoma.
Esempio di linkage mapping Si segue la segregazione di una malattia (o altro tratto fenotipico) in una famiglia. Allo stesso tempo si segue la segregazione dei marcatori e si cercano situazioni in cui i marcatori e la malattia cosegregano, cioè sono in linkage.
Esempio di association mapping Non si studia la segregazione. Non è necessario avere una famiglia, né conoscere le relazioni tra le persone studiate. Anzi, si preferisce utilizzare un campione composto da un elevato numero di persone non imparentate. Genome-Wide association. Molto potente, richiede migliaia di marcatori. Iniziata subito dopo la pubblicazione del genoma umano.
Genoma umano e salute La conoscenza del genoma umano si sta dimostrando utile per le scienze mediche, in vari modi. 1) Diagnosi precoce mediante l'utilizzo di marcatori molecolari 2) Identificazione dei farmaci adatti al paziente mediante l'uso della farmacogenomica 3) Comprensione delle basi molecolari delle malattie mediante lo studio genetico di tessuti malati 4) Sviluppo di terapia genica per le malattie a base genetica 5) Conoscere in anticipo chi è a rischio per una determinata malattia (test genetici) 6) Facilita l'identificazione di geni coinvolti in malattie mediante studi di associazione
La genomica dopo il genoma umano
Next generation sequencing HiSeq: 120-150 Millions of clusters per lane (8 lanes) MiSeq: 7 Millions of clusters per flowcell (1 lane)
The next level: NGS Sta per Next Generation Sequencing. Consente di fare studi come quelli che venivano effettuati con i microarray, e molti altri studi. DNA Fragmented DNA Reference genome DNA library @ILLUMINA-C3C24B_0053:6:1:1429:17486#0/1 GTTCTACCAGAACTTGCCTGACCTTCTGCATCAGTGGAT +ILLUMINA-C3C24B_0053:6:1:1429:17486#0/1 bb^aca`b^^``babbbabbbbbbb`bbcbbbbbbabbb @ILLUMINA-C3C24B_0053:6:1:1429:12585#0/1 GGTTGACTGGACATCTAGGGGTAAAGCACTGTTTCGGTG +ILLUMINA-C3C24B_0053:6:1:1429:12585#0/1 b`b`bbabbbbbbbbbabbbb_bbbbbbbbbbbbbbbyb
Next generation sequencing per genotipizzare
Letture James Watson: DNA, the secret of life, Alfred A. Knpof, 2004 Erwin Schrödinger: What is life? Cambridge University Press, 1944 Kary Mullis: Ballando nudi nel campo della mente, Baldini & Castoldi, 2000