CAPITOLO I INTRODUZIONE

PREMESSA Ad oggi, le ragioni dell importanza dalla caratterizzazione immunofenotipica nel contesto delle patologie onco-ematologiche, risiedono principalmente nel ruolo sempre crescente che essa svolge non solo nella diagnosi e classificazione delle emopatie ma soprattutto nella identificazione, al loro interno, di sottogruppi caratterizzati da prognosi e risposta alla terapia differenti, con la possibilità di individuare importanti bersagli biologici, targets di approcci terapeutici sempre più personalizzati (target therapy). In particolare, la valutazione fenotipica dell espressione di particolari antigeni sulla superficie cellulare, unitamente alla quantizzazione ed allo studio della modulazione della loro intensità di espressione, oltre che permettere la definizione di fasi distinte del processo differenziativo cellulare, sottolinea l importanza dell indagine citofluorimetrica nella identificazione di caratteristiche fenotipiche specifiche che potrebbero indirizzare verso trattamenti che prevedano, ad esempio, l utilizzo di specifici anticorpi monoclonali, ormai divenuti di largo impiego nella pratica clinica. Accanto a ciò, lo studio immunofenotipico in ambito ematologico permette di identificare la presenza di proteine con ormai riconosciuto valore prognostico e che rappresentano dei veri e propri parametri biologici sulla base dei quali è possibile effettuare una scelta terapeutica specifica per ciascun paziente. Un esempio è rappresentato dalla possibilità, mediante saggio citofluorimetrico, di determinare la presenza della proteina di fusione Bcr-Abl in lisati di campioni di leucemia acuta, o dalla possibilità di valutare, mediante metodiche di immunocitochimica, un accumulo aberrante della proteina p53 in campioni di pazienti affetti da leucemia linfatica cronica. Ultimo, ma non meno importante aspetto da considerare, è il ruolo che un ampia e dettagliata caratterizzazione fenotipica in fase diagnostica ricopre nelle fasi di valutazione della malattia minima residua permettendo un accurato monitoraggio dei pazienti affetti da patologie ematologiche mediante metodiche citofluorimetriche. 1

CAPITOLO I INTRODUZIONE La Leucemia Acuta Linfoblastica La Leucemia Acuta Linfoblastica (LAL) rappresenta un eterogeneo gruppo di disordini neoplastici dei tessuti linfoidi caratterizzati da una proliferazione monoclonale ed auto mantenuta e da una espansione di cellule linfoidi immature in seguito ad alterata regolazione dei processi di differenziamento, proliferazione e/o sopravvivenza cellulare (Jabbour EJ et al, Mayo Clin Proc 2005; Stavropoulou V et al, Swiss Med Wkly 2010). Le LAL costituiscono la neoplasia più frequente in età pediatrica rappresentando circa l 80% delle leucemie acute del bambino con un picco di prevalenza tra i 2 ed i 5 anni di età (Pui CH et al, Lancet 2008). Esse risultano invece meno frequenti nell adulto, con una frequenza complessiva del 20% (Jabbour EJ et al, Mayo Clin Proc 2005) e la tendenza ad un successivo incremento intorno ai 50 anni di età (Faderl S et al, Cancer 2010). E nota inoltre una modesta predominanza nel sesso maschile, con un rapporto uomo/donna di circa 2/1. Nella maggior parte dei casi, gli specifici eventi patogenetici che sottendono allo sviluppo di tale forma leucemica restano sconosciuti. E stata però ipotizzata la possibilità che le LAL possano svilupparsi in seguito ad una combinazione di cause ambientali, della presenza di una suscettibilità genetica e dell azione di specifici oncogeni tumorali. Tra le cause ambientali le esposizioni ad elevate dosi di radiazioni ionizzanti, così come a particolari sostanze nell ambito di contesti sociali di maggiore sviluppo ed urbanizzazione, sono ormai riconosciuti come effettivi fattori di rischio nello sviluppo di tale patologia. L associazione tra le LAL e la presenza di alcune delle principali anomalie genetiche deriva dalla constatazione di una incidenza maggiore di leucemia acuta nei pazienti con sindrome di Down o di Klinefelter. Analogamente, l aumentata incidenza di LAL nei bambini con sindrome di Fanconi o di Bloom, oppure nei casi con immunodeficienze primarie come la sindrome di Wiskott-Aldrich o l atassia-teleangectasia, potrebbe rappresentare un sostegno all ipotesi dell influenza della suscettibilità genetica nell eziologia di questa forma leucemica (Pui CH et al, Lancet 2008). Inoltre, l idea che l ereditarietà genetica possa svolgere un ruolo importante nel processo di leucemogenesi, deriva dalle dimostrazioni relative alla comparsa di forme leucemiche in fratelli il cui gemello monocoriale avesse precedentemente sviluppato una leucemia. La più plausibile interpretazione di 2

tale constatazione potrebbe essere un passaggio di cellule appartenenti al clone leucemico, dal feto in cui inizia il processo neoplastico all altro tramite vascolatura placentare. A ciò si associa anche l ipotesi che le LAL possano svilupparsi direttamente nell utero materno, considerata la dimostrazione della presenza di specifici riarrangiamenti clonali dei geni del T-cell receptor (TCR), delle immunoglobuline (Ig), o della sequenza di un gene di fusione leucemico, nel sangue prelevato alla nascita in bambini che hanno in seguito sviluppato leucemia (Taub JW et al, Blood 2002). Pertanto, quando uno o più dei fattori precedentemente riferiti provocano un alterazione nell ordinato processo di maturazione della cellula linfoide in senso neoplastico, i linfoblasti perdono la capacità di dare origine a cellule normalmente maturanti. Essi sono in grado di espandersi accumulando una serie di anomalie genetiche e di sostituire via via il midollo osseo raggiungendo successivamente il sangue periferico, infiltrando organi e tessuti linfoidi e non (linfonodi, fegato, sistema nervoso centrale, testicoli, ossa) e dando luogo alla comparsa della leucemia. In particolare, si ritiene che le LAL traggano origine dalle molteplici ed importanti alterazioni genetiche che si verificano a livello dei progenitori emopoietici già commissionati a differenziare in cellule di linea B o T, incluse le mutazioni che conferiscono capacità di un illimitato self-renewal e quelle che determinano un arresto in una fase specifica del processo maturativo linfoide (Armstrong SA and Look AT, J Clin Oncol 2005; Pui CH et al, Lancet 2008). Le cellule implicate nel processo leucemico mostrano come principale caratteristica la presenza di riarrangiamenti clonali nei geni delle Ig o del TCR. Inoltre, nel corso degli ultimi decenni sono aumentate le evidenze che indicano come difetti cromosomici ed anomalie molecolari siano consistentemente presenti nei pazienti affetti da LAL con conseguente perdita del controllo esercitato da geni oncosoppressori ed attivazione di oncogeni o di specifiche proteine di fusione con potenziale attività trascrizionale (Armstrong SA and Look AT, J Clin Oncol 2005; Pui CH et al, Lancet 2008). La caratterizzazione di tali anomalie cromosomiche ricorrenti ha permesso l'identificazione dei relativi geni implicati nel processo di leucemogenesi (Rowley JD, Annu Rev Genet 1998; Greaves MF and Wiemels J, Nature Rev Cancer 2003). In questo contesto, l'utilizzo di metodiche di analisi di espressione genica permette oggi di delineare patterns di espressione specifici per le singole aberrazioni cromosomiche tali da sostenere l idea che una traslocazione cromosomica identifichi un unico e specifico sottotipo leucemico (Haferlach T et al, Semin Hematol 2003; Chiaretti S et al, Clin Cancer Res 2005). Sebbene tali lesioni genetiche sembrerebbero necessarie per scatenare un evento leucemico, nella maggior parte dei casi, esse non risultano da sole sufficienti a generare un fenotipo leucemico completo. Diverse evidenze suggeriscono la necessità del manifestarsi di lesioni genetiche cooperanti a livello di differenti geni e quindi l intervento di eventi patogenetici aggiuntivi 3

(Mullighan CG et al, Nature 2007). In proposito, oggi la ricerca nell ambito della patogenesi delle LAL si dirige sempre più verso identificazione di nuove alterazioni genetiche e verso la comprensione degli effetti che esse svolgerebbero sulla proliferazione cellulare, sul differenziamento e sulla sopravvivenza alla luce del fatto che tali lesioni ed i loro prodotti proteici potrebbero costituire potenziali bersagli per lo sviluppo di strategie terapeutiche tese a colpire specificamente la cellula tumorale trasformata. In aggiunta a quanto detto, è sempre più evidente il ruolo dei cambiamenti epigenetici nello sviluppo e mantenimento di uno stato leucemico. Essi includono sia modificazioni biochimiche reversibili a livello della cromatina del DNA, quali ad esempio i processi di metilazione, che modificazioni della cromatina istonica che senza alterare la sequenza primaria del DNA sono in grado influenzare l espressione genica. Le modificazioni a livello degli istoni sono inoltre responsabili del controllo dell attività trascrizionale attraverso il ruolo esercitato sui micro RNAs (mirnas) i quali a loro volta tramite meccanismi posttrascrizionali possono regolare negativamente un serie di geni target e svolgere così un ruolo chiave nella patogenesi delle leucemie acute (Yendamuri S and Calin GA, Leukemia 2009; Stavropoulou V et al, Swiss Med Wkly 2010). Il quadro clinico delle LAL non depone a favore di sintomi o segni clinici specifici della malattia. Spesso i sintomi, diversi da paziente a paziente, sono ad insorgenza improvvisa e complessivamente simili tra pazienti adulti e pediatrici. Generalmente, viene riferita una breve storia di astenia, febbre, sudorazione notturna, calo ponderale e talvolta dolori ossei e manifestazioni emorragiche. Essi rappresentano la diretta conseguenza della proliferazione delle cellule leucemiche nel midollo osseo e nel sangue venoso periferico nonché della possibile compromissione da parte delle stesse cellule leucemiche di altri organi e sistemi quali fegato, milza, linfonodi, mediastino e sistema nervoso centrale (SNC). Le infezioni ricorrenti o prolungate a causa della neutropenia, così come la comparsa di manifestazioni emorragiche diverse dovute alla carenza piastrinica, sono diretta espressione dell insufficienza midollare. Possono essere presenti sintomi come nausea, cefalea o vomito come segno di compromissione del SNC. L esame emocromocitometrico può evidenziare situazioni di anemia, leucopenia o leucocitosi e piastrinopenia, che non risultando però specifiche di tale leucemia, in quanto comuni ad altre patologie di natura ematologica, necessitano di una attenta osservazione microscopica di uno striscio di sangue venoso periferico allo scopo di mettere in evidenza la presenza di blasti. Ad ogni modo, qualora il quadro clinico e l emocromo depongano per un sospetto di una leucemia acuta, è d obbligo effettuare un agoaspirato midollare per l esecuzione della maggior parte delle indagini di laboratorio ed un corretto inquadramento diagnostico-prognostico del caso. Considerato il rapido decorso e l evoluzione clinica di questa forma di leucemia acuta, l attenta caratterizzazione biologica del clone leucemico risulta 4

estremamente importante non solo per il corretto inquadramento diagnostico ma soprattutto per l identificazione nell ambito delle LAL di sottogruppi prognostici differenti che potrebbero potenzialmente beneficiare di trattamenti terapeutici specifici. Infatti, alla luce dei progressi ottenuti nel corso degli anni che hanno consentito importanti scoperte in ambito biologico e terapeutico, assistiamo oggi ad un continuo miglioramento dell outcome dei pazienti affetti da LAL con percentuali di sopravvivenza libera da eventi (Event Free Survival, EFS) che nonostante i valori ancora non ottimali nell ambito dei pazienti adulti (circa 40%), raggiungono però percentuali pari alll 80% nei bambini di età compresa tra 1 e 10 anni (Rowe JM et al, Blood 2005). 5

Diagnosi Ad oggi, i progressi tecnologici e scientifici raggiunti, rendono imprescindibile una corretta classificazione diagnostica dei pazienti affetti da LAL sulla base delle differenti caratteristiche biologiche. L importanza di un corretto inquadramento diagnostico, è però attribuibile non solo alla possibilità di classificare un eterogeneo complesso di disordini quali possono essere le LAL, ma soprattutto di stratificare al loro interno i pazienti in differenti categorie di rischio che possano beneficiare di trattamenti terapeutici specifici. La diagnostica delle leucemie acute è andata incontro ad un sostanziale cambiamento fin dal 1970 quando citomorfologia e citochimica rappresentavano gli unici mezzi disponibili per effettuare una corretta diagnosi. Da allora, l avanzamento delle tecniche diagnostiche, unitamente alla continua integrazione dei risultati da esse ottenuti, ha consentito una differente visione delle leucemie acute, oggi concepite come eterogeneo complesso di entità citogenetiche e molecolari, risultato di differenti meccanismi di leucemogenesi (Haferlach T et al, Ann Hematol 2007). Dunque, accanto ai primitivi approcci morfologici e citochimici, l analisi citofluorimetrica nelle LAL ha permesso una loro attenta caratterizzazione fenotipica con la possibilità di distinguere il lineage cellulare differenziandone all interno i diversi stadi maturativi della cellula linfoide. Inoltre, le tecniche di bandeggio cromosomico, insieme all analisi FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) hanno fornito informazioni riguardo la presenza di alterazioni genetiche microscopiche e submicroscopiche. Accanto a ciò, la disponibilità di metodiche di biologia molecolare e sequenziamento genico, oltre a dare conferma dei risultati ottenuti dalle analisi citogenetiche ha permesso una più precisa identificazione dei punti di rottura ed un analisi mutazionale di specifici geni consentendo così ulteriori sub-classificazioni con importante valore prognostico. Infine, l utilizzo di tecniche di genome-wide single-nucleotide polymorphism (SNP)-arrays consentono l identificazione di alterazioni genetiche strutturali a livello di specifici geni con ruolo cruciale in importanti pathways cellulari (Mullighan CG and Downing JR, Leukemia 2009). 6

Valutazione citomorfologica Il primo step nell iter diagnostico di una LAL è rappresentato dall osservazione al microscopio ottico di strisci di sangue venoso periferico e/o di sangue midollare preparati utilizzando la metodica di colorazione di May-Grunwald-Giemsa. I principali criteri morfologici a cui si fa riferimento nell analisi dei campioni, sono raccomandati dalla classificazione proposta dal French-American-British (FAB) cooperative group secondo la quale una LAL - distinta nelle tre varianti morfologiche L1, L2 ed L3 - si caratterizza per la presenza a livello midollare di elementi immaturi della serie linfoide in una quota uguale o superiore al 30% (Bennet JM et al, Br J Hematol 1976). Poco piùdi un ventennio dopo, l introduzione della classificazione WHO (World Health Organization) sulla base della presenza a livello midollare di una quota di blasti superiore o uguale al 20%, e di un insieme di caratteristiche morfologiche, fenotipiche, citogenetiche e cliniche ha consentito una sempre migliore definizione, soprattutto prognostica, di tale entità patologica (Harris NL et al, J Clin Oncol 1999). In questo contesto, la suddivisione morfologica tra le forme L1 ed L2 non viene quasi più utilizzata, poiché essa non sembra associarsi ad un particolare fenotipico leucemico, nè alla presenza di alterazioni citogenetiche o ad un particolare andamento clinico, senza quindi rivestire alcun significato prognostico. Fanno eccezione le forme di LAL L3 che restano classificate come entità distinte per la presenza di caratteristiche clinico-biologiche ben definite e distinguibili, con una prognosi specifica e la possibilità di beneficiare di trattamenti terapeutici mirati. Riguardo la valutazione citochimica, per la LAL non esiste in realtà un test specifico; tuttavia, per definizione, la cellula leucemica linfoide risulta essere negativa al test per la mieloperossidasi (MPO), che caratterizza invece la maggior parte delle cellule di derivazione mieloide. Le altre reazioni citochimiche, come la colorazione con l acido periodico di Schiff (PAS) o il test per l esterasi non-specifica, possono essere positive in alcuni sottogruppi di LAL, ma non risultano specifiche di tale patologia essendo esse presenti anche in casi di leucemia acuta mieloide (LAM). 7

Caratterizzazione immunofenotipica Accanto alle sempre più innovative valutazioni genetico-molecolari ed alla più comune caratterizzazione citomorfologica, lo studio dell immunofenotipo riveste un ruolo estremamente importante nel percorso diagnostico delle LAL. La tipizzazione immunofenotipica mediante citofluorimetria si basa sul riconoscimento di un fenotipo dominante a livello della popolazione leucemica mediante anticorpi monoclonali (AcMo) direttamente coniugati a fluorocromi che, grazie all introduzione di citofluorimetri in grado di analizzare otto o più parametri contemporaneamente, consentono oggi una analisi dettagliata e simultanea della espressione di differenti antigeni. La valutazione della presenza di antigeni di superficie e citoplasmatici rende possibile la caratterizzazione della linea di appartenenza delle cellule presenti nel campione in esame permettendo la distinzione delle forme a fenotipo B che rappresentano la maggioranza delle LAL (75-80% dei casi adulti, 85-90% dei casi pediatrici), da quelle a fenotipo T caratterizzate da una minore frequenza (20-25% negli adulti, 10-15% nei casi pediatrici). Inoltre, in merito al processo differenziativo, sia i precursori linfoidi di linea B che quelli di linea T seguono un percorso maturativo che dalla cellula staminale ematopoietica termina a livello dei linfociti B e T maturi, attraversando stadi diversi distinguibili sulla base della presenza o meno di particolari marcatori e della loro intensità di espressione, consentendo così una precisa definizione immunologica delle LAL (Bene MC et al, Leukemia 1995; Bene MC, Immunol Lett 2005). Tale classificazione descritta dall EGIL (European Group for the Immunological Characterization of Leukemias) (Bene MC et al, Leukemia 1995) basandosi sulla presenza o meno di specifici antigeni di differenziazione, di superficie ed intracitoplasmatici, ha permesso di suddividere sia le LAL di linea B che quelle di linea T in differenti sottogruppi. Le LAL di linea B, definite come tali per la presenza di almeno due degli antigeni di linea quali il CD79a, espresso a livello citoplasmatico, il CD19 ed il CD22 espressi in superficie, possono distinguersi in quattro differenti sottogruppi (Tabella 1). Analogamente, le LAL-T, caratterizzate dalla presenza dell antigene CD3 a livello citoplasmatico ed in una minore percentuale di casi anche in superficie, unitamente all espressione dell antigene CD7, possono distinguersi in quattro diversi sottotipi leucemici (Tabella 1). Con riguardo alle LAL T, un recente studio condotto su 239 pazienti arruolati al St Jude Children s Research Hospital e nel protocollo italiano AIEOP (Associazione Italiana Ematologia Oncologia Pediatrica) ha permesso di identificare un quinto sottogruppo caratterizzato dalle Early T-cell Precursors (ETPs) leukemias, che con caratteristiche biologiche peculiari risulta associato ad un elevato rischio di recidiva dopo trattamenti chemioterapici intensivi (Coustan-Smith E et al, Lancet Oncol 2009). Questo studio ha evidenziato, mediante analisi di gene expression profile, un ben preciso pattern di espressione 8

genica oltre ad un incrementato numero di lesioni genomiche rispetto alle altre LAL-T come a denotare una elevata instabilità genetica nei pazienti che mostrano tale fenotipo leucemico. Esso risulta caratterizzato dall assenza degli antigeni CD1a e CD8, da una debole espressione del CD5 e dall espressione di uno o più antigeni caratteristici della linea mieloide e/o della cellula staminale ematopoietica (CD117, CD34, CD13, CD33, CD11b, HLA-DR o CD65). Sebbene le attuali potenzialità della caratterizzazione immunofenotipica permettano quindi una accurata distinzione delle LAL di linea B da quelle di linea T con al loro interno una attenta suddivisione immunologica, rimane tuttavia una piccola percentuale di casi in cui non è facile stabilire una diagnosi a causa della concomitante espressione sulla stessa popolazione leucemica (leucemia acuta bi-fenotipica) o su popolazioni differenti (leucemia acuta bi-clonale) di antigeni linfoidi e mieloidi. L EGIL ha suggerito in questi casi, l utilizzo di un sistema di score, basato sull assegnazione di un preciso punteggio in base alla presenza di antigeni di linea B, T o mieloidi e sulle loro associazioni (Bene MC et al, Leukemia 1995). Restano comunque esclusi i casi che non mostrano alcun marker di linea e che secondo tale classificazione vengono definiti come Acute Undifferentiated Leukemias (AUL). Infine, una revisione della classificazione WHO fatta nel 2008 (Vardiman JW et al, Blood 2009) ha rivisitato i requisiti necessari per la diagnosi e classificazione delle leucemie di difficile assegnazione di linea. Quelle forme leucemiche in precedenza designate come bi-fenotipiche e bi-clonali sono state globalmente considerate come Mixed Phenotype Acute Leukemias (MPAL) di tipo B/mieloide o T/mieloide a seconda delle popolazioni coinvolte nel processo leucemico. Non è però ancora ben definito il significato clinico ed il trattamento necessario per tali entità leucemiche. L importanza dello studio fenotipico delle popolazioni leucemiche risiede anche nella possibilità di mettere in evidenza attraverso di esso espressioni antigeniche aberranti (presenza di antigeni appartenenti alla linea mieloide o di natura non ematologica) o asincrone (concomitante presenza di marcatori linfoidi della cellula matura con quelli tipici della cellula immatura) a livello della popolazione in esame che, oltre a definire importanti LAIPs (leukemia associted immunophenotypes) imprescindibili per il monitoraggio dei pazienti durante il follow-up, potrebbero, in alcuni casi, essere indicativi della presenza di una specifica lesione genetica. Il significato prognostico della positività per antigeni definiti aberranti nelle LAL, in quanto tipicamente mieloidi, quali CD13 e/o CD33, risulta essere estremamente controverso. Sebbene, in uno studio condotto dal nostro gruppo (Vitale A et al Haematologica 2007) tale positività non sembrerebbe rappresentare un fattore prognostico sfavorevole anche perché non associata alla presenza di alcuna anomalia citogenetica, studi precedenti avevano dimostrato una correlazione tra l espressione di tali antigeni - unitamente ad un eterogenea espressione del CD38 - e la presenza del 9

gene di fusione BCR/ABL (Tabernero MD et al, Leukemia 2001). Inoltre, l evidenziata reattività di cellule ottenute da pazienti che presentavano il gene di fusione BCR/ABL con espressione della proteina p190, all anticorpo monoclonale KOR-SA3544 (o CD66-c) dimostrava una associazione di tale antigene (la cui presenza è aberrante nelle LAL in quanto sempre negativo nelle normali cellule linfoidi) con la suddetta alterazione cromosomica (Mori T et al, Leukemia 1995). Ad ogni modo, è evidente come la presenza di un fenotipo peculiare, che nell ambito delle LAL-B presenti una positività agli antigeni CD13 e/o CD33, una eterogenea espressione o assenza dell antigene panleucocitario CD38 insieme alla presenza dell antigene CD66c, possa solo rappresentare una ipotesi rispetto alla sua associazione con la traslocazione cromosomica t(9;22). Infatti, da un analisi effettuata nel nostro istituto, su 46 casi affetti da LAL-B con t(9;22), si evidenziava come il 21% di essi pur non mostrando un fenotipo predittivo presentava tale anomalia cromosomica (dati non pubblicati). Discorso analogo se si considera la presenza di altri antigeni mieloidi aberranti quali il CD15 ed il CD33 in associazione all ectopica presenza dell NG2 (antigene di natura non emopoietica), all assenza dell antigene CD10 e degli antigeni mieloidi CD13 e CD33, unitamente ad una frequente bi-modalità nell espressione del CD34. Tale fenotipo infatti, è stato più volte dimostrato come associato alla presenza del gene di fusione MLL1/AF4 sebbene in alcuni casi sia stato riscontrato anche in una piccola percentuale di casi caratterizzati da altri riarrangiamenti di MLL (De Zen L et al, Leukemia 2003; Schwartz S et al, Leukemia 2003). Entrambi i patterns fenotipici descritti, oltre ad evidenziare il ruolo predittivo, anche se non specifico, che lo studio fenotipico può svolgere nella identificazione genetico-molecolare di alcune peculiari aberrazioni cromosomiche, costituiscono firme immunofenotipiche specifiche di ciascun paziente che conferiscono a tale metodica il ruolo di potente strumento nel contesto del monitoraggio della quota di malattia minima residua dopo trattamento terapeutico. Ultimo ma non meno importante aspetto da considerare, nell ambito della caratterizzazione immunofenotipica delle LAL è sicuramente la possibilità di definire le modalità con cui un antigene risulta espresso a livello cellulare, spesso rappresentative dello stadio maturativo e del momento funzionale della cellula (Raponi S et al, Leuk Lymphoma 2011). L intensità di fluorescenza emessa dall anticorpo monoclonale in seguito al riconoscimento antigenico consente infatti una distinzione della cellula leucemica dalla sua controparte normale, oltre a risultare ancora una volta di grande aiuto nella quantizzazione della quota patologica residua dopo terapia. Tale intensità di espressione può essere valutata sia attraverso la MFI (Mean Fluorescence Intensity), che rappresenta la media delle intensità delle fluorescenze per un dato antigene, sia calcolando la misura precisa del numero dei siti antigenici presenti sulla superficie cellulare attraverso l ABC (Antibody Binding Capacity) ovvero la capacità di legame media di una popolazione cellulare per un dato anticorpo monoclonale. 10

Tutto ciò risulta estremamente importante anche e soprattutto alla luce della dimostrata efficacia di terapie innovative che sulla base dell intensità di espressione antigenica utilizzano specifici AcMo in associazione a chemioterapici convenzionali consentendo così l ottenimento di sempre maggiori percentuali di remissione completa di malattia (Coleman M et al, Clin Cancer Res 2003; Gokbuget N and Hoelzer D, Ann Hematol 2004) e migliorando quindi l outcome dei pazienti affetti da LAL. 11

Caratterizzazione genetico-molecolare L utilizzo delle metodiche di analisi citogenetica classica e successivamente molecolare, hanno fornito un importante contributo nell identificazione, nell ambito delle LAL, di un ulteriore livello di eterogeneità attraverso l identificazione di riarrangiamenti cromosomici, alcuni dei quali con importante valore prognostico e quindi di particolare rilievo per l utilizzo di specifiche strategie terapeutiche (Mancini M et al, Blood 2005; Moorman AV et al, Blood 2007; Pullarkat V et al, Blood 2008). Le analisi di citogenetica convenzionale consentono l identificazione delle aberrazioni del cariotipo solo in una parte dei pazienti affetti da LAL a causa del basso indice mitotico del blasto leucemico e della scarsa qualità delle metafasi associate a tale patologia. L introduzione di nuove tecnologie, sviluppate su base molecolare, consente oggi di identificare la presenza di anomalie cariotipiche, altrimenti non individuabili, con maggiore accuratezza ed incremento della risoluzione (Speicher MR and Carter NP, Nat Rev Genet 2005). Si tratta di metodologie che vanno dalla FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), alle tecniche SKY/M- FISH (Spectral Kayotyping/Multicolor-FISH), alla CGH (Comparative Genomic Hybridization.). Le alterazioni citogenetiche possono essere di struttura, di numero o in alcuni casi nello stesso paziente possono presentarsi entrambe le tipologie. Le anomalie cromosomiche strutturali risultano le più rappresentate e tra queste le traslocazioni sono le più frequenti. Queste ultime causando un cambiamento di posizione di materiale cromosomico e delle sequenze geniche in esso contenute mostrano come effetto finale la trasformazione di un proto-oncogene in oncogene attraverso due meccanismi. Il primo - dovuto alla giustapposizione del proto-oncogene a sequenze regolatorie di geni ad elevata attività di sintesi quale i promoters dei geni codificanti per le Ig o per il TCR - determina una alterazione quantitativa con conseguente incremento dell espressione dell oncogene. Un classico esempio di questo meccanismo è rappresentato dal riarrangiamento del gene c-myc con il gene della IgH nella t(8;14) che caratterizza le LAL a morfologia L3. Il secondo meccanismo determina, invece, una alterazione qualitativa delle sequenze proto-oncogeniche dovuta alla giustapposizione delle regioni codificanti di due geni diversi con conseguente formazione di una nuova sequenza genica assente nelle cellule normali. Si forma così un gene ibrido, che codificherà una proteina chimerica con alterata attività trascrizionale. Tali lesioni genetiche dalle quali deriva la formazione di specifici geni e delle rispettive proteine di fusione ricorrono nelle LAL con una frequenza che va dal 30 al 50% (Gabert J et al, Leukemia 2003). 12

Focalizzando l attenzione sulle LAL-B, una delle più comuni anomalie cromosomiche è rappresentata dalla traslocazione reciproca e bilanciata tra il cromosoma 9 ed il 22 (t[9;22][q34;q11]). Tale traslocazione determina una giustapposizione dei loci BCR (Breakpoint Cluster Region) ed ABL (Abelson kinase gene) con la formazione di un gene di fusione BCR/ABL in grado di codificare differenti tipologie di proteine di fusione con deregolata attività tirosinchinasica (Deininger MWN et al, Blood 2000). La presenza del trascritto BCR/ABL si osserva nel 25-30% degli adulti dove è dimostrato un incremento con il progredire dell età (più del 50% dei casi con età maggiore dei 60 anni), mentre risulta raro nei bambini con una frequenza del 2-5% (Burmesteir T et al, Blood 2008; Szczepanski T et al, Lancet Oncol 2010). Altra traslocazione, presente con uguale frequenza nelle diverse fasce di età coinvolge il gene E2A sul cromosoma 19 ed il gene PBX1 sul cromosoma 1. Tale traslocazione t(1;19)(q23;p13), presente complessivamente nel 3-5% delle LAL, determina la formazione del gene di fusione E2A/PBX1 e della rispettiva proteina con attività aberrante e particolare effetto sui processi differenziativi (Hunger SP et al, Blood 1991). Il valore prognostico di tale alterazione nell adulto è controverso. E stato inizialmente identificato come associato ad una prognosi sfavorevole ma, almeno nei bambini, quando trattati con regimi chemioterapici intensivi, sembrerebbe comportarsi come le principali anomalie citogenetiche associate ad una prognosi favorevole (Pui CH et al, N Engl J Med 2004). Particolarmente importanti, soprattutto per il loro valore prognostico, risultano i riarrangiamenti che coinvolgono il gene MLL generalmente associati con maggiore frequenza alle LAL degli infants (Biondi A et al, Blood 2000), con un immunofenotipo pro-b, organomegalia, iperleucocitosi e coinvolgimento del SNC. La traslocazione t(4;11)(q21;q23) con formazione del gene di fusione MLL/AF4 rappresenta il più frequente riarrangiamento in questo ambito. Esso si associa ad una prognosi sfavorevole sia nei bambini, dove raggiunge una frequenza del 50% nei casi con età inferiore ad un anno, che negli adulti. Altra traslocazione cromosomica importante nell ambito delle LAL-B per il ruolo prognostico che essa riveste è la t(12;21)(p13;q22) che porta alla formazione del gene di fusione TEL/AML1 (ETV6-RUNX1). Con una frequenza del 20-30% nei bambini e meno del 5% negli adulti, fornisce una possibile spiegazione in merito alle maggiori percentuali di sopravvivenza descritte nelle casistiche pediatriche rispetto a quanto si verifica nell adulto (Zalent A et al, Oncogene 2004). Tra le anormalità genetiche riscontrabili in corso di LAL-B non si può certamente tralasciare il ruolo svolto dalle mutazioni dei geni JAK1, JAK2 e JAK3 (Mullighan CG et al, Proc Natl Acad Sci USA 2009) la cui identificazione è diventata di rilevante importanza vista la disponibilità di inibitori del gene JAK2. Inoltre, recenti lavori (Mullighan CG et al, N Engl J Med 2009) hanno descritto sul cromosoma 7 a livello della regione p12 la delezione di IKZF1, che codifica il fattore 13

di trascrizione IKAROS, in molti dei casi positivi per la presenza di BCR/ABL, suggerendo una associazione tra queste due alterazioni genetiche che provocherebbe un arresto nella maturazione delle cellule linfoidi B inducendo la comparsa della leucemia, oltre ad identificare nell ambito delle LAL Ph+, un sottogruppo di pazienti con una prognosi ancor più sfavorevole (Martinelli G et al, J Clin Oncol 2009). Le anomalie cromosomiche risultano, al contrario, meno frequenti nell ambito delle LAL-T. La più comune è rappresentata dalla formazione del gene di fusione SIL/TAL1 derivante da una delezione submicroscopica a livello della regione 1p32, presente nel 5-10% degli adulti e nel 10-20% dei bambini. Inoltre, una over-espressione di TAL1 è stata riscontrata in circa il 40% delle LAL-T con conseguente alterazione dei meccanismi di differenziamento e proliferazione cellulare. Altra traslocazione cromosomica presente in circa il 10% delle LAL-T è la t(10;11)(p13;q23), che risulta nella formazione del gene CALM/AF10 che identifica un sottogruppo di pazienti con uno specifico profilo di espressione genica. Un coinvolgimento del gene ABL1 con la formazione del gene di fusione NUP214/ABL1 è stato riscontrato in circa il 6% delle LAL-T (Graux C et al, Leukemia 2006). In questo contesto, analisi di gene expression profile, hanno dimostrato nei casi con tale anomalia cromosomica una elevata espressione del gene ABL1 (Chiaretti S et al, Haematologica 2007). E stato constatato, inoltre, che la contemporanea presenza del gene di fusione NUP214/ABL1 con EML1/ABL1, quest ultimo derivante dalla traslocazione t(9;14)(q34;q32), spesso si associa alla presenza di altre aberrazioni come ad indicare un contributo multigenico alla leucemogenesi nelle cellule T (Chiaretti S et al, Haematologica 2007). Altra dimostrazione di tale ipotesi è rappresentata dalla possibilità d riscontrare una attivazione costitutiva del gene JAK2 come conseguenza della t(9;12)(p24;p13) con formazione del gene di fusione ETV6- JAK2 (Peeters P et al, Blood 1997). Altre lesioni più recentemente identificate nelle LAL-T includono le mutazioni di Notch1, JAK1 e CEBPA unitamente all overespressione di geni quali TLX1 (HOX11), TLX3 (HOX11L2), TAL1 e LYL1 (Graux C et al, Leukemia 2006; Chiaretti S et al, Haematologica 2007). Piú in generale, diventa oggi sempre piú evidente come unitamente alle alterazioni cromosomiche note, la concomitante presenza di aberrazioni secondarie possa avere una rilevante importanza clinica nel contesto delle leucemie acute. Meno frequenti nelle LAL sono le anomalie numeriche. Le iperdiploidie sono presenti nel 5-10% dei casi adulti e l associazione con una migliore prognosi è meno ovvia rispetto a quanto avviene nei bambini, nei quali con una frequenza del 25%, le LAL iperdiploidi presentano un outcome migliore con l 80% di EFS a 5 anni (Harrison CJ, Blood Rev 2001). I casi con ipodiploidia invece, 14

che rappresentano circa il 2-4% delle LAL, sono associati per entrambi i gruppi, adulti e bambini, ad una prognosi sfavorevole. Molte delle più comuni traslocazioni cromosomiche sono state inoltre studiate anche a livello molecolare mediante l utilizzo di tecniche di Q-RT-PCR (Quantitative-Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction) che rispetto alle analisi citogenetiche hanno il vantaggio di poter essere utilizzate anche nel monitoraggio dei pazienti dopo terapia essendo in grado di identificare, con elevata sensibilità, il numero esatto di copie di RNA messaggero presenti a livello cellulare (Elia L et al, Haematologica 2003; Beillard E et al, Leukemia 2003). Tali metodiche di Q-RT-PCR sono inoltre molto importanti per identificare la presenza di riarrangiamenti specifici e clonali a livello dei geni delle Ig e del TCR (van Dongen JJ, Leukemia 2003) che caratterizzano gran parte delle LAL, consentendone la distinzione da eventuali proliferazioni linfoidi reattive. Infatti, le analisi del riarrangiamento dei geni delle catene IgH (LAL-B) e del TCR (LAL-T) hanno dimostrato un riarrangiamento identico e clonale nella maggior parte delle patologie linfoidi. Ai siti di giunzione dei segmenti genici VDJ, la delezione e l inserzione random di nucleotidi che avvengono durante il processo di riarrangiamento, determinano la formazione di regioni giunzionali altamente diversificate che contribuiscono significativamente al repertorio totale delle molecole delle Ig e del TCR, conferendo anche una specificità per ciascun paziente analizzato (van der Velden VHJ et al, Leukemia 2003; Cazzaniga G and Biondi A, Haematologica 2005). Oltre a quanto detto in merito alla caratterizzazione genetico-molecolare, è importante sottolineare quanto l introduzione delle tecniche di studio del profilo genico mediante microarrays abbia fornito nuove conoscenze nella caratterizzazione biologica delle leucemie (Haferlac T et al, Semin Hematol 2003). Tale analisi oltre che definire il profilo genico di ciascuna entità patologica è in grado di identificare la presenza di set genici che caratterizzano gruppi di pazienti diversi con altrettanto diverse risposte ai regimi chemioterapici svolgendo quindi un importante ruolo prognostico. Un esempio di ciò è rappresentato da quanto descritto in un recente lavoro (Chiaretti S et al, Haematologica 2010) in cui sono stati valutati i livelli di espressione del mir-223. Da tale analisi emergeva che il 10% circa dei pazienti affetti da LAL-T, mostravano un profilo di espressione genica simil-mieloide. Tra i geni di natura mieloide up-regolati, CEBPA, regolatore del mir-223, risultava altamente espresso. Dunque, poteva evidenziarsi una differenziale espressione di tale mir con una up-regolazione in quei casi con profilo simil-mieloide a dimostrazione del fatto che è possibile isolare specifici sottogruppi di pazienti con diverso comportamento biologico. 15

A questo punto, non è irrealistico immaginare come attraverso un attento studio dei patterns di espressione genica di ciascun paziente si possa arrivare ad identificare un profilo diagnostico, prognostico e terapeutico per ogni singola forma leucemica. Tabella 1: Classificazione immunologica delle LAL. LAL-B* (CD19+ e/o CD79a+ e /o CD22+) LAL pro-b CD10-/cIgM- LAL B-common CD10+/cIgM- LAL pre-b cigm+ LAL B-matura CD20+/Igκ+ oppure Igλ+ LAL-T (cy/s CD3+) LAL early-t LAL pro-t LAL pre-t (T-II) LAL-T corticale (T-III) LAL T-matura (T-IV) CD34+/cCD3+/CD4-/CD8-/CD5neg/low/Ag mielodi+ CD34+/cCD3+/CD4-/CD8- ccd3+/cd4 e/o CD8+/CD1acCD3+/CD1a+ scd3+/cd1a- * La maggior parte delle LAL-B, ad eccezione delle LAL B mature, mostra espressione dell antigene TdT. c= citoplasmatico; s= superficie; Ag= antigene 16

PROGETTO I: Identificazione citofluorimetrica della proteina Bcr/Abl nella leucemia acuta linfoblastica Raponi S, De Propris MS, Wai H, Intoppa S, Elia L, Diverio D, Vitale A, Foà R and Guarini A. An accurate and rapid flow cytometric diagnosis of BCR-ABL positive acute lymphoblastic leukemia. Haematologica 2009; 94 (12): 1767-70. 17

La traslocazione t(9;22)(q34;q11) e l importanza dell utilizzo dei farmaci inibitori delle tirosin-chinasi Oltre a caratterizzare più del 95% dei pazienti affetti da leucemia mieloide cronica, come già descritto la traslocazione t(9;22)(q34;q11) rappresenta la più frequente anomalia cromosomica nell ambito delle LAL dell età adulta con una frequenza complessiva del 30% circa e la tendenza ad incrementare con l eta fino a raggiungere percentuali del 50-60% nei pazienti con più di 50 anni di età (Szczepański T et al, Lancet Oncol 2010). Al contrario, risulta estremamente rara nell età pediatrica rappresentando meno del 5% delle LAL. E presente inoltre nel 2% circa delle leucemie acute mieloidi (Maekawa T et al, Int J Clin Oncol 2007) ed in circa il 6% delle LAL-T in un riarrangiamento variante t(9;9)(q34;q34) che determina la formazione del gene di fusione NUP214/ABL1 (Chiaretti S et al, Haematologica 2009). Ancor prima della identificazione genetica di tale traslocazione avvenuta solo nel 1973 (Rowley JD, Nature 1973), il cromosoma Philadelphia (Ph), così chiamato dal nome della città in cui furono condotti gli studi, era già stato identificato nel 1960 essere l evento scatenante lo sviluppo di forme di leucemia mieloide cronica (Nowell P and Hungerford D, Science 1960). Dieci anni più tardi giunse la scoperta del coivolgimento nella traslocazione del proto-oncogene c-abl, che rimosso dal cromosoma 9 veniva inserito in un gene allora sconosciuto e più tardi definito BCR (Breakpoint Cluster Region), formando un oncogene chimerico detto BCR/ABL in grado di generare una proteina chimerica che, in quanto costitutivamente attiva, mostrava alterata attività tirosin-chinasica (Bartram CR et al, Nature 1983). Numerosi modelli sperimentali dimostrarono successivamente che negli animali il trapianto di cellule staminali ematopoietiche trasdotte con il gene di fusione BCR/ABL generava l insorgenza di patologie CML-like (Daley GQ et al, Science 1990). La traslocazione reciproca t(9;22)(q34;q11) è conseguente alla rottura sul gene ABL in un punto unico ed interno ad una regione di più di 300 kilobasi e sul gene BCR a livello del quale la rottura può avvenire in 3 differenti regioni definite: major BCR (M-BCR), minor BCR (m-bcr) e micro BCR (µ-bcr). A seconda della regione coinvolta nella rottura a livello di BCR si potrà avere la formazione di differenti mrna che verranno successivamente tradotti in differenti tipi di proteina con diverso peso molecolare, rispettivamente P210, P190 e P230. La prima di queste caratterizza la maggior parte dei pazienti affetti da LMC ed un terzo circa dei pazienti con LAL Ph+, contrariamente alla proteina P190 che si ritrova nella maggior parte delle LAL ed in una piccola percentuale delle LMC ed alla P230 che caratterizza quelle rare forme di leucemia neutrofilica cronica Ph+. 18

Indipendentemente dalla tipologia di proteina che si forma, essa si presenta distribuita nel citoplasma legata all actina mediante il dominio C-terminale e con attività tirosin-kinasica costitutivamente attiva. Essa è in grado di alterare numerosi pathways di trasduzione del segnale con risultante de-regolazione a livello dei processi di proliferazione ed adesione cellulare nonche inibizione dei processi di apoptosi (Deininger MWN et al, Blood 2000; Piccaluga PP et al, Cancer 2007) (Figura 1). E inoltre descritto un quarto possibile meccanismo responsabile della trasformazione cellulare indotta da Bcr-Abl legato alla degradazione proteasoma-dipendente di proteine inibitorie della chinasi Abl (Deininger MWN et al, Blood 2000). Sostanzialmente la proteina Bcr-Abl agisce legando l adenosina trifosfato (ATP) e catalizzando il trasferimento di un gruppo fosfato al gruppo idrossilico presente sul residuo di tirosina a livello di fattori proteici partecipanti alle diverse cascate di trasduzione del segnale (Paul MK and Mukhopadhyay AK, Int J Med Sci 2004). La comprensione di tali meccanismi molecolari che sottendono alla trasformazione neoplastica nelle leucemie Ph+ ha permesso la realizzazione del primo ed efficace esempio di terapia molecolare mirata: l imatinib mesilato (Gleevec). Sintetizzato sulla base delle conoscenze della struttura del sito di legame con l ATP, esso sarebbe in grado di agire come inibitore competitivo dell attività enzimatica della proteina Bcr-Abl (TKI: tyrosine kinase inhibitor) (Buchdunger E et al, Cancer Res 1996). Tuttavia, studi sulla struttura cristallografica del dominio catalitico di Abl complessato con un omologo dell Imatinib, hanno dimostrato che il farmaco piuttosto che occupare la tasca di legame dell ATP, si lega alla proteina Bcr-Abl bloccandola in una conformazione inattiva. Essa, non legando ATP non sarebbe in grado di trasferire gruppi fosfato dall ATP ai substrati a valle con conseguente blocco dell attivazione delle rispettive vie di segnalazione (Schindler T et al, Science 2000). Studi clinici di fase I iniziati nel 1998, che prevedevano l utilizzo di Imatinib, dimostrarono una significativa attività antileucemica con una buona tollerabilità nei pazienti affetti da LMC, nei quali era fallito il trattamento convenzionale con IFN-α, permettendone l introduzione nell armamentario terapeutico per il trattamento dei pazienti affetti da LMC. Ciononostante, lo sviluppo di fenomeni di resistenza all utilizzo di tale farmaco indotta da differenti meccanismi, ha reso necessario lo sviluppo di altri composti che fossero attivi nei confronti di tali forme di resistenza per la maggior parte dei casi rappresentate da mutanti di BCR/ABL. Si sono così sviluppati, inibitori di Bcr-Abl cosiddetti di seconda generazione (Dasatinib, Nilotinib, Bosutinib, INNO-406) alcuni dei quali ancora in fase di sperimentazione pre-clinica, con attività molto più potente dell Imatinib nell inibire l attività chinasica di Bcr-Abl. Ciò è stato dimostrato in linee cellulari positive per Bcr-Abl in forma wild-type ed in molti dei mutanti, eccetto che nel mutante T315I (mutante che presenta sostituizione amminoacidica di treonina con isoleucina in posizione 315) (Weisberg E et al, Cancer Cell 2005) per il quale risultava già 19

inefficace il trattamento con Imatinib a causa della ridotta affinità del farmaco per il dominio catalitico di Abl dovuta alla sostituzione amminoacidica. Considerata dunque l incapacità dei farmaci di prima e seconda generazione di neutralizzare la resistenza dovuta alla presenza della mutazione puntiforme T315I, sono stati sviluppati farmaci inibitori della chinasi Bcr-Abl di terza generazione, ad oggi valutati però solo in fase pre-clinica, che risulterebbero in grado di agire su cellule che presentano tale mutazione. Un esempio è rappresentato dagli inibitori delle Aurora chinasi che si sono mostrati estremamente efficaci in studi di fase I e II e quando utilizzati in combinazione con Dasatinib, come a suggerire l efficacia di un trattamento combinato nei casi con cloni resistenti a trattamenti di prima linea (Martinelli G et al, Best Pract Res Clin Haematol 2009). Altra molecola appartenente al gruppo degli inibitori di terza generazione è rappresentata dal Ponatinib (AP24534) dimostratosi in grado di inibire i processi di autofosforilazione sia delle forme wilde-type che dei mutanti T315I (Santos FP, et al, Curr Hematol Malig Rep 2011). Dunque alla luce di quanto detto, la valutazione dello stato mutazionale di un paziente che abbia una risposta sub-ottimale ad uno specifico trattamento con TKIs o che addirittura manifesti evidenza di resistenza, sta via via entrando nella pratica clinica considerato il suo prezioso contributo per una più razionale ed appropriata gestione terapeutica ddi tali pazienti. In un più ampio contesto, l identificazione della presenza di tale traslocazione cromosomica ed ancor più della proteina di fusione da essa derivante, fornisce una possibilità terapeutica aggiuntiva in specifiche categorie di pazienti. 20

SCOPO DELLO STUDIO L utilizzo dei farmaci TKIs, ha profondamente modificato il management non solo dei pazienti affetti da LMC ma anche l outcome dei casi con LAL Ph+ in maniera pressoché indipendente dall età (Ravandi F and Kebriaei P, Hematol Oncol Clin North Am 2009; Schultz KR et al, J Clin Oncol 2009; Foa R et al, Blood 2011). Considerata la frequenza di tale anomalia cromosomica nell ambito delle LAL ed in particolare in quelle dell adulto, unitamente alla possibilità di riservare un trattamento terapeutico specifico per questa categoria di pazienti, fino a qualche anno fa considerata a prognosi estremamente sfavorevole, risulta necessaria una rapida identificazione dei casi Ph+ in fase di esordio di malattia. Attualmente, l identificazione di tale lesione genetica viene eseguita attraverso l utilizzo di metodiche di Q-RT-PCR (Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction), citogenetica convenzionale ed analisi FISH. La necessità di avere a disposizione laboratori altamente specializzati per l esecuzione di tali metodiche che necessitano, in alcuni casi, di tempi di esecuzione molto lunghi, ha suggerito la messa a punto di un dosaggio citofluorimetrico che permetta una più rapida identificazione dell oncoproteina di fusione Bcr-Abl nel campione in esame. Sulla base di ciò, lo scopo di questo studio è stato quello di testare la validità di un innovativo dosaggio citofluorimetrico - il Cytometric Bead Assay (CBA) - su una casistica di 101 pazienti affetti da leucemia acuta valutati in maniera consecutiva all esordio di malattia. L intento e stato quello di valutarne applicabilià, specificità e rapidità di esecuzione confrontando i risultati ottenuti con quelli relativi alla valutazione mediante tecniche di biologia molecolare della presenza del gene di fusione BCR/ABL, eseguita in tutti i pazienti presi in considerazione 21

MATERIALI E METODI Pazienti e caratterizzazione della malattia La valutazione della presenza della proteina di fusione Bcr-Abl è stata eseguita in 101 campioni afferenti consecutivamente alla Divisione di Ematologia del Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia della Sapienza di Roma. Di questi campioni, tutti lavorati a fresco ed entro le 24 ore dal prelievo, 81 provenivano da sangue midollare e 20 da sangue venoso periferico. Sono stati valutati 91 pazienti adulti e 10 bambini con una eta mediana di 45 anni (range: 1-81) ed un rapporto maschi/femmine di 59/42. La diagnosi di leucemia acuta e stata stabilita in accordo con i criteri morfologici, citochimici ed immunologici stabiliti dalla classificazione FAB e WHO. Per quanto riguarda la diagnosi immunofenotipica, i campioni di sangue midollare e sangue periferico sono stati incubati con diverse combinazioni costituite da differenti anticorpi coniugati con i fluorocromi FITC (fluorescin isothiocyanate), PE (phycoerythrin), PerCP (peridin-clorophyll protein), APC (allophycocyanin) e diretti verso i seguenti antigeni di superficie: CD1a, CD10 (Dako, Glostrup, Denmark), CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD19, CD20, CD34, CD38, CD45, CD56 (BD, Biosciences, San Jose, CA), CD7, CD33, CD65, CD66c, CD117 (Immunotech Coulter Company, Marseille, France), CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). In aggiunta a questi, altri anticorpi sono stati utilizzati per identificare antigeni citoplasmatici quali MPO, CD3, CD79a (Dako), IgM (Southern Biotech, Birmingham, AL) ed antigeni nucleari quali la TdT (deossinucleotidil trasferasi terminale) (Dako). Dei 101 pazienti analizzati, 89 si presentavano in fase di esordio di malattia. Sulla base della caratterizzazione immunofenotipica essi potevano ulteriormente dividersi in: 53 casi di LAL-B (8 pro-b, 38 B-common e 7 pre-b), 5 LAL-T, 30 casi di LAM ed 1 caso di MPAL. Sono stati inoltre valutati 5 casi in recidiva di malattia (1 caso di LAL-T, 3 LAL B-common ed 1 caso di LAM) e 7 casi in fase di crisi blastica di LMC (4 LAL-B e 3 LAM). Come controllo ed a conferma dei risultati ottenuti dal saggio citofluorimetrico, tutti i pazienti analizzati per la presenza della proteina di fusione Bcr-Abl, sono stati studiati in doppio anche tramite analisi molecolare allo scopo di identificare la presenza del rispettivo gene di fusione o di altri geni mediante RT-PCR (Elia L et al, Haematologica 2003). Nell ambito dei pazienti con diagnosi di LAL, l analisi molecolare identificava la presenza dei seguenti trascritti di fusione: 32 casi di BCR/ABL (19 casi p190, 4 casi p210 e 9 casi p190/p210), 3 casi di MLL/AF4, 2 casi di MLL/ENL, 2 casi di E2A/PBX1 ed un caso con presenza del gene di fusione SIL/TAL1. Tra i casi 22

con diagnosi di LAM, in 6 si evidenziava la presenza del gene di fusione PML/RARα ed 1 caso risultava positivo al gene NUMA/ RARα. 23

Il saggio CBA (Cytometric Bead Assay) Il Cytometric Bead Assay (CBA) rappresenta un saggio citofluorimetrico che, mediante il BCR/ABL Protein Kit (BD Biosciences), è in grado di identificare qualitativamente la presenza della proteina di fusione Bcr-Abl nei lisati di sangue midollare o periferico intero prelevato da pazienti affetti da forme leucemiche recanti tale alterazione genetica. Il test permette il riconoscimento di tutte le varianti della proteina di fusione Bcr-Abl in quanto gli anticorpi anti-bcr ed anti-abl utilizzati riconoscono epitopi localizzati rispettivamente al 5 della regione m-bcr e a valle della regione di rottura sul gene ABL. Esso può inoltre essere eseguito anche dopo aver effettuato una separazione delle cellule su gradiente di densità (Ficoll); la procedura migliore è però risultata quella eseguita su sangue intero soprattutto in presenza di una scarsa quantità di materiale processabile. Lavorando su campione intero il protocollo prevede una lisi cellulare che permette il rilascio nella sospensione cellulare della proteina di fusione che viene a sua volta riconosciuta e captata da un anticorpo anti-bcr coniugato ad una biglia e successivamente da un anticorpo anti-abl coniugato con il fluorocromo PE (Weerkamp F et al, Leukemia 2009). Si formerebbe in questo modo un complesso proteina-biglie-anticorpo PE-coniugato identificabile mediante lettura al citofluorimetro (Figura 2). Lisati cellulari ottenuti da sangue venoso periferico di donatori sani e dalla linea cellulare K562, quest ultima positiva alla proteina P210, sono stati utilizzati rispettivamente come controlli negativi e positivi. La presenza delle proteine Bcr ed Abl normali non dà luogo ad alcun segnale di fluorescenza. In accordo con le istruzioni indicate dalla ditta produttrice, è necessario incubare 1-2 ml di sangue intero o midollo osseo contenenti circa 25x10 6 cellule totali con 50 ml di soluzione lisante 1X BD Pharm Lyse (BD Biosciences) per 10 minuti a temperatura ambiente, affinchèci sia la lisi dei globuli rossi presenti. Successivamente a due lavaggi effettuati con PBS al 5% in FBS, le cellule vengono pre-trattate utilizzando 250 ul di Pretreatment Buffer ottenuto diluendo il Pretreatment A 1X ed il Pretreatment B 1X (BD Biosciences) ed incubate in ghiaccio per 10 minuti. In questo modo ha luogo un iniziale processo di rallentamento dell attivita delle proteasi contenute nei granuli cellulari. A cio segue un lavaggio in PBS al 5% in FBS ed una successiva incubazione per 15 minuti con 100 ul di un cocktail di inibitori delle proteasi, BD Lysate Treatment Reagent 1X (BD Biosciences). Tale trattamento risulta necessario continuare l azione del Pretratment Buffer evitando il clivaggio proteico ad opera delle proteasi contenute nei granuli delle cellule mieloidi residue che rilasciate nel surnatante in seguito al trattamento del campione con soluzione lisante i globuli rossi, potrebbero interferire con l identificazione della presenza della proteina di fusione 24

Bcr-Abl nei lisati cellulari. A questo punto le cellule vengono centrifugate ad elevata velocità (20,000 g) per 10 minuti a +4 o C. L elevata velocità in questo caso permetterebbe una totale sedimentazione delle cellule e dei detriti cellulari, che potrebbero altrimenti interferire con la reazione antigene-anticorpo, con l ottenimento di un surnatante appropriato per poter procedere alla determinazione della presenza della proteina di fusione. Eliminato il pellet, si effettua una incubazione di 2 ore con 50 ul di lisato cellulare con altrettanto quantitativo dell anticorpo anti-bcr biglia-coniugato (BD Biosciences) e dell anticorpo anti-abl PE-coniugato (BD Biosciences). Al termine dell incubazione dopo lavaggio con CBA Wash Buffer (BD Biosciences) i campioni vengono acquisiti utilizzando il citofluorimetro FACSCanto (BD Biosciences) ed analizzati con il software FACSDiva (versione 6.0) previo settaggio strumentale con le apposite biglie Cytometer Setup and Tracking (CS&T) in accordo con quanto indicato nelle istruzioni operative (BD Biosciences). Per ciascun campione valutato, la determinazione citofluorimetrica veniva eseguita in parallelo anche su un campione di sangue venoso periferico normale (controllo negativo) ed un campione di linea cellulare K562 (controllo positivo) a conferma che il risultato ottenuto, sia esso positivo o negativo, non fosse influenzato da alcuna variabilità procedurale e/o strumentale. 25

Analisi citofluorimetrica della proteina Bcr/Abl Il dosaggio CBA consente una identificazione qualitativa della proteina di fusione Bcr-Abl senza permetterne una esatta quantizzazione. Esso fornisce un risultato positivo o negativo a cui corrisponderà un ben preciso segnale di fluorescenza derivante dall utilizzo dell anticorpo anti-abl PE-coniugato. Tale segnale è associabile ad un valore di MFI che verrà poi relazionato ai valori di MFI ottenuti dai controlli negativi e positivi analizzati (Figura 3). L assenza della proteina di fusione e stata definita utilizzando un cut-off di laboratorio pari al valore medio ± 2DS dei valori di MFI emessi dal fluorocromo PE coniugato all anticorpo anti-abl, ottenuto in seguito all esecuzione del saggio su 20 campioni di sangue venoso periferico ottenuti da donatori sani. Ciò risulta estremamente importante in quanto nonostante nella maggior parte dei casi analizzati si e registrato un segnale citofluorimetrico di netta positività o negatività, il cut-off di riferimento è risultato estremamente utile nella definizione dei casi border line e nella identificazione del livello di sensibilità del metodo. Sulla base di ciò sono stati considerati positivi tutti quei casi che mostravano un valore di MFI superiore a 124±16 con una sensibilità pari al 10% e la disponibilità di almeno 25x10 6 cellule totali. 26

RISULTATI L analisi citofluorimetrica mediante CBA della proteina di fusione Bcr-Abl eseguita su 101 campioni ha evidenziato un segnale di positività in 30 casi (29.7%) di cui 24/30 valutati da campioni di sangue midollare e 6/30 da campioni di sangue venoso periferico. Considerando il valore mediano del numero di cellule leucemiche presenti in tali campioni esso risultava essere pari a 17.6x10 6 (range: 0.82-23.7) con un valore mediano di MFI che in questo gruppo di pazienti risultava pari a 6326 (range: 255-27291). La caratterizzazione immmunofenotipica della malattia ha permesso di evidenziare tra questi 30 campioni positivi al CBA, 23 casi di LAL-B e 7 casi in fase di crisi blastica di LMC. All analisi molecolare mediante RT-PCR, che forniva risultato positivo in tutti i casi risultati positivi al saggio CBA, i campioni analizzati mostravano la presenza di differenti tipologie di trascritto (P190, P210 e P190/P210) ad eccezione del trascritto relativo alla proteina P230 (Tabella 1). In due dei casi risultati positivi all analisi molecolare per la presenza del gene di fusione BCR/ABL (P190), entrambi LAL B-common, il saggio CBA risultava essere negativo. Infatti, considerando il cut-off di riferimento per i valori di MFI che risultava pari a 124±16, in questi due campioni si evidenziavano valori di MFI rispettivamente di 81 ed 87, ovvero nettamente inferiori al valore di riferimento. Tali risultati discordanti risultavano dipendenti dalle cellule leucemiche a disposizione per l analisi citofluorimetrica che risultavano pari a 5.9x10 5 in un caso e 5.1x10 5 nell altro, ovvero valori notevolmente inferiori al limite di sensibilità, (pari a 2.5x10 6 cellule patologiche) descritta per questo test. Entrambi i pazienti al momento dello studio risultavano però in trattamento con farmaci steroidei. Altri due casi, positivi all analisi molecolare per la presenza del gene di fusione sono stati valutati in concomitanza del trattamento steroideo. Essi risultavano però positivi al saggio CBA, con valori di MFI pari a 436 e 221 e con un numero di cellule totali ed una percentuale di cellule leucemiche superiori al limite di sensibilità del metodo. In tre dei casi risultati positivi al CBA per la presenza della proteina di fusione, il dosaggio è stato ripetuto dopo conservazione del campione a temperatura ambiente rispettivamente per 48 e 96h. In questi casi l analisi citofluorimetrica ha evidenziato un risultato comunque positivo anche se con una lieve diminuzione dei livelli di intensità di fluorescenza e quindi inferiori valori di MFI rispetto al campione valutato entro le 24h dal prelievo (Figura 4). Simili risultati sono stati ottenuti eseguendo il test su lisati cellulari criopreservati a -80 o C e valutati dopo 4, 18 e 22 giorni dal congelamento. Dei 101 casi analizzati, 71/101 (70.3%) sono risultati negativi al test CBA, 51/71 valutati da prelievo eseguito su sangue midollare e 14/71 da sangue venoso periferico. Il valore mediano del 27

numero di cellule leucemiche presenti in questo gruppo di pazienti era pari a 17.5x10 6 (range: 0.51-24.5) mentre il valore mediano di MFI risultava pari a 88 (range: 67-106). All analisi immunofenotipica questi pazienti si dividevano come segue: 32 LAL-B, 5 LAL-T, 30 LAM, un caso di MPAL e tre casi valutati in recidiva di malattia (1 LAL B-common, 1 LAL T ed una LAM) (Tabella 1). Nell ambito dei 32 casi di LAL-B, 5 mostravano un immunofenotipo pro-b e di questi all analisi molecolare 3 risultavano positivi per il gene di fusione MLL/AF4 e 2 per il gene MLL/ENL. Analogamente, dei 30 casi di LAM presi in considerazione, l analisi molecolare evidenziava 6 casi con trascritto PML/RARα ed un caso con trascritto NUMA/RARα. 28

DISCUSSIONE Le LAL rappresentano la più frequente neoplasia dell età pediatrica costituendo circa l 80% di tutte le leucemie acute del bambino (Pui CH et al, Lancet 2008). Esse risultano invece più rare in età adulta, con una frequenza complessiva del 20% (Jabbour EJ et al, Mayo Clin Proc 2005) e la tendenza ad un incremento intorno ai 50 anni di età. E ormai ampiamente descritta la frequenza della anomalia cromosomica t(9;22)(q34;q11) nell ambito di tale forma leucemica, così come il suo incremento con l avanzare dell età. Le nuove acquisizioni ottenute in campo terapeutico, hanno permesso un netto miglioramento della prognosi associata ai casi presentanti tale aberrazione, prima caratterizzati da scarse possibilità di guarigione. L avvento dei farmaci inibitori delle tirosin-chinasi (TKIs) di prima e seconda generazione, nonchè sperimentazioni pre-cliniche in atto per quelli di terza generazione, oltre che modificare drasticamente la storia naturale della LMC, ha profondamente migliorato l outcome dei pazienti affetti da LAL Ph+ (Ottmann OG et al, Blood 2002; Ottmann OG et al, Blood 2007; Vignetti M et al, Blood 2007, Foà R et al, Blood 2011). Le metodologie ad oggi disponibili ed utilizzate per definire biologicamente questa categoria di pazienti, sono rappresentate dall analisi mediante FISH della presenza del cromosoma Ph e quindi della traslocazione e dall identificazione del gene di fusione BCR/ABL mediante metodiche di Q- RT-PCR con la possibilità di quantizzare esattamente il numero esatto di copie di mrna presenti nel campione in esame. Tali metodologie però, oltre a necessitare di strutture laboratoristiche specializzate richiedono anche un dispendio temporale di non poco rilievo nella fase di definizione diagnostica di un paziente affetto da LAL, laddove la tempestiva identificazione di tale traslocazione risulta essere estremamente importante se si considera la possibilità di poter utilizzare farmaci specifici, meno invasivi e con ottimi risultati rispetto ai chemioterapici convenzionali. Per questo motivo è andata via via emergendo la necessità di avere a disposizione un metodo più semplice e soprattutto più rapido per l identificazione della presenza della proteina di fusione derivante da tale traslocazione. In questo contesto l introduzione del saggio citofluorimetrico CBA, ha rappresentato un notevole progresso in quanto in grado di identificare la presenza della proteina di fusione Bcr-Abl che, a causa dell elevato peso molecolare e della sua estrema instabilità non potrebbe altrimenti essere indagata con le convenzionali metodologie per l analisi proteica. L identificazione proteica in questo contesto rappresenta un concetto estremamente importante in quanto la sua presenza documenta l effettiva traduzione del trascritto chimerico oltre a rappresentare il reale ed effettivo bersaglio dei farmaci TKIs. 29

Immediatamente successivo alla pubblicazione di Weerkamp e colleghi (Weerkamp F et al, Leukemia 2009), questo rappresenta il primo studio condotto su un ampia serie di casi affetti da leucemia acuta. I risultati mostrano una elevata specificità di questo metodo nella identificazione della proteina di fusione. E stata infatti dimostrata una assoluta correlazione tra la presenza/assenza di proteina e la positività/negatività del gene di fusione all analisi molecolare. A conferma di ciò sono stati inclusi nello studio anche casi che all analisi molecolare risultavano positivi per altri geni di fusione noti, con l ottenimento di risultati senza dubbio negativi al test CBA. Al contrario, tutti i casi risultati positivi all analisi molecolare per la presenza del gene di fusione BCR/ABL lo erano anche all analisi citofluorimetrica. Nell insieme questo dosaggio proteico si è dimostrato estremamente fattibile, con risultati riproducibili ed in particolar modo di semplice esecuzione. Esso è risultato rapido, con risultati ottenibili in 3-4 ore di lavoro e con la possibilità di essere facilmente integrato nell ambito dell inquadramento diagnostico di un paziente affetto da LAL. Inoltre, i risultati ottenuti in seguito ad esecuzione del test dopo 48 e 96 ore dal prelievo del campione e dopo congelamento per diversi giorni a -80 o C hanno dimostrato la fattibilità del test anche dopo qualche giorno dal prelievo, senza importanti differenze in termini di segnale di fluorescenza rispetto al test eseguito entro 24 ore e soprattutto con persistenza dei criteri di specificità. Ad ogni modo, in merito alla valutazione proteica dopo congelamento del materiale, risulta cruciale la lavorazione immediata del campione dopo scongelamento per evitare che il rilascio delle proteasi dai granuli dei neutrofili residui che durante il processo di congelamento vanno incontro a rottura, possa interferire con la determinazione citofluorimetrica (Lucas CM et al, Haematologica 2011). I risultati di questo studio sono in accordo con quanto descritto da Weerkamp e colleghi (Weerkamp F et al, Leukemia 2009) eccetto che per quel che riguarda la sensibilità del metodo. In realtà, il valore di sensibilità del test resta tuttora un concetto abbastanza dibattuto e con risultati spesso tra loro contrastanti. Fondamentalmente, tutti gli studi eseguiti utilizzando questo nuovo test citofluorimetrico, riportano livelli di sensibilità con riferimento ad esperimenti condotti su linee cellulari con valori che vengono poi trasferiti al dosaggio eseguito sui campioni provenienti da pazienti (Weerkamp et al, Leukemia 2009; Yujie W et al, Leuk Lymphoma 2012). In altri casi poi si fa riferimento solo al limite di cellule totali necessarie senza alcun riferimento a numero o percentuale di cellule patologiche presenti (Lucas CM et al, Haematologica 2011), concetto invece estremamente importante in quanto, anche se raramente, è possibile avere una bassa conta di blasti in esordio di malattia. Inoltre, in merito al concetto di sensibilità sulle linee cellulari, difficilmente risulta possibile esportare i valori ottenuti, allo stesso test eseguito sui pazienti. E noto, infatti, il differente comportamento delle linee cellulari rispetto ai campioni di cellule leucemiche primarie 30

considerato il valore maggiore di numero di copie di mrna BCR/ABL per cellula. A conferma di ciò, dalla nostra esperienza è emerso che, seppur riscontrando valori di sensibilità per la K562 pari all 1% e sovrapponibili quindi a quanto riportato in letteratura, lo stesso non poteva dirsi quando il test veniva eseguito sui campioni di cellule leucemiche ottenute dai pazienti. In due pazienti in trattamento con steroidi e con un numero di cellule leucemiche pari a 5.9x10 5 e 5.1x10 5, ovvero con valori inferiori al limite di sensibilità del metodo, positivi all analisi molecolare per il gene di fusione BCR/ABL, il test CBA risultava negativo. Allo scopo di indagare in merito alla possibilità che il trattamento steroideo potesse interferire direttamente con la corretta identificazione della presenza della proteina di fusione Bcr-Abl nei lisati cellulari, il test CBA è stato eseguito in altri due casi, ugualmente positivi all analisi molecolare, in trattamento steroideo, ma con una adeguata conta di cellule leucemiche: il test CBA forniva risultati positivi per la presenza della proteina di fusione. Ciò a suggerire che piuttosto che l assenza di trattamento steroideo al momento dello studio, risulta estremamente importante la disponibilità di un adeguato numero di cellule per l ottenimento di risultati attendibili e concordi con quanto riscontrato all analisi molecolare. Ciononostante, in un unico caso nell ambito dei 101 campioni analizzati in questo lavoro, è stata riscontrata positività della proteina di fusione anche in presenza di un numero di cellule leucemiche inferiore al limite di sensibilità descritto e pari a 2.5x10 6. La sporadicità di tale risultato ha reso però impossibile considerare valori < 2.5x10 6 come cut-off di riferimento per la sensibilità del test. Rimanendo nel contesto della sensibilità del metodo, in un lavoro recentemente pubblicato (D Alessio F et al, Leuk Res 2011), viene proposta la possibilità di eseguire un miniaturized CBA, da loro condotto su campioni di liquido cerebro-spinale di pazienti Ph+ che mostravano coinvolgimento del sistema nervoso centrale. Tale studio dimostra come sia possibile individuare la presenza della proteina di fusione Bcr-Abl anche in presenza di una bassissima conta cellulare mediante modificazione dei quantitativi di anticorpi anti-bcr ed anti-abl in rapporto alla cellularità del campione con l ottenimento di risultati di positività in corrispondenza di un numero di cellule 178 volte inferiore al limite necessario per l utilizzo del BCR/ABL Protein Kit (BD Biosciences) (2.5x10 6 cellule leucemiche). Nonostante la rarità con cui ci si trova di fronte ad un così basso numero di cellule quando si analizzano campioni provenienti da pazienti in fase di esordio di malattia e senza alcun trattamento farmacologico, in linea teorica, i risultati ottenuti da questo studio potrebbero suggerire la possibilità di utilizzare il test opportunamente modificato in presenza di basse conte cellulari ed ancor più nelle fasi di valutazione della malattia minima residua. Ad ogni modo, nonostante i limiti di sensibilità, questo metodo permette una rapida identificazione di tutte le varianti della proteina di fusione Bcr-Abl (P190, P210, P190/P210) fornendo importanti 31

informazioni in merito alla possibilità di utilizzare terapie molecolari mirate volte ad inibire l attività chinasica di tale proteina. Alla luce degli entusiasmanti risultati ottenuti in seguito a trattamento dei pazienti Ph+ con farmaci TKIs (Vignetti M et al, Blood 2007; Ottmann OG et al, Cancer 2007, Foà R et al, Blood 2011), tutto ciò potrebbe rappresentare in primo luogo un aspetto di primaria importanza in particolare in quelle regioni geografiche che mancano della disponibilità di laboratori specializzati di biologia molecolare o che presentano una organizzazione tale da non permettere l ottenimento dei risultati di biologia molecolare in tempi utili per l inizio del trattamento con farmaci mirati. Infatti, previa identificazione della presenza della proteina di fusione Bcr-Abl, con l utilizzo di tali farmaci, è possibile ottenere potenzialmente in tutti i pazienti, senza alcun limite di età, siano essi di nuova diagnosi o in recidiva di malattia, il raggiungimento di una completa remissione ematologica senza chemioterapia, con una terapia per via orale e pressochè senza necessità di ospedalizzazione, condizioni queste estremamente importanti se si considera l elevata frequenza dei casi di LAL Ph+ dopo i 60 anni di età (Szczepanski T et al, Lancet Oncol 2010). Il futuro di tutto quanto detto si sta dirigendo verso il tentativo di incrementare i livelli di sensibilità tale da permettere l utilizzo di questo dosaggio nell ambito del monitoraggio della MMR dei pazienti affetti da LAL Ph+. Infine, i risultati ottenuti in seguito all utilizzo del metodo CBA per l identificazione della proteina di fusione Bcr-Abl, hanno reso possibile applicare il razionale alla base del disegno di tale saggio, per l identificazione citofluorimetrica di altre proteine derivanti da geni di fusione di cruciale importanza prognostica nell ambito di differenti patologie ematologiche (Dekking E et al, Best Pract Res Clin Haematol 2010). 32

Figura 1: Interazioni cellulari della proteina di fusione brc-abl. La sua alterata attività tirosinchinasica può determinare trasformazione cellulare principalmente attraverso tre meccanismi: alterata adesione cellulare (dovuta a fosforilazione di proteine del citoscheletro), attivazione mitogena (mediante attivazione dei pathways delle MAP chinasi) ed inibizione dei processi di apoptosi (mediante il pathway PI3K/AKT) (Deininger MWN et al, Blood 2000). 33

Fugura 2: Principio del saggio CBA. Figura 3: Modalità di espressione del segnale di positività o negatività del campione al saggio citofluorimetrico CBA. 34

Tabella 1: Confronto dei risultati ottenuti dal saggio citofluorimetrico con quelli ottenuti mediante analisi di biologia molecolare. Campioni valutati (n=101) Bcr-Abl (CBA) BCR/ABL (PCR) Casi Casi Casi p190 p210 p190/p210 negativi positivi negativi LAL B-common (n=38) 21 * 17 19 * 14 2 3 LAL B (n=56) LAL pre-b (n=7) 5 2 5 0 1 1 LAL pro-b (n=8) 6 2 6 2 0 0 Recidive di LAL-B common (n=3) 1 2 1 2 0 0 LAL-T (n=6) Diagnosi (n=5) 5 0 5 0 0 0 Recidive (n=1) 1 0 1 0 0 0 LAM (n=31) Diagnosi (n=30) 30 0 30 0 0 0 Recidive (n=1) 1 0 1 0 0 0 Leucemie acute bi-fenotipiche (n=1) 1 0 1 0 0 0 Crisi blastiche di LMC (n=7) LAL-B (n=4) 0 4 0 0 1 3 Mieloidi (n=3) 0 3 0 1 0 2 * Campioni negativi al test CBA contenenti solo 5.9x10 5 e 5.1x10 5 cellule leucemiche e provenienti da pazienti in trattamento steroideo al momento dello studio. 35

Figura 4: Confronto dei risultati ottenuti in due differenti pazienti con LAL B common P190 positivi in seguito ad esecuzione del test citofluorimetrico a fresco e dopo 48 e 96 ore dal prelievo. 36

PROGETTO II: Analisi citofluorimetrica di antigeni target di terapia con anticorpi monoclonali: un esperienza di 552 casi di leucemia acuta linfoblastica valutati in fasi di diagnosi Raponi S, Stefania De Propris M, Intoppa S, Laura Milani M, Vitale A, Elia L, Perbellini O, Pizzolo G, Foá R, Guarini A. Flow cytometric study of potential target antigens (CD19, CD20, CD22, CD33) for antibody-based immunotherapy in acute lymphoblastic leukemia: analysis of 552 cases. Leukemia & Lymphoma 2011; 52(6):1098-107. 37

L importanza dell intensità di espressione antigenica nelle LAL Come già precedentemente introdotto, l analisi immunofenotipica insieme alla valutazione citomorfologica ed alle analisi genetico-molecolari, svolge un importante ruolo nel contesto dell inquadramento diagnostico delle LAL non solo per quanto concerne la caratterizzazione della patologia ma anche per la definizione di fattori prognostici con rilevanti risvolti in campo terapeutico (Vitale A et al, Curr Opin Oncol 2006; Gokbuget N and Hoelzer D, Rev in Clin Exp Hematol 2002). Il sempre crescente numero di anticorpi monoclonali (AcMo) ad oggi disponibili per lo studio immunofenotipico di cellule emopoietiche insieme alla possibilità di combinare tra loro differenti markers cellulari in un ampio pannello anticorpale, permette, infatti, una esatta distinzione dei differenti stadi maturativi della cellula nonchè l identificazione di importanti aberrazioni fenotipiche presenti nel campione in esame (Benè MC, Immunol Letters 2005). Oltre a ciò un importante aspetto da considerare nel contesto delle potenzialità della caratterizzazione immunofenotipica delle cellule leucemiche, è il ruolo che essa svolge nella identificazione dei differenti livelli di espressione con i quali uno specifico antigene è presente a livello cellulare. Oltre che produrre misure percentuali che ne definiscono la presenza è infatti possibile, attraverso l analisi citometrica, valutare le modalità di espressione antigenica, indice dei differenti stadi differenziativi e funzionali delle cellule. Quest ultimo aspetto è ormai divenuto ampiamente utilizzato, fino quasi a sostituire le modalità di espressione sotto forma di percentuale, in particolare grazie al tentativo che è stato fatto di fornire valide raccomandazioni metodologiche (2006 Bethesda International Consensus Recommendations) che avessero lo scopo di standardizzare il più possibile le modalità con cui esprimere la presenza di un antigene, rendendo i dati sempre più riproducibili in contesti laboratoristici differenti (Wood BL et al, Cytometry 2007). L espressione antigenica a livello cellulare può essere oggi definita in maniera qualitativa o quantitativa attraverso la valutazione di due parametri citofluorimetrici: rispettivamente la MFI e l ABC. Il primo di questi rappresenta un parametro derivante dal calcolo strumentale del valore medio del segnale di fluorescenza emesso dall anticorpo fluorocromo-coniugato dopo riconoscimento e legame con il rispettivo antigene all interno della popolazione cellulare in esame. Una più precisa quantizzazione dell espressione antigenica si può ottenere valutando l ABC, ovvero la capacità di legame anticorpale. Attraverso l utilizzo di un sistema QuantiBRITE (BD) basato sulla misurazione della fluorescenza del fluorocromo PE (phycoerythrin) coniugato all anticorpo è possibile definire il numero esatto di siti antigenici per un dato antigene presente sulla superficie cellulare. L utilizzo di tali parametri diventa particolarmente utile ed importante nei casi in cui l espressione antigenica non risulta bimodale - con la possibilità cioè di identificare, con valori percentuali ben 38

precisi, due popolazioni nette, l una positiva l altra negativa - ma unimodale ovvero caratterizzata dall assenza del picco dei negativi che si confondono con le cellule positive. In questo contesto la differenza tra un caso e l altro è data piuttosto che dalla percentuale di positività antigenica - difficile da stabilire per la necessità di posizionare in maniera alquanto arbitraria un left che definisca la regione positiva - dai differenti livelli di espressione antigenica (MFI e ABC). Tutto l interesse che ruota attorno alla possibilità di quantizzare le modalità con cui un antigene viene espresso a livello cellulare, deriva oltre che dall importanza che essa ricopre nella distinzione delle cellule normali da quelle patologiche e nell identificazione dei differenti sottotipi immunologici di LAL, anche dalle implicazioni prognostiche e terapeutiche che ne derivano grazie allo sviluppo di AcMo per utilizzo clinico nel trattamento di un numero sempre maggiore di patologie onco-ematologiche (Thomas DA et al, Blood 2009). Infatti, lo sviluppo di AcMo che riconoscono specifici antigeni cellulari permette oggi di attuare una vera e propria target therapy applicabile nel contesto di svariate patologie ematologiche e non. Molti degli antigeni per i quali si sono sviluppati AcMo specifici, svolgono importanti ruoli a livello cellulare essendo spesso coinvolti nei pathways di trasduzione del segnale o nei meccanismi di trasporto ionico all interno della cellula. La modulazione di tali processi indotta dall utilizzo dello specifico AcMo, determinerebbe un blocco o una de-regolazione dei pathways di sopravvivenza cellulare che unitamente all intervento dei meccanismi immunologici di ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) e CDC (complement-dependent cytotoxicity) sarebbe in grado di indurre morte cellulare programmata a livello delle cellule patologiche (Cartron G et al, Blood 2004; Castillo J et al, Exp Hematol 2008) (Figura 1). Ad oggi, gli AcMo disponibili possono essere utilizzati: i) da soli come agenti singoli ovvero in forma non coniugata (come ad esempio l AcMo anti-cd20, Rituximab); ii) coniugati con immunotossine o agenti chemioterapici che grazie all AcMo possono essere internalizzati a livello cellulare (come ad esempio il l AcMo anti-cd33, Gemtuzumab Ozogamicin); iii) coniugati a molecole radioattive con l intento di consentire un trasporto selettivo della radioattività alle cellule patologiche esprimenti quel determinato antigene; iv) come anticorpi bi-specifici, ovvero caratterizzati da una duplice specificità legata al fatto che essi possono riconoscere due antigeni target oppure indurre l attività delle cellule immunologicamente attive nei confronti delle cellule leucemiche (Gokbuget N and Hoelzer N, Best Pract Res Clin Haematol 2006). Indipendentemente dalla tipologia di AcMo utilizzata, l utilizzo di tale forma di terapia mirata ha come obiettivo principale la riduzione della tossicità indotta da chemioterapia nonchè l incremento dell efficacia terapeutica in quei sottogruppi di pazienti eleggibili per tali terapie (Kuriakose P, Cancer 2005). Esse sono di particolare interesse nei casi in cui risulta praticamente impossibile l intensificazione 39

dei regimi chemioterapici convenzionali, come si verifica spesso nei pazienti più anziani o nei casi in cui il clone leucemico risulta estremamente resistente al trattamento con farmaci citostatici. Nel contesto delle LAL tutto quanto detto trova applicazione grazie al fatto che esse sono caratterizzate dall espressione di antigeni per i quali sono disponibili specifici AcMo quali il CD19, CD20, CD22 e CD33. Seppure ancora nelle prime fasi di sperimentazione clinica (Schindler J et al, Br J Haematol 2011), si sono sviluppate negli anni diverse tipologie di AcMo anti-cd19 che risultano per lo più coniugati con immunotossine (Gokbuget N and Hoelzer D, Ann Hematol 2004). Tra questi, il Blinatumomab, anticorpo bi-specifico anti-cd19/anti-cd3, ha fornito risultati particolarmente incoraggianti nei casi con linfoma non-hodgking B e nel trattamento dei casi di LAL-B che presentano quote residue di malattia (D Argouges S et al, Leuk Res 2009). Considerati i risultati ottenuti in questi contesti, anche se ancora non pienamente inseriti nella pratica clinica, l utilizzo di AcMo anti-cd19 potrebbe risultare estremamente utile ad esempio in quei casi che risultano essere CD20 negativi. L antigene CD20 risulta altrettanto importante nel contesto delle LAL-B per i ruoli cruciali che esso svolge nella regolazione del ciclo cellulare e nei processi differenziativi (Thomas DA, Blood 2009) e per la disponibilità in commercio di numerosi AcMo con ormai dimostrata efficacia clinica. In particolare l utilizzo del Rituximab in concomitanza ai regimi chemioterapici convenzionali nei pazienti adulti affetti da LAL ha fatto registrare netti miglioramenti nella qualità di vita di tali pazienti (Thomas DA et al, Blood 2005). Analogamente agli antigeni CD19 e CD20, anche il CD22 è un antigene ristretto alla linea linfoide B e positivo nella gran parte delle LAL in relazione allo stadio maturativo cellulare; esso risulta presente a livello citoplasmatico nelle cellule più immature per divenire poi molecola di superficie del linfocita B una volta che esso esprime le immunoglobuline IgD. Rappresenta una glicoproteina trans-membrana con ruolo centrale nei processi di adesione cellulare, di regolazione dell homing dei linfociti B e di modulazione dell attivazione delle cellule B che, una volta riconosciuto da un AcMo per esso specifico, viene internalizzato a livello cellulare (Stanciu-Herrera C et al, Leuk Res 2008). Diversi studi in vitro riguardanti l utilizzo di AcMo che riconoscono tale antigene, sono stati condotti nell ambito dei linfomi (Dijoseph JF et al, Blood 2004). In alcuni casi l attività di tali anticorpi è stata valutata in vitro anche nell ambito delle LAL-B (Herrera L et al, Leukemia 2002), unitamente agli studi condotti sia in vitro che in vivo su linee cellulari di LAL pre-b che hanno dimostrato un aumento dell efficacia della chemioterapia quando accompagnata dalla simultanea somministrazione di AcMo anti-cd22 ed anti-cd19 (Stanciu Herrera C et al, Leuk Res 2008). Infine, una non piccola percentuale di LAL, sia di linea B che di linea T, risulta positiva all antigene CD33. L espressione di tale antigene nella quasi totalità delle leucemie acute mieloidi e gli incoraggianti risultati ottenuti 40

in questo ambito in seguito all utilizzo del Gemtuzumab Ozogamicin (GO), AcMo anti-cd33, hanno fornito un valido spunto per l introduzione di tale AcMo nel trattamento dei casi di LAL che esprimono questo antigene (Cotter M et al, Br J Haematol 2003; Tabernero MD et al, Leukemia 2001). Alla luce di quanto detto, la determinazione citofluorimetrica della presenza o assenza di questi specifici antigeni unitamente alla valutazione della loro intensità di espressione, potrebbe essere di grande aiuto nella definizione di strategie terapeutiche in quei pazienti affetti da LAL che possono potenzialmente beneficiare dell utilizzo di specifici AcMo somministrati da soli o in combinazione con farmaci specifici. Un prerequisito ormai considerato importante per l utilizzo di tali terapie è rappresentato dalla presenza dell antigene verso il quale l AcMo è diretto in almeno il 20-30% delle cellule patologiche presenti nel campione in esame (Vitale A et al, Curr Opin in Oncol 2006; Gokbuget N and Hoelzer D, Ann of Hematol 2004; Chevallier P et al, Leukemia 2009) tenendo presente che la presenza di una più elevata percentuale di cellule positive all antigene, potrebbe associarsi ad una maggiore probabilità di risposta a tali forme di trattamento terapeutico. 41

SCOPO DELLO STUDIO Il futuro nella gestione dei pazienti ematologici è ormai diretto verso la possibilità di disegnare approcci terapeutici sempre più personalizzati (Gokbuget N and Hoelzer D, Ann Hematol 2004). Mentre nelle forme leucemiche croniche, quali la leucemia linfatica cronica ed i linfomi non- Hodgking, così come in quei casi di LAM con espressione dell antigene CD33 è ampiamente dimostrato il ruolo di alcuni degli AcMo descritti, il loro utilizzo nell ambito delle LAL è ancora molto dibattuto (Dworzak MN et al, Blood 2008; Thomas DA et al, Blood 2009). E ormai chiaro il ruolo prognostico svolto dall età nei pazienti affetti da LAL laddove nonostante le elevate percentuali di guarigione nei bambini di età compresa tra 1 e 10 anni, che raggiungono ormai più dell 80%, meno del 40% dei soggetti adulti affetti da LAL vanno incontro a guarigione (Rowe JM et al, Blood 2005; Vitale A et al, Curr Opin in Oncol 2006). Con il fine ultimo di incrementare tali percentuali diventa importante la disponibilità di approcci terapeutici il più possibile paziente-specifici, non chemioterapici e quindi con minore tossicità in particolare per i casi in cui l eccessiva tossicità indotta dai regimi convenzionali potrebbe rappresentare un ostacolo o nei casi in cui il clone leucemico risulterebbe resistente ai trattamenti chemioterapici standard. Terapie con AcMo diretti verso specifici antigeni espressi sulla superficie delle cellule leucemiche, quali anti-cd19, anti-cd20, anti-cd22, anti-cd33, anti-cd52 (Gokbuget N and Hoelzer D, Ann Hematol 2004), potrebbero rappresentare approcci promettenti in sottogruppi particolari di pazienti che presentano specifiche caratteristiche fenotipiche. Infatti, sebbene nelle LAL non siano moltissime le esperienze in merito all utilizzo di tali farmaci cosiddetti biologici, è sempre più evidente come l efficacia di tali trattamenti possa dipendere dal grado di espressione dello specifico antigene a livello cellulare (Vitale A et al, Curr Opin in Oncology 2006; Dworzak MN et al, Blood 2008; Chevallier P et al, Leukemia 2009). Sulla base di tali considerazioni, l obiettivo di questo studio è stato quello di valutare qualitativamente e quantitativamente, l espressione di quattro importanti antigeni espressi in corso di LAL (CD19, CD20, CD22 e CD33) e per i quali sono attualmente disponibili AcMo per essi specifici, in 552 casi affetti da LAL. Si è voluto inoltre valutare criticamente la possibilità che la loro espressione potesse o non essere associata ai differenti sottotipi immunologici, alle diverse classi di età e/o alla presenza di particolari trascritti di fusione identificati mediante metodiche di biologia molecolare. 42

MATERIALI E METODI Pazienti L analisi dell intensità di espressine antigenica è stata condotta retrospettivamente su un gruppo di 552 casi con diagnosi di LAL afferenti alla Divisione di Ematologia del Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia della Sapienza di Roma. Di questi, 516 casi sono stati analizzati in fase di diagnosi mentre i rimanenti 36 al momento della recidiva di malattia. L analisi comprendeva indistintamente pazienti adulti e bambini, con un range di età compreso tra i 2 e gli 86 anni. In tutti i casi presi in considerazione la diagnosi di leucemia acuta veniva stabilita sulla base di criteri morfologici, citochimici ed immunologici in accordo con le classificazioni FAB e WHO. Tutti i campioni sono stati analizzati prima di essere sottoposti a qualsiasi trattamento terapeutico, incluso l utilizzo di farmaci steroidei. Nell ambito dei 552 casi totali, in 527 (95,5%) è stata valutata, mediante metodiche di RT-PCR, anche la presenza di particolari geni di fusione derivanti da traslocazioni cromosomiche note (Elia L et al, Haematologica 2003). Tutti i pazienti analizzati in questa sede, hanno fornito il consenso informato per l esecuzione di tali studi biologici. Con particolare riguardo all età, in accordo con quanto già noto in merito alle differenze biologiche relazionabili ad essa, i pazienti sono stati suddivisi in 4 differenti sottogruppi: 2-14, 15-21, 22-59, 60-86 anni. Nella Tabella 1 è riportata la distribuzione dei casi per fasce di età, parametro disponibile in 538 dei 552 casi presi in considerazione. Valutazione citofluorimetrica In accordo con quanto già riportato in merito alla valutazione citofluorimetrica specifici quantitativi di sangue midollare o sangue venoso periferico sono stati incubati con appropriate combinazione di AcMo coniugati con fluorocromi FITC, PE, PerCP, APC, in grado di riconoscere i seguenti antigeni espressi sulla superficie cellulare: CD1a, CD10, catene leggere delle immunoglobuline kappa (Igκ) e lambda (Igλ) (Dako, Glostrup, Denmark), CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD13, CD15, CD19, CD20, CD22, CD33, CD34, CD38, CD45, CD56, HLA-DR, TCR α/β, TCR γ/δ (BD, Biosciences, San Jose, CA), CD7, CD58, CD65, CD66c, CD117, NG2 (Immunotech Coulter Company, Marseille, France), CD99 (BD Biosciences, Pharmigen, San Diego, CA), CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany), CD52 (AbD Serotec, Oxford, UK). Altri anticorpi sono stati utilizzati per la determinazione della presenza di antigeni citoplasmatici quali MPO, CD3, CD79a (Dako), catena pesante µ delle immunoglobuline (cyigm) (Southern Biotech, Birmingham, AL), e 43

nucleari quali la TdT (Terminal deoxynucleotidyl Transferase) (Dako). Per la determinazione degli antigeni presenti sulla superficie cellulare è stata eseguita la procedura di lisi dei globuli rossi mediante l utilizzo della FACS Lysing Solution 10X (BD Biosciences) mentre soluzioni fissanti e permeabilizzanti le cellule (Fix & Perm, Invitrogen, Carlsbab, CA) sono state utilizzate per la valutazione degli antigeni citoplasmatici e nucleari. Combinazioni contenenti, tra quelli elencati, quattro differenti anticorpi fluorocomo-coniugati sono state preparate ed acquisite utilizzando il citofluorimetro FACSCalibur (BD Biosciences) con un salvataggio di almeno 30,000 eventi per tubo. L analisi dei dati è stata eseguita utilizzando i softwares CELLQuest e PAINT-A-GATE (BD Biosciences). In particolare, l espressione degli antigeni CD19, CD20, CD22 e CD33 nelle LAL-B e del solo antigene CD33 nelle LAL-T è stata stimata in primo luogo valutando la proporzione delle cellule positive per ciascuno di essi con un cut-off pari al 20%. Successivamente sono stati determinati i livelli di espressione antigenica sulla base dei valori di MFI ricavati mediante l utilizzo del software CELLQuest e sulla base dei valori di ABC ottenuti attraverso il sistema QuantiBRITE per mezzo del software QuantiCALC. Il sistema QuantiBRITE disegnato per la valutazione di antigeni riconosciuti da un AcMo PE-coniugato, permette di stabilire per ciascuna cellula, l esatto numero di molecole PE adese alla superficie cellulare attraverso l utilizzo di un sistema di regressione lineare (Iyer SB et al, Cytometry 1998; Davis KA et al, Cytometry 1998). I valori di MFI ed ABC relativi a ciascuno degli antigeni analizzati sono stati determinati utilizzando le stesse combinazioni anticorpali per ognuno dei casi analizzati (Tabella 2) in quanto eventuali differenze di combinazione avrebbero potuto determinare variazioni di intensità di espressione antigenica non paziente-specifica ma combinazione-dipendente con difficoltà nello stabilire reali differenze di espressione antigenica all interno di specifici sottogruppi di pazienti. 44

RISULTATI Caratterizzazione immunofenotipica Sulla base del profilo immunofenotipico, i casi analizzati venivano suddivisi in 451 casi di LAL-B e 101 casi di LAL-T. Nell ambito delle LAL-B si distinguevano 54 casi di LAL pro-b, 295 casi di LAL B-common, 91 casi di LAL pre-b e 7 casi di LAL-B matura (Tabella 1). In 4 casi non essendo stata valutata l espressione citoplasmatica delle IgM è risultato impossibile effettuare una classificazione immunologica. Analogamente, dei 101 casi di LAL-T identificati, 7 risultavano classificabili come early T, 20 casi come LAL pro-t, 57 come LAL-T corticali, 15 come LAL pre- T ed infine 2 casi come LAL-T mature (Tabella 1). Nel gruppo delle LAL-B l età mediana risultava pari a 36 anni (range 2-86) e la conta mediana della percentuale dei blasti pari all 82% (range 20-98%). Considerando i casi immunologicamente identificabili come LAL T, essi si presentavano con un età mediana di 31 anni (range 5-72) ed una mediana della percentuale dei blasti pari all 89% (range 37-99%). L analisi di biologia molecolare eseguita mediante RT-PCR in 527/552 casi identificava, nell ambito delle LAL-B, 137 casi BCR/ABL positivi (di cui 94 casi p190, 34 p210 e 9 casi p190/p210), 23 casi MLL/AF4 positivi, 13 E2A/PBX1 positivi, 4 casi positivi per il gene di fusione MLL/ENL e 14 positivi per TEL/AML1. I rimanenti casi di LAL-B risultavano negativi all analisi molecolare per la presenza di trascritti di fusione noti. Tra i casi immunologicamente distinguibili come LAL-T venivano identificati 8 casi con il gene di fusione SIL/TAL, 2 casi NUP/RAP positivi, 1 caso SET/CAN positivo, 2 casi positivi per BCR/ABL ed 1 caso positivo per MLL/ENL; i rimanenti casi non mostravano presenza di alcun trascritto di fusione noto. 45

Espressione antigenica Dall analisi dell espressione antigenica in associazione alle differenti sottoclassi di età non è emersa alcuna differenza statisticamente significativa. Analogamente, la valutazione in 36 casi sia dei campioni di esordio che di quelli relativi alla fase di recidiva di malattia, non ha evidenziato alcuna differenza sostanziale in merito all intensità di espressione per nessuno dei quattro antigeni presi in considerazione. Espressione dell antigene CD19 In quanto antigene di linea per le LAL-B, il CD19 è risultato positivo in tutti i 451 casi di LAL-B analizzati con un valore mediano di percentuale di positività pari all 82% (range 20-98%) e con modalità di espressione omogenea sull intera popolazione leucemica senza alcuna differenza tra i diversi sottogruppi immunologici identificati (Tabella 3a). Prendendo in considerazione i parametri per la valutazione dell intensità di espressione, i valori di MFI ed ABC sono risultati rispettivamente valutabili in 247/451 casi (54.8%) ed in 49/451 casi (10.9%). Sulla base di tali parametri, l analisi dell espressione di questo antigene in associazione ai differenti sottogruppi immunologici, non ha evidenziato alcuna differenza quando venivano confrontati fra loro i casi di LAL pro-b, con quelli di LAL B-common, pre-b e B matura (Tabella 3b). Espressione dell antigene CD20 La presenza dell antigene CD20 è stata valutata in 450 dei 451 casi di LAL-B analizzati con una positività rilevata in 137/450 casi (30.4%). I casi risultati positivi potevano a loro volta suddividersi in due differenti sottogruppi sulla base della percentuale delle cellule CD20+ nell ambito della popolazione di cellule patologiche. Tale caratteristica è risultata ricorrente anche quando veniva esaminata la presenza di tale antigene nell ambito delle differenti sottoclassi immunologiche. In particolare, mentre tutti i casi di LAL pro-b risultavano essere negativi per la presenza del CD20, tutti i 7 casi di LAL-B matura presentavano una positività a tale antigene con una espressione sull intera popolazione di cellule patologiche. Nei rimanenti due sottogruppi immunologici, i casi CD20 positivi mostravano una espressione bimodale come riflesso di una eterogeneità antigenica (Figura 2, Tabella 3a). In 91 dei 137 casi positivi alla valutazione del CD20 (66.4%) è stata valutata anche l intensità di espressione antigenica in termini di MFI relazionandola ai differenti sottotipi immunologici. 46

Da tale analisi è emerso un incremento nei livelli di espressione dell antigene CD20 in accordo con il processo maturativo linfoide B con valori di MFI inferiori nel sottogruppo delle LAL B-common quando comparati con i valori di MFI rilevati nei casi con LAL pre-b e LAL B matura (Figura 3, Tabella 3b). In una più piccola coorte di pazienti CD20 positivi (24/137, 17.5%) è stata valutata l intensità di espressione antigenica analizzando i valori di ABC. Sebbene l analisi ha riguardato gruppi numericamente esigui di pazienti (22 casi di LAL B-common e 2 casi di LAL pre-b), essa ha fornito risultati che confermavano quanto emerso dall analisi dei valori di MFI: il gruppo delle LAL B-common presentava valori mediani di ABC inferiori a quelli ottenuti nel più maturo sottogruppo delle LAL pre-b (Tabella 3b) Espressione dell antigene CD22 La presenza dell antigene CD22 è stata analizzata in 427 dei 451 casi di LAL-B con una positività evidenziabile in 397/427 casi (93%). Così come riportato per l antigene CD20, i casi positivi per l espressione del CD22 potevano essere a loro volta suddivisi in due sottogruppi. L uno predominante e costituito da quei casi che esprimevano l antigene sull intera popolazione di cellule leucemiche e l altro costituito dai casi che esprimevano tale antigene solo su una percentuale della popolazione patologica (Figura 2, Tabella 3a). Analogamente a quanto osservato per il CD20, stesse considerazioni possono essere effettuate con rispetto all espressione del CD22 in associazione ai differenti sottotipi immunologici, con un registrato incremento della percentuale dei casi positivi dal gruppo delle LAL pro-b fino alle LAL-B mature in accordo con il processo maturativo delle cellule linfoidi B (Figura 3, Tabella 3a). Riguardo la valutazione dell intensità di espressione antigenica, i valori di MFI sono stati analizzati in 206 dei 397 casi positivi a tale antigene (51.9%) con un incrementato livello di espressione dallo stadio pro-b a quello B-maturo (Tabella 3b). Inoltre, in 81/397 casi CD22 positivi (20.4%) sono stati valutati anche i valori di ABC. Tali dati risultavano però disponibili solo per casi di LAL pro-b, B-common e pre-b mentre in nessuno dei casi di LAL- B matura era stato possibile valutare tale parametro. Ciononostante i risultati ottenuti riflettevano l andamento riscontrato dall analisi dei valori di MFI (Tabella 3b). Espressione dell antigene CD33 La valutazione dell espressione dell antigene CD33 nell ambito dei 451 casi di LAL-B è stata eseguita in 440 pazienti; esso è risultato positivo in 112/440 casi (25.5%). Così come già sottolineato per gli altri antigeni - eccetto che per il CD19 i casi positivi potevano a loro volta 47

suddividersi sulla base della proporzione di cellule leucemiche ad esso positive rispetto al totale della popolazione leucemica (Figura 2, Tabella 3a). Prendendo in considerazione i sottotipi immunologici, quello delle LAL B-common comprendeva la più elevata percentuale di casi positivi per l antigene CD33 (29.5%) mentre frequenze inferiori si registravano nell ambito delle LAL pre-b (16.7%) ed ancor più delle LAL B mature dove nessuno dei 7 casi risultava positivo al CD33. Così come per gli altri antigeni, anche per il CD33 sono stati valutati i livelli di intensità di espressione sia in termini di MFI che di ABC rispettivamente in 51/112 casi (45.5%) ed in 34/112 casi (30.3%), senza però alcuna evidenza di espressione differenziale tra i differenti sottogruppi immunologici (Tabella 3b). L antigene CD33 è stato inoltre esaminato anche nell ambito delle LAL-T, in 97 dei 101 casi di LAL-T identificati (96%) con una piccolissima percentuale di casi positivi a tale antigene. Esso risultava espresso sulla intera popolazione leucemica solo in 6 dei 97 casi valutati (6.2%) che comprendevano 3 early-t, 1 caso di LAL pro-t ed 1 caso di T-corticale. Altri 6/97 casi (6.2%), comprendenti 4 casi di early-t, 1 caso di LAL pro-t ed 1 caso di T-corticale, esprimevano invece tale antigene solo su una percentuale della popolazione patologica totale (Figura 2). Nell insieme, la presenza dell antigene CD33 è stata riscontrata nel 12.4% delle LAL-T analizzate, con una positività sempre presente in tutte le LAL pro-t e mai riscontrata nell ambito del sottogruppo delle early-t. Infine, rispettivamente in 8 (66.6%) ed in 7 (58.3%) dei 12 casi CD33 positivi sono stati valutati i livelli di espressione antigenica in termini di MFI ed ABC senza alcuna differenza evidenziabile in associazione ai differenti sottogruppi immunologici. Espressione antigenica ed alterazioni molecolari L espressione antigenica valutata sia come incidenza che come intensità, è stata correlata in questo studio anche con l eventuale presenza di alterazioni cromosomiche specifiche presenti in corso di LAL. Da questa analisi è emerso come l antigene CD19 sempre espresso nelle LAL-B, non mostri particolari patterns di espressione antigenica. Analogamente, nessuna differenza in termini di frequenza ed intensità valutata mediante valori di MFI è stata osservata in merito all espressione dell antigene CD20 rispetto alla presenza o meno di specifici trascritti di fusione. In questo ambito, quando venivano però considerati i livelli di espressione antigenica come valori di ABC, nell ambito delle LAL B-common, si evidenziava una differenza di espressione tra i casi positivi per i geni di fusione (ed in particolare quelli con trascritto BCR/ABL ed E2A/PBX1) e quelli senza trascritti noti con livelli significativamente maggiori di ABC nei casi positivi (p=0.05). Con 48

riferimento all espressione dell antigene CD22 da questa analisi è emerso come nell ambito del sottogruppo delle LAL pro-b nel quale ricadevano tutti i 23 casi positivi per il gene di fusione MLL/AF4, solo 3 di questi esprimevano il CD22 sull intera popolazione patologica mentre i rimanenti 20 casi risultavano negativi o esprimevano l antigene solo su una piccola percentuale delle cellule leucemiche totali. Risultati differenti si ottenevano quando venivano considerati i 31 casi di LAL pro-b negativi per il gene di fusione MLL/AF4. Essi infatti esprimevano per la maggior parte l antigene CD22 su tutta la popolazione leucemica e solo in 6 casi si registrava una espressione parziale dell antigene. In aggiunta a ciò, sempre nel contesto della valutazione dell espressione del CD22, quando venivano estrapolati solo i casi positivi per il gene di fusione BCR/ABL, veniva meno l incremento di espressione antigenica osservata quando si analizzava l intera serie di casi di LAL-B, in relazione al profilo maturativo linfoide B. Infatti, i valori mediani di MFI risultavano maggiori nel gruppo delle LAL B-common rispetto al gruppo delle più mature LAL pre-b: 70.5 (range 16-374) e 44.5 (range 20-187) rispettivamente. L intuizione sul fatto che la presenza del gene di fusione BCR/ABL potesse influenzare l espressione dell antigene CD22 è stata ulteriormente confermata dai risultati ottenuti nei casi che non presentavano aberrazioni cromosomiche. Infatti, in questo gruppo di pazienti si osservava un incremento dell intensità di espressione dell antigene CD22 in accordo con il processo maturativo linfoide B con valori mediani di MFI pari a 63.5 (range 11-284) nel sottogruppo delle LAL B-common e pari a 142.5 (range 23-951) nel sottogruppo delle LAL pre-b. Le stesse differenze, non si evidenziavano però quando venivano comparati i valori di ABC con le alterazioni molecolari presenti. Infine, una differente percentuale di casi positivi all antigene CD33 veniva evidenziata nell ambito dei differenti sottogruppi con specifici trascritti di fusione. Il 34% dei casi CD33 positivi si collocava all interno dei casi BCR/ABL positivi, il 7% tra i casi E2A/PBX1 positivi ed il 7% tra i casi TEL/AML1 positivi mentre nessun caso CD33 positivo ricadeva nei gruppi positivi ai geni di fusione MLL/AF4 ed MLL/ENL (Figura 4). Inoltre, se venivano comparati fra loro i casi geneticamente negativi con quelli geneticamente positivi, si riscontravano significative differenze in termini di MFI ed ABC con più elevati livelli di espressione antigenica nei casi che non presentavano traslocazioni cromosomiche note (MFI: p=0.05; ABC: p=0.02). Al contrario, nessuna differenza di espressione antigenica, valutata sia come MFI che come ABC, veniva osservata quando si consideravano le caratteristiche genetiche nell ambito dei casi con diagnosi di LAL-T. 49

DISCUSSIONE L utilizzo di terapie che prevedono la somministrazione di AcMo sta via via ricoprendo un ruolo sempre maggiore nella gestione di pazienti con patologie ematologiche e non. Nell ambito specifico delle leucemie acute, l utilizzo di AcMo ha svolto e continua a svolgere un ruolo estremamente importante in particolare nel trattamento dei casi affetti da LAM. Alla luce degli entusiasmanti risultati ottenuti in questo ambito, un interesse sempre maggiore è rivolto verso la possibilità di un loro utilizzo anche nell ambito delle LAL. Ciononostante, resta ancora molto da comprendere circa l efficacia di questi agenti e la chiara definizione dei meccanismi attraverso i quali essi esplicano la loro attività. E ormai chiaro come terapie che prevedano la somministrazione del solo AcMo possano determinare una remissione completa di malattia solo in rari casi (Morris ES and Vora A, Br J Haematol 2007), come a suggerire l importanza di una loro associazione con regimi chemioterapici specifici per ciascuna patologia. In questo contesto, una approfondita conoscenza di come particolari antigeni, per i quali sono disponibili AcMo, vengano espressi a livello cellulare, può essere estremamente utile per una più precisa caratterizzazione della popolazione leucemica in ciascun paziente e quindi per un più razionale inserimento di tali AcMo in un ben preciso algoritmo terapeutico. A questo scopo si è voluta valutare, in una ampia serie di casi con diagnosi di LAL, l espressione di specifici antigeni, per i quali sono disponibili AcMo per utilizzo clinico, correlandola con l età dei pazienti presi in considerazione, con i differenti sottotipi immunologici, nonché con la presenza o meno di eventuali aberrazioni cromosomiche note. Tra i diversi antigeni presi in considerazione, il CD19 rappresenta un interessante target nell ambito delle patologie ematologiche se si considera la sua diffusa espressione sia nelle forme leucemiche che linfomatose (Horton HM et al, Cancer Res 2008). In merito ad esso, i dati emergenti da questo studio mettono in evidenza una positività in tutti i casi presi in considerazione senza alcuna differenza di espressione nell ambito dei vari sottogruppi di pazienti. Ciononostante, l utilizzo di AcMo anti-cd19 potrebbe comunque rappresentare una opzione terapeutica di rilievo in quei casi affetti da patologie linfoidi B indifferenziate che non mostrando alcuna positività per l antigene CD20, non potrebbero beneficiare di trattamenti con AcMo anti-cd20. Ad oggi, è riconosciuta l attività e l efficacia di diversi AcMo anti-cd19 e tra questi, quelli dotati di attività bi-specifica sembrerebbero fornire risultati particolarmente incoraggianti. In particolare, i primi risultati positivi ottenuti con l anticorpo bi-specifico, anti-cd19 anti-cd3, Blinatumomab, nei pazienti affetti da linfoma non-hodgkin B recidivati dopo terapie standard (D'Argouges S et al, 50

Leuk Res 2009), fanno di tale anticorpo un promettente candidato per il trattamento di altre patologie a carico delle cellule linfoidi B. Infatti, studi di fase II condotti utilizzando tale AcMo hanno dimostrato una completa remissione molecolare di malattia in pazienti affetti da LAL-B dei precursori, che risultavano in fase di remissione ematologica completa ma con persistente o altalenante presenza di malattia minima residua dopo terapia di consolidamento (Topp M et al, ASH 2010, Abstract # 174; Topp M et al, EHA 2009, Abstract # 0482). Con riguardo agli antigeni CD20 e CD22, da questa analisi sono emerse percentuali complessive di positività, rispettivamente pari al 93% ed al 30% dei casi analizzati, esattamente in linea con quanto già precedentemente pubblicato (Thomas DA et al, Blood 2009; Stanciu-Herrera C et al, Leuk Res 2008). Un importante concetto emerso da questa analisi riguarda la relazione esistente tra la percentuale di positività delle cellule per un dato antigene ed i valori di MFI. E stato infatti osservato come i casi che presentavano un espressione degli antigeni CD20 e CD22 solo su una percentuale della popolazione leucemica mostravano anche più bassi valori di MFI quando comparati con i casi che invece esprimevano tali antigeni su tutta la popolazione patologica. In particolare, per entrambi gli antigeni considerati, è stata evidenziata una stretta associazione tra il loro livello di espressione, inteso sia come percentuale dei casi positivi che come valori di MFI ed ABC, ed il profilo maturativo linfoide delle cellule B con un incrementato livello di espressione registrato nel passaggio dal gruppo dei casi con LAL pro-b a quelli con LAL B-matura. Sebbene l impatto che tale trend di espressione possa ricoprire nell ambito della potenziale efficacia di trattamenti immunoterapici con AcMo anti-cd20 o anti-cd22 non sia ancora ben chiaro, tali osservazioni potrebbero svolgere un ruolo rilevante nel contesto di uno specifico utilizzo di tali agenti in momenti particolari del processo maturativo cellulare. A riguardo, studi in vitro ed in vivo effettuati utilizzando linee cellulari di LAL pre-b hanno dimostrato un incremento dell efficacia della chemioterapia quando si utilizzavano AcMo anti-cd22 combinati con anti-cd19 (Stanciu- Herrera C et al, Leuk Res 2008). Analogamente, in un altro lavoro condotto su una casistica pediatrica, si dimostrava come il trattamento con Epratuzumab in fase di reinduzione in aggiunta alla chemioterapia standard, risultava fattibile, ben tollerato e con buoni risultati nei casi in recidiva di LAL-B con espressione dell antigene CD22 (Raetz EA et al, J Clin Oncol 2008). Accanto a ciò, l aggiunta di AcMo anti-cd20, quali il Rituximab, alla chemioterapia intensiva in soggetti adulti affetti da LAL, sembrerebbe incrementare la sopravvivenza libera da malattia (disease-free servival, DFS) nonchè l outcome dei casi positivi all antigene CD20 (Thomas DA et al, ASH 2007, Abstract # 2824; Hoelzer D et al, EHA 2009, Abstract # 0481; Hoelzer D et al, ASH 2010, Abstract # 170). Ad ogni modo, con l eccezione dei casi con linfoma di Burkitt dove è ampiamente descritta l efficacia di tali agenti (Thomas DA et al, Cancer 2006), non sono presenti 51

altri dati sull utilizzo specifico di AcMo anti-cd20 nei casi di LAL-B in associazione ai differenti livelli di espressione o allo stadio maturativo cellulare. Al contrario, la dimostrazione della presenza di una up-regolazione dell espressione dell antigene CD20 in seguito a trattamento con farmaci corticosteroidi, potrebbe fornire un importante razionale per l inclusione di AcMo anti-cd20 eventualmente nelle fasi successive all esordio di malattia, laddove alla diagnosi il paziente risultava negativo a tale antigene o lo esprimeva con minore intensità (Dworzak MN et al, Blood 2008; Watt TC et al, ASH 2010, Abstract # 2124; Dworzak MN et al, Cytometry Part B 2010). L analisi dell espressione dell antigene CD33 nella serie oggetto di tale studio, ha fornito risultati in linea con quanto già riportato dal nostro gruppo (Vitale A et al, Haematologica 2007). Tale antigene risultava maggiormente espresso nei casi di LAL-B con una frequenza del 25% rispetto ai casi di LAL-T dove la frequenza risultava pari al 12%, con valori di MFI che, così come evidenziato per gli antigeni CD20 e CD22, riflettevano la percentuale di cellule leucemiche CD33 positive. Inoltre, è stata osservata una maggiore espressione del CD33 nel sottogruppo delle LAL B-common come a suggerire una correlazione tra l espressione antigenica e la classificazione immunologica dei pazienti affetti da LAL. Con riguardo al gruppo delle LAL-T, gli unici casi risultati positivi erano i 7 pazienti con early-t, mentre tutti gli altri risultavano negativi all antigene CD33. Sulla base di tali dati, l utilizzo dell AcMo Gemtuzumab Ozogamicin (GO), un anti-cd33 ampiamente utilizzato nel trattamento dei casi di LAM, potrebbe potenzialmente mostrare una significativa attività ed efficacia anche nei casi di LAL positivi all antigene CD33. A tal proposito, risultati incoraggianti sono stati riportati in casistiche pediatriche di LAL CD33 positive (Cotter M et al, Br J Haematol 2003; Zwaan CM et al, Leukemia 2003) mentre restano ancora scarse le esperienze in merito alla fattibilità della somministrazione di GO in combinazione con farmaci chemioterapici nei pazienti adulti (Chevallier P et al, Int J Hematol 2008). Ad ogni modo, considerata anche la recente sospensione dal commercio di tale farmaco a causa dei suoi potenziali effetti tossici, molti studi restano necessari per meglio chiarire l impatto clinico derivante dal suo utilizzo. L assenza in letteratura di studi che descrivono eventuali correlazioni tra età, importante fattore prognostico nell ambito delle LAL, e presenza di particolari profili di espressione antigenica, ha reso ancor più interessante l analisi dei pazienti sotto tale profilo. Da questa analisi è emerso che l espressione di tutti gli antigeni considerati, sia come incidenza che come livello di intensità di espressione, non mostrava alcun pattern specifico in relazione all età dei pazienti analizzati. Oltre ciò, è ben noto come uno dei fattori prognostici importanti utilizzati per l identificazione di gruppi di pazienti con rischio biologico diverso, sia la presenza di particolari aberrazioni geneticomolecolari. Per queste ragioni, in questo studio è stata anche verificata l eventuale associazione tra presenza/assenza di specifiche traslocazioni cromosomiche e valutazione citofluorimetrica 52

dell espressione antigenica. I risultati hanno evidenziato, in merito all antigene CD22, una parziale espressione o totale assenza in tutti i casi con presenza del gene di fusione MLL/AF4. Al contrario, la maggior parte dei casi CD22 positivi senza traslocazioni cromosomiche note, esprimevano tale antigene su tutta la popolazione patologica, come a suggerire una possibile associazione tra le LAL MLL/AF4 positive ed uno specifico trend di espressione del CD22. Inoltre, essa sembra essere influenzata anche dalla presenza del gene di fusione BCR/ABL. Infatti, l incremento dell intensità di espressione osservato in associazione al profilo maturativo linfoide B quando venivano analizzati tutti i casi complessivamente, non veniva più rispettato se si estrapolavano solo i pazienti positivi per il gene di fusione BCR/ABL con livelli di espressione del CD22 maggiori nel gruppo delle LAL B-common rispetto alle più mature LAL pre-b. Sulla base di tali risultati, l utilizzo di AcMo anti- CD22 non sembrerebbe indicato nei casi positivi per il gene di fusione MLL/AF4 mentre potrebbe essere seriamente considerato nel trattamento dei casi di LAL B-common BCR/ABL positivi. Con riferimento all antigene CD33, questa analisi ha evidenziato una maggiore percentuale di casi positivi (34%) nell ambito dei casi BCR/ABL positivi rispetto ai casi caratterizzati da altri geni di fusione noti, ribadendo la già descritta associazione tra la presenza di tale antigene e la presenza della t(9;22)(q34;q11) (Tabernero MD et al, Leukemia 2001). Presi insieme, i risultati provenienti dall analisi di una così vasta serie di casi pur non avendo evidenziato particolari differenze fenotipiche associate alle diverse fasce di età, hanno messo in evidenza per la prima volta specifici trends di espressione antigenica in associazione al processo differenziativo linfoide e/o alla presenza/assenza di aberrazioni cromosomiche note suggerendo la possibilità di considerare tali differenze per il possibile utilizzo clinico di specifici AcMo. Ulteriori studi saranno necessari per comprendere a fondo l ipotizzata correlazione tra l espressione antigenica e l efficacia terapeutica di tali molecole. 53

Figura 1: Esempio del meccanismo d azione degli anticorpi monoclonali. Nella figura sono rappresentati i principali pathways attivati da anticorpi anti-cd20. 1. Essi sono in grado di indurre apoptosi mediante attivazione delle caspasi e di proteine ad attività pro-apoptotica. 2. Diversi studi in vitro hanno inoltre dimostrato l abilità di tali molecole di indurre una lisi complemento-mediata delle cellule patologiche. 3. Infine, essi sarebbero in grado di reclutare cellule effettrici esprimenti recettori Fcγ, le quali eserciterebbero funzione citotossica nei confronti della cellula tumorale (Cartron G et al, Blood 2004). 54

Tabella 1: Suddivisione dei pazienti nelle quattro differenti fasce di età (dati disponibili in 538/552 casi). Fascia di età LAL-B LAL-T (anni) n=441 n= 97 2-14 73 (16%) 10 (10%) 15-21 60 (14%) 16 (17%) 22-59 260 (59%) 66 (68%) 60-86 48 (11%) 5 (5%) Tabella 2: Combinazioni di AcMo utilizzate in questo studio per determinare i valori di MFI ed ABC per ciascuno degli antigeni presi in considerazione. L ordine di ciascun anticorpo nella combinazione rispetta la coniugazione con i rispettivi fluorocromi: FITC, PE, PerCP, APC. Antigene MFI ABC CD19 CD38/CD10/CD34/CD19 CD45/CD19/CD34/LDS CD20 CD10/CD20/CD34/CD19 CD10/CD20/CD34/CD19 CD22 CD10/CD22/CD34/CD19 CD10/CD22/CD34/CD19 CD33 (LAL-B) CD10/CD33/CD34/CD19 CD10/CD33/CD34/CD19 CD33 (LAL-T) CD7/CD33/CD34/CD5 CD7/CD33/CD34/CD5 55

Tabella 3: a) Espressione antigenica quantitativa (percentuali di espressione) in associazione ai differenti sottotipi immunologici; b) espressione antigenica qualitativa (valori di MIF ed ABC) in relazione ai differenti sottotipi immunologici. a) CD19 Numero di casi CD20 Numero di casi CD22 Numero di casi CD33 Numero di casi Casi positivi/casi esaminati Espressione antigenica totale 451/451 53/450 (11.8%) 341/427(79.9%) 39/440 (8.9%) Espressione antigenica parziale - 84/450 (18.6%) }30.4% 56/427 (13.1%) }93% 73/440 (16.6%) }25.5% Casi negativi/casi esaminati LAL pro-b - 313/450 (69.6%) 30/427 (7%) 328/440 (74.5%) Espressione antigenica totale 54/54-28/54 (52%) 9/52 (17%) }83% Espressione antigenica parziale - - 17/54 (31%) 3/52 (6%) }23% LAL B-common Casi negativi - 54/54 9/54 (16.7%) 40/52 (76.9%) Espressione antigenica totale 295/295 26/294 (8.8%) 236/277 (85.2%) 23/288 (8%) }29.5% }96.4% Espressione antigenica parziale - 61/294 (20.7%) 31/277 (11.2%) 62/288 (21.5%) }29.5% LAL pre-b Casi negativi - 207/294 (70.4%) 10/277 (3.6%) 203/288 (70.5%) Espressione antigenica totale 91/91 20/91(22%) 72/86 (83.8%) 7/90 (7.8%) Espressione antigenic aparziale - 22/91 (24.2%) }46.2% 7/86 (8.1%) }91.9% 8/90 (8.9%) }16.7% LAL B-mature Casi negativi - 49/91 (53.8%) 7/86 (8.1%) 75/90 (83.3%) Espressione antigenica totale 7/7 7/7 5/6 (83.3%) - }100% Espressione antigenica parziale - - 1/6 (16.7%) - LAL B non classificabili Casi negativi - - - 6/6 Espressione antigenica totale 4/4 1/4 (25%) - - Espressione antigenica parziale - - - - Casi negativi - 3/4 (75%) 4/4 4/4 56

b) CD19 CD20 CD22 CD33 LAL-B LAL pro-b LAL B-common LAL pre-b LAL B-mature MIF Casi studiati/ casi positivi totali (%) 247/451 (54.8%) 91/137 (66.4%) 206/397 (51.9%) 51/112 (45.5%) ABC Casi studiati/ casi positivi totali (%) 49/451 (10.9%) 24/137 (17.5%) 81/397 (20.4%) 34/112 (30.3%) Casi studiati/ casi positivi totali (%) 29/54-23/45 5/12 MIF Valore mediano di MIF (range) 97 (25-263) - 38.5 (12-109) 97 (32-209) ABC MIF ABC MIF ABC MIF ABC Casi studiati/ casi positivi totali (%) 7/54-6/45 - Valore mediano di ABC (range) 2784 (1942-8697) - 1450 (548-2487) - Casi studiati/ casi positivi totali (%) 157/295 52/87 131/267 39/85 Valore mediano di MIF (range) 101 (18-400) 66 (14-1991) 69.5 (11-374) 32 (9-128) Casi studiati/ casi positivi totali (%) 30/295 22/87 59/267 27/85 Valore mediano di ABC (range) 3606 (793-13115) 1640 (400-8189) 2356 (412-8294) 1094 (200-4866) Casi studiati/ casi positivi totali (%) 59/91 36/42 50/79 7/12 Valore mediano di MIF (range) 112 (38-258) 96.5 (15-2937) 99 (11-951) 32 (19-176) Casi studiati/ casi positivi totali (%) 12/91 2/91 16/79 7/15 Valore mediano di ABC (range) 3135 (1109-8500) 2380.5 (2245-25196) 2810.5 (793-9143) 2128 (487-4675) Casi studiati/ casi positivi totali (%) 2/7 3/7 2/6 - Valore mediano di MIF (range) 98 (46-150) 114 (90-264) 151.5 (103-200) - Casi studiati/ casi positivi totali (%) - - - - Valore mediano di ABC (range) - - - - 57

Figura 2: Espressione degli antigeni CD20, CD22 e CD33. Sulla prima linea sono rappresentati esempi di casi negativi; sulla seconda casi con espressione antigenica parziale; sull ultima riga casi esprimenti l antigene sull intera popolazione leucemica. I valori di MFI riportati riflettono esattamente le percentuali di cellule leucemiche positive all antigene. Figura 3: Espressione degli antigeni CD20 e CD22 come valore mediano di MFI, in relazione al profilo maturativo linfoide B. 58

Figura 4: Espressione dell antigene CD33 nelle LAL-B in relazione alla presenza di particolari markers molecolari. 59

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CAPITOLO II PROGETTO III: Valutazione dell intensità di espressione dell antigene CD33 in casi di leucemia acuta mieloide con mutazioni a livello del gene NPM1 De Propris MS, Raponi S, Diverio D, Milani ML, Meloni G, Falini B, Foà R and Guarini A. High CD33 expression levels in acute myeloid leukemia cells carrying the nucleophosmin (NPM1). Haematologica 2011; 96(10):1548-51. 73

INTRODUZIONE La leucemia acuta mieloide (LAM) rappresenta un disordine clonale, geneticamente eterogeneo, caratterizzato da un accumulo di alterazioni genetiche acquisite a livello dei progenitori ematopoietici che alterano i normali meccanismi di self-renewal, proliferazione e differenziamento (Marcucci G et al, J Clin Oncol 2011) determinando un progressivo accumulo a livello del midollo osseo e del sangue periferico di precursori emopoietici immaturi (blasti) con conseguente anemia, neutropenia e piastrinopenia. Le LAM possono insorgere de novo, oppure successivamente ad un altra emopatia precedentemente diagnosticata, nella maggior parte dei casi una sindrome mielodisplastica o, meno frequentemente, una malattia mieloproliferativa cronica (Rubnitz JE et al, Hematol Oncol Clin North Am 2010). Tale forma leucemica rappresenta una malattia rara con una incidenza pari a 2,5-3 casi per 100.000 ed una maggiore prevalenza nell ambito dei soggetti con età avanzata. L eziologia della LAM rimane a tutt oggi sconosciuta. Nella maggior parte dei casi si tratta infatti di una malattia sporadica, caratterizzata dall acquisizione a livello delle cellule staminali emopoietiche di mutazioni somatiche che conferiscono un vantaggio proliferativo. Diverse osservazioni suggeriscono come l esposizione ad agenti mutageni (Vlaanderen J et al, Environ Health Perspect 2010), o radiazioni ionizzanti (Pedersen-Bjergaard J et al, Leukemia 2002) possano associarsi ad un rischio maggiore di sviluppare la malattia rispetto alle popolazioni di controllo. Esistono poi quelle forme che si sviluppano in seguito all assunzione di chemioterapici per presenza di altre neoplasie (therapy-related AML). Inoltre, in età pediatrica, è ben documentata l associazione tra aumentata incidenza di LAM e malattie genetiche con elevata instabilità cromosomica. Ad oggi, la diagnosi della LAM non può prescindere dall esame morfologico del midollo osseo che avvalendosi della classificazione FAB permette di distinguere otto differenti sottogruppi caratterizzati da livelli diversi di differenziamento cellulare (Bennett JM et al, Ann Intern Med 1985). Più recentemente, la classificazione WHO (Vardiman JW et al, Blood 2009), elaborata sulla base delle progressive acquisizioni raggiunte nel campo dell analisi citogenetica e geneticomolecolare, oltre a ridurre dal 30% al 20 % la quota di blasti necessaria per porre diagnosi di LAM, basandosi su una sempre maggiore integrazione di caratteristiche cliniche, morfologiche, citogenetiche e biomolecolari, permette una accurata differenziazione delle diverse forme di LAM 74

facilitando, infine, la comprensione delle correlazioni tra eterogeneità della malattia ed efficacia terapeutica. Il ruolo dell analisi citogenetica e biomolecolare risulta infatti, ad oggi, indispensabile in particolare per quelle mutazioni ed alterazioni citogenetiche ormai riconosciute in grado di influenzare la prognosi della malattia permettendo una distinzione dei pazienti in categorie di rischio differenti: favorevole, intermedio e sfavorevole (Mrozek K et al, Sem Oncol 1997). Focalizzando l attenzione sulla categoria dei pazienti a rischio intermedio, l eterogeneità riscontrata in termini di sopravvivenza, ha reso anche l età un fattore prognostico altrettanto importante nella stratificazione dei pazienti. Ciononostante circa il 40% dei casi affetti da LAM non mostrano anomalie identificabili mediante le convenzionali analisi citogenetiche. In questi casi, studi relativi al profilo di espressione genica hanno dimostrato una estrema eterogeneità molecolare e l utilizzo di tecniche di analisi molecolare e sequenziamento genico ha permesso l identificazione di nuovi markers con rilevanza prognostica. Tra questi, attualmente l identificazione di mutazioni a livello dei geni NPM1, CEBPA e FLT3 svolge un importante ruolo nella pratica clinica, permettendo la definizione di livelli di rischio diversi e di conseguenza la possibilità di scegliere protocolli terapeutici differenziati (Dohner H et al, Blood 2010). Inoltre, sulla base delle caratteristiche cliniche e biologiche, i casi con LAM che presentano alterazioni a carico di tali geni sono stati incorporati nella classificazione WHO come entità distinte. Diventa quindi di estrema importanza prendere in considerazione uno screening di tali geni in particolare in quei pazienti che risultano avere un cariotipo normale, considerata anche la disponibilita farmaci per essi specifici (Dohner H et al, Blood 2010). In particolare, tra queste alterazioni, le mutazioni a carico del gene NPM1 sono le più frequenti, raggiungendo percentuali pari al 40-50% dei casi con cariotipo normale (Falini B et al, N Engl J Med 2005). Il gene NPM localizzato a livello del cromosoma 5q35, è costituito da 12 esoni che mediante splicing alternativo codificano tre differenti isoforme proteiche di cui NPM1 fu la prima ad essere isolata. Si tratta di una proteina, la nucleofosmina, tipicamente localizzata nel nucleolo ed appartenente alla famiglia delle nucleoplasmine, categoria di chaperoni nucleo-citoplasma (Luo J et al, Am J Clin Pathol 2010). A livello funzionale essa promuove la biogenesi ribosomiale, controlla la duplicazione dei centrosomi durante il ciclo cellulare, modula la trascrizione di geni oncosoppressori quali p53 ed è in grado di regolare funzione e stabilità di diverse proteine nucleari. Il gene NPM, oltre a rappresentare un gene coinvolto in differenti riarrangiamenti cromosomici che caratterizzano leucemie e linfomi (Bischof D et al, Mol Cell Biol 1997) esso può andare incontro a 75

mutazioni a livello di uno degli esoni che lo compongono, l esone 12, con una conseguente aberrante localizzazione citoplasmatica della proteina (NPMc+), a differenza della forma proteica wild-type che, come già descritto, presenta una localizzazione principalmente nucleolare (NPMc-). E stata proprio questa anomala localizzazione citoplasmatica rilevata mediante metodiche di immunoistochimica a rappresentare il punto di partenza per l identificazione dell esistenza di specifiche mutazioni. Esse sono varie e per questo classificate in modo distinto; quelle di tipo A rappresentano le più frequenti e consistono in una duplicazione tetranucleotidica in posizione 956. Indipendentemente dalla tipologia di mutazione, le sei varianti mutazionali identificate sono caratterizzate dalla presenza di una specifica sequenza amminoacidica in posizione C-terminale derivante dalla perdita di un residuo di triptofano in posizione 288 e 290 con conseguente alterazione del NES (Nuclear Export Signal) motif ed aberrante localizzazione citoplasmatica di NPM1 (Falini B et al, Haematologica 2007; Falini B et al, N Engl J Med 2005). La presenza di mutazioni a carico di NPM1, ed in particolare il genotipo mutated NPM1 without concurrent FLT3 internal tandem duplication (ITD), è dimostrato essere associato ad una prognosi favorevole con ottenimento di buone percentuali di remissione completa di malattia (Falini B et al, N Engl J Med 2005; Marcucci G et al, J Clin Oncol 2011). Sulla base di ciò i casi di LAM con sola mutazione di NPM1 vengono considerati come pazienti a rischio genetico favorevole (Dohner H et al, Blood 2010). La precisazione genotipica mutated NPM1 without concurrent FLT3 internal tandem duplication (ITD) deriva del fatto che diversi lavori hanno suggerito l esistenza di una correlazione meccanicistica tra mutazioni del gene NPM1 ed alterazioni di FLT3 (Falini B et al, N Engl J Med 2005; Dohner K et al, Blood 2005). FLT3 è un gene mappato sul cromosoma 13q21 che codifica per una proteina recettoriale ad attività tirosin-chinasica di classe III, costituita da 993 aminoacidi, espressa principalmente a livello dei progenitori ematopoietici e con importante ruolo nei processi di proliferazione e differenziamento cellulare. Mutazioni a carico del gene FLT3 sono state descritte nel 25-30% dei pazienti con LAM (Shurin MR et al, Cytokine Growth Factor Rev 1998). La più comune di esse interessa il dominio JM (juxtamembrane domain) di tale gene e consiste in una duplicazione in tandem (internal tandem duplication, ITD) con attivazione costitutiva della relativa proteina che, promuovendo la fosforilazione di Stat5, determina una proliferazione continua ed incontrollata dei precursori ematopoietici (Zheng R and Small D, Leuk Lymphoma 2005). A dispetto della prognosi sfavorevole associata ai casi con mutazione FLT3-ITD (Mrozek K et al, Curr Opin Hematol 2007; Lo Coco F et 76

al, Haematologica 2008) resta invece controversa la rilevanza prognostica dell altra tipologia di mutazione che interessa tale gene e che si verifica, in seguito a piccole inserzioni o delezioni a livello dei codoni D835 e I836 del dominio tirosin-chinasico (FLT3-TKD) (Dhoner H et al, Blood 2010). Accanto alla valutazione morfologica e citochimica ed alle analisi citogenetiche e molecolari, sebbene non di primaria importanza, lo studio immunofenotipico riveste un ruolo di rilievo nella diagnostica delle LAM ed in particolare nei casi con minima differenziazione, nelle leucemie dei megacarioblasti ed in tutte quelle forme di leucemia acuta che presentano un ambiguo lineage cellulare. Inoltre, l analisi immunofenotipica può svolgere un ruolo speculativo se si fa riferimento alla presenza o assenza di particolari antigeni che possono ritrovarsi in associazione a specifiche anomalie citogenetiche, quali ad esempio la presenza dell antigene CD19 e, più raramente, degli antigeni CD7 e CD56 nelle LAM con t(8;21) (Kita K et al, Blood 1992; Baer MN et al, Blood 1997), dell antigene CD2 nelle LAM con inv(16) (Adriaansen HJ et al, Blood 1993) o l assenza o debole espressione dell antigene CD34 nei casi di LAM con mutazioni di NPM1 (Falini B et al, N Engl J Med 2005). Di qui l importanza, anche nel contesto delle LAM, di un approccio diagnostico integrato che consenta nel più breve tempo possibile una accurata definizione della patologia stabilendone la categoria di rischio e dunque il migliore e più appropriato approccio terapeutico. 77

SCOPO DELLO STUDIO Come sottolineato, l analisi immunofenotipica nel contesto nelle LAM svolge un ruolo marginale rispetto alle patologie linfoidi. Ciononostante, a parte la possibilità di valutare la presenza o meno di un determinato antigene in uno specifico contesto, lo studio immunofenotipico permette anche una più fine definizione e quantificazione dei livelli di espressione antigenica mediante l utilizzo dei parametri di MFI ed ABC. In particolare, nell ambito delle LAM, uno degli antigeni praticamente presente nella quasi totalità dei casi, è rappresentato dall antigene CD33. Si tratta di una glicoproteina monomerica transmembrana con peso molecolare pari a 67 kda appartenente alla famiglia delle sialoadesine. Fisiologicamente, la sua espressione è ristretta ai progenitori ematopoietici della linea mielomonocitaria ed alle più mature cellule mieloidi risultando invece assente a livello delle cellule staminali ematopoietiche pluripotenti e dei progenitori della linea linfoide. Essendo presente nell 85-90% dei casi di LAM, esso ha rivestito nel tempo una importanza clinica sempre maggiore in qualità di antigene tumore-associato e come potenziale target di terapie con AcMo (Lowenberg B et al, Blood 2010; Burnett AK et al, J Clin Oncol 2011). Alla luce di ciò, lo scopo di tale studio è stato quello di valutare la presenza di una eventuale correlazione tra l espressione qualitativa e quantitativa dell antigene CD33 e la presenza di mutazioni a carico dei geni NPM1 e FLT3. Esse infatti, come discusso precedentemente, rappresentano due delle più frequenti alterazioni molecolari riscontrabili nei casi di LAM che mostrano un normale cariotipo con una maggiore frequenza, in particolare per le mutazioni di NPM1 senza alterazioni di FLT3, nell ambito dei pazienti con età avanzata che potrebbero quindi beneficiare di approcci terapeutici mirati, con minore tossicità rispetto ai regimi chemioterapici standard, quali ad esempio l utilizzo di AcMo anti-cd33, qualora tale antigene si presentasse con intensità di espressione maggiore rispetto ai casi che non mostrano mutazioni a carico di NPM1. 78

MATERIALI E METODI Pazienti In questa analisi sono stati presi in considerazione 99 pazienti affetti da LAM in fase di diagnosi con l esclusione dei casi che presentavano positività alle principali alterazioni genetiche (AML/ETO, Inv16, DEK/CAN, BCR/ABL, MLL) e dei casi che risultavano essere LAM con sottotipo FAB M3. Tutti i casi afferivano alla Divisione di Ematologia del Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia della Sapienza di Roma, arruolati nel protocollo EORTC-GIMEMA 06-991 e consenzienti all utilizzo del proprio materiale biologico a scopo di ricerca. Essi si presentavano con un età mediana pari a 50 anni ed un range compreso tra i 19 e gli 83 anni; il rapporto maschi/femmine risultava essere di 48/51. Al momento dello studio, l esame emocromocitometrico mostrava un valore mediano del numero di globuli bianchi (WBC) pari a 21,200x10 9 /L (range 470-292,000x10 9 /L). L osservazione morfologica degli strisci di sangue midollare unitamente ai risultati delle analisi citochimiche, hanno permesso la suddivisione dei pazienti secondo FAB così come segue: 3 casi di LAM M1, 28 casi di M2, 36 casi di M4, 10 casi di M5, 5 casi di M6 e 4 casi di M7. In 13/99 casi la valutazione diagnostica è stata eseguita su campioni di sangue venoso periferico e per tale motivo non è stato possibile eseguire la classificazione secondo FAB. Analisi immunofenotipica Con lo scopo di caratterizzare immunofenotipicamente in fase diagnostica i casi di LAM analizzati, sono stati valutati 86 campioni da sangue midollare e 13 da sangue venoso periferico. Come già precedentemente descritto (Lucio P et al, Leukemia 2001), specifici quantitativi di campione di sangue intero sono stati incubati con apposite combinazioni costituite da differenti anticorpi coniugati con i fluorocromi FITC (fluorescin isothiocyanate), PE (phycoerythrin), PerCP (peridinclorophyll protein), APC (allophycocyanin) (Tabella 1). Con eccezione degli anticorpi anti-mpo, CD3, CD79-a e CD117 (Immunotech Coulter Company, Marseille, France) ed anti-glicoforina-a (Dako, Glostrup, Denmark), tutti gli altri utilizzati erano di produzione BD (BD, Biosciences, San Jose, CA). L acquisizione dei campioni così processati è stata effettuata utilizzando il citofluorimetro FACSCalibur (BD, Biosciences) con il salvataggio di almeno 30,000 eventi per ciascun tubo acquisito. L analisi dei dati è stata effettuata utilizzando il programma PAINT-A- 79

GATE (BD, Biosciences). La positività dei differenti antigeni analizzati nei diversi campioni è stata stimata valutando la proporzione delle cellule positive per ciascuno di essi con un cut-off pari al 20%. Espressione dell antigene CD33 Con l intento di valutare l intensità di espressione dell antigene CD33, coniugato al fluorocromo PE, è stato incluso nel pannello di combinazioni utilizzate in fase diagnostica e poi utilizzato per le successive valutazioni. La sua espressione è stata valutata in primo luogo determinando, nell ambito della popolazione leucocitaria totale, la percentuale di cellule leucemiche che risultavano positive. In secondo luogo l espressione è stata quantificata, determinando i valori di MFI ed ABC. Per tali determinazioni sono stati utilizzati rispettivamente il software CELLQuest (BD Biosciences) ed il sistema QuantiBRITE (BD Biosciences), il secondo dei quali - utilizzabile solo per la valutazione di antigeni riconosciuti da AcMo PE-coniugati - si avvale del software QuantiCALC per la conversione del segnale citofluorimetrico emesso dal CD33 in numero di molecole di anticorpo legate per cellula. I valori di MFI ed ABC relativi all antigene CD33 sono stati determinati utilizzando la medesima combinazione anticorpale per tutti i 99 campioni inclusi nello studio allo scopo di ridurre al minimo la variabilità legata alla metodologia utilizzata e meglio apprezzare le eventuali differenze riscontrate tra paziente e paziente (Tabella 1). Analisi molecolare ed immunoistochimica Accanto alla valutazione fenotipica dell espressione dell antigene CD33, lo studio è stato condotto anche con lo scopo di associare tale espressione alla eventuale presenza di mutazioni nell esone 12 del gene NPM1 valutate mediante sequenziamento genico (Falini B et al, N Egl J Med 2005) o alla localizzazione sub-cellulare della relativa proteina identificata utilizzando metodiche di immunoistochimica eseguite sui rispettivi campioni di biopsia ossea (Falini B et al, Blood 2006). L analisi ha riguardato anche la valutazione della presenza di mutazioni a livello degli esoni 11 e 17 del gene FLT-3 (sia FLT3-ITD che D835) mediante tecniche di PCR multiplex e successiva elettroforesi, come precedentemente descritto (Noguera NI et al, Leukemia 2002). 80

RISULTATI E DISCUSSIONE Il razionale alla base di tale studio risiede nella constatazione che, seppur presente nella quasi totalità dei casi di LAM (Jilani I et al, Am J Clin Pathol 2002), con l esclusione dei pazienti che presentavano un sottotipo FAB M3, l antigene CD33 mostrava un espressione differenziale. L intento è stato quello di valutare se tali differenze di espressione potessero o meno associarsi alla presenza di alterazioni a carico di geni che rappresentano quelli più frequentemente mutati nel sottogruppo delle LAM con cariotipo normale (Falini B et al, N Engl J Med 2005). Infatti, considerata la recente introduzione di tali entità come sottogruppi ben distinti nell ambito della classificazione WHO delle neoplasie ematologiche (Arber DA et al, WHO Classification 2008), sono state valutate, in primo luogo, le alterazioni a carico di NPM1 e successivamente l associazione con eventuali mutazioni a carico di FLT3. Così come anticipato, tutti i 99 casi di LAM presi in considerazione risultavano essere positivi all antigene CD33 con una mediana relativa alla percentuale di positività pari al 71% (range 13-94%). Considerando i risultati dell analisi mutazionale del gene NPM1, dei 99 casi analizzati, 43/99 mostravano alterazioni di NPM1 identificate mediante screening mutazionale e/o per accumulo citoplasmatico della proteina NPM1 valutato mediante metodiche di immunoistochimica. Dei 43 casi con alterazioni di NPM1, in 34 è stato eseguito un sequenziamento diretto per identificare con esattezza la tipologia di mutazione del gene NPM1. Da quest ultima analisi è emerso che 27 casi mostravano una mutazione di tipo A, 5 di tipo B e 2 di tipo D. L assenza di alterazioni di NPM1 è stata documentata in tutti i 56 casi rimanenti; di questi, in 44 casi dimostrata mediante analisi immunoistochimica che rilevava una normale localizzazione nucleare della proteina NPM1. Solo in 15 dei 44 casi analizzati mediante immunoistochimica, è stata confermata l assenza di mutazioni mediante sequenziamento diretto. Al contrario, nei rimanenti 12 casi dei 56 pazienti non mutati, è stata eseguita solo l analisi mutazionale dell esone 12 del gene NPM1 senza valutazione immunoistochimica della rispettiva proteina. Considerando l associazione tra l espressione dell antigene CD33 e la presenza o meno di mutazioni a carico di NPM1, sono state riscontrate significative differenze (Figura 1). In particolare, nei 43 pazienti NPM1c+ è stato riscontrato un valore mediano di MFI pari a 429 (range 15-1,806) e significativamente diverso (p=0.0001) rispetto a quanto evidenziato nei casi che non presentavano mutazioni, per i quali il valore mediano risultava pari a 210 (range 27-990) (Figura 2). La 81

valutazione dell intensità di espressione dell antigene CD33 mediante sistema QuantiBRITE è stata eseguita in 31 casi; anche in questo caso dal confronto del gruppo dei pazienti mutati con quello dei non mutati è emersa una differenza statisticamente significativa (p=0.0088) (Figura 2). Infatti, i 12 casi mutati dei 31 analizzati per ABC mostravano un valore mediano pari a 11,016 (range 2,690-19,264) contrariamente ai rimanenti 19 casi con assenza mutazioni a carico di NPM1 che mostravano un valore mediano di ABC significativamente inferiore e pari a 3,803 (range 288-15,941). Inoltre, prendendo in considerazione tutti i pazienti con mutazioni di NPM1 e distinguendo in analisi la popolazione di cellule leucemiche dal normale residuo mieloide presente in ciascun campione, sono state riscontrate differenze significative nell intensità di espressione dell antigene CD33, con valori più elevati di MFI ed ABC nella popolazione patologica rispetto alla popolazione mieloide residua (p=0.038 e p=0.007, rispettivamente) (Figura 3A). Contrariamente, nessuna differenza di intensità di espressione, tra popolazione patologica e popolazione residua normale, è stata riscontrata nel gruppo dei pazienti senza mutazioni di NPM1 (Figura 3B) a dimostrazione del fatto che sembrerebbe proprio la presenza del gene NPM1 mutato a conferire alla cellula peculiari caratteristiche fenotipiche. A latere di tutto ciò, visto quanto già riportato in letteratura in merito alla relazione tra NPM1 e conta dei globuli bianchi (Falini B et al, N Engl J Med 2005), anche nella casistica considerata in questo studio è stata valutata tale associazione. Significative differenze sono state riscontrate tra il gruppo dei pazienti NPM1-mutati ed il gruppo di quelli non mutati con valori mediani di WBC pari a 47,570x10 9 /L, (range 1,520-228,800x10 9 /L) e a 8,480x10 9 /L, (range 470-292,000x10 9 /L), rispettivamente (p=0.027). Infine, in accordo con quanto già riportato (Falini B et al, N Engl J Med 2005; Falini B et al, Blood 2010), nell ambito dei pazienti con mutazioni a carico di NPM1 si evidenziava una più elevata percentuale di casi con negatività dell antigene CD34 (79%) rispetto al gruppo dei pazienti con assenza di mutazioni (32%) (Figura 1). Accanto all analisi delle mutazioni di NPM1, vista la loro stretta associazione con la presenza di mutazioni a carico del gene FLT3, in 22 dei 99 pazienti analizzati (22.2%) è stato preso in considerazione anche tale gene. Nell ambito dei pazienti analizzati, 18/22 mostravano la mutazione FLT3-ITD, 3/22 la mutazione a livello del dominio chinasico FLT3-D835 mentre in 1 solo paziente sono state riscontrate entrambe le tipologie. In accordo con le precedenti osservazioni (Falini B et al, N Engl J Med 2005; Martelli MP et al, Blood 2010), i casi FLT3 mutati ricadevano principalmente nel gruppo dei pazienti mutati anche per NPM1: 18/43 (41.8%) risultavano FLT3+/NPM1+ mentre solo 4 casi erano FLT3+/NPM1- (7%). 82

Questa analisi ha, inoltre, dimostrato come le mutazioni di FLT3 sembrino non influenzare l espressione dell antigene CD33 a livello della popolazione leucemica. Infatti, come mostrato in Figura 2 quando venivano considerati i due gruppi NPM1+/FLT3+ ed NPM1+/FLT3- nessuna differenza significativa si registrava in termini di MFI (p=0.38) ed ABC (p=0.72). Presi insieme questi risultati dimostrano come, sebbene sia dimostrabile una stretta associazione tra la presenza di mutazioni a carico di FLT3 e la contemporanea presenza di quelle a carico di NPM1, le alterazioni del gene FLT3 non eserciterebbero alcuna influenza sulla intensità di espressione dell antigene CD33 a livello della popolazione mieloide patologica. Infine, tale studio si inserisce perfettamente nel contesto delle implicazioni cliniche che una determinazione antigenica può comportare, in particolare nell ambito delle LAM. Una elevata espressione dell antigene CD33 implicherebbe, infatti, un più efficiente legame di un eventuale AcMo per esso specifico utilizzato e conseguentemente un più efficace trasporto del farmaco chemioterapico ad esso coniugato. Per tale motivo, considerando anche quanto già dimostrato nella leucemia acuta promielocitica (LAM M3) (Breccia M et al, E Opin Biol Therapy 2011), un sottotipo FAB che esprime il CD33 ad altissima intensità, potenzialmente tutti i casi di LAM le cui cellule leucemiche siano caratterizzate da una elevata intensità di espressione dell antigene CD33, avrebbero maggiori probabilità di beneficiare di trattamenti specifici con AcMo e chemioterapici ad essi coniugati. Specificamente, questo studio ha messo in evidenza come i casi di LAM con cariotipo normale e mutazioni a carico del gene NPM1 mostrino una espressione antigenica del CD33 significativamente superiore rispetto ai casi che non presentano tale alterazione come a suggerire la possibilità di utilizzare tale comportamento fenotipico a fini clinici per una migliore gestione terapeutica di un sottogruppo così specifico di pazienti, spesso in avanzato stato di età. 83

Tabella 1: Combinazioni anticorpali utilizzate per la caratterizzazione diagnostica dei pazienti analizzati. Gli AcMo sono ordinati secondo le fluorescenze utilizzate: FITC, PE, PerCP, APC. In grassetto e riportata la combinazione utilizzata per la determinazione dei valori di MFI ed ABC relativi all antigene CD33. MPO/cCD79-a/cCD3 CD34/CD117/CD4/HLA-DR CD34/CD33/ CD13/ HLA-DR CD15/CD11-b/CD45/CD34 CD16/CD11-b/CD45/CD34 CD7/CD56/CD33/CD34 CD2/CD14/CD45/CD34 CD41-a/CD13/CD33/CD34 CD61/CD13/CD33/CD34 CD45/Glicoforina-A c: citoplasmatico 84

Figura 1: (A) Espressione dell antigene CD34 e localizzazione subcellulare della proteina NPM1. (B) La regione sinistra della figura mostra la negatività o positività del CD34 rispettivamente nei casi NPMc+ ed NPMc- mentre nella regione destra è possibile osservare le differenze di intensità di espressione dell antigene CD33 in termini di MFI ed ABC tra i casi di LAM con mutazioni di NPM1 e quelli che non risultano mutati. 85

Figura 2: Espressione differenziale dell antigene CD33 a livello della popolazione leucemica, in termini di MFI ed ABC nei casi che presentano mutazioni di NPM1 rispetto ai casi con assenza di mutazioni. 86

Figura 3: A) Espressione differenziale dell antigene CD33 in termini di MFI ed ABC tra la popolazione leucemica e quella mieloide residua nei casi che presentano mutazioni di NPM1 rispetto ai casi con assenza di mutazioni; B) Espressione dell antigene CD33 nella popolazione normale mieloide residua nei due gruppi di pazienti considerati. 87

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CAPITOLO III PROGETTO IV: Valutazione dell espressione della proteina p53 in pazienti affetti da leucemia linfatica cronica: quanto l espressione aberrante valutata attraverso metodiche di immunocitochimica rappresenti un surrogato della presenza di mutazioni e/o delezioni a livello del gene TP53 Marinelli M*, Raponi S*, Del Giudice I, De Propris MS, Nanni M, Intoppa S, Milani ML, Mauro FR, Guarini A and Foà R (*equal contribution). Is the aberrant expression of p53 by immunocytochemistry a surrogate marker of TP53 mutation and/or deletion in Chronic Lymphocytic Leukemia? American Journal of Clinical Pathology, 2011;135(1):173-4. 92

INTRODUZIONE La Leucemia Linfatica Cronica (LLC) rappresenta il disordine linfoproliferativo più diffuso nell emisfero occidentale e si caratterizza per la presenza di una proliferazione ed un successivo accumulo di piccoli linfociti nel midollo osseo, nel sangue venoso periferico e nei tessuti linfatici. Nonostante essa presenti un fenotipo immunologico unico e distintivo (CD20+, CD5+, CD23+, Ig kappa+ o Ig lambda+, CD200+), le sempre nuove acquisizioni ottenute soprattutto in ambito biologico, hanno permesso nel tempo una sempre migliore definizione diagnostica di tale patologia e, di conseguenza, l identificazione di entità clinico-biologiche all interno delle quali le caratteristiche biologiche e genetiche del clone leucemico rendono ragione del diverso andamento clinico della malattia. Mentre in alcuni casi ci si trova di fronte ad una patologia relativamente stabile con una lunga sopravvivenza, in altri pazienti si assiste ad un decorso clinico molto più aggressivo con la necessità di un rapido e tempestivo intervento terapeutico (Rozman C and Monserrat E, N Engl J Med 1995; Caligaris-Cappio F and Hamblin TJ, J Clin Oncol 1999). Lo stato mutazionale della regione variabile delle catene pesanti delle immunoglobuline (IgHV) (Damle RN et al, Blood 1999), la presenza o meno di specifiche alterazioni citogenetiche (Dohner H et al, Blood 1995), unitamente alla valutazione dell espressione dell antigene di attivazione cellulare CD38 e della proteina con attività trasduzionale ZAP-70 (Gentile M et al, Br J Haematol 2005; Crespo M et al, N Engl J Med 2003) consentono, oggi, una corretta stratificazione alla diagnosi dei pazienti affetti da LLC svolgendo un ruolo predittivo nella definizione della progressione di malattia e quindi delle percentuali di sopravvivenza (Gentile M et al, Curr Opin Oncol 2005; Montserrat E, Am Soc Hematol Educ Program 2006). E stato inoltre recentemente dimostrato come alterazioni a carico di geni quali NOTCH1 piuttosto che SF3B1 risulterebbero essere particolarmente importanti per una ulteriore suddivisione dei pazienti che, ad un primo screening, non mostrerebbero presenza di altri fattori prognostici noti (Del Giudice I et al, Haematologica 2012; Rossi D et al, Blood 2011). Accanto a tutto ciò, un importante parametro con rilevante ruolo prognostico in corso di LLC è rappresentato dalle alterazioni a carico di TP53 (Cordone I et al, Blood 1998), un gene oncosoppressore che, in seguito ad inattivazione mutazionale e/o delezione, causerebbe un incremento della suscettibilità allo sviluppo di svariate tipologie di tumori (Wickremasinghe RG et al, Leukemia 2011). Tale gene, infatti, codifica una proteina coinvolta nei pathways di risposta allo stress cellulare; in particolare esso svolgerebbe un ruolo cruciale nella regolazione dell arresto del ciclo cellulare e dei meccanismi di apoptosi in seguito a danno al DNA (Zenz T et al, Cell Cycle 93

2008) (Figura 2). Di conseguenza, i pazienti affetti da LLC che presentano mutazioni a carico di TP53 mostrano un elevato indice di sopravvivenza con alterazione dei meccanismi di apoptosi indotta in seguito ad esposizione in vitro a radiazioni ionizzanti (Stankovic T et al, Blood 2004). Inoltre, difetti a livello del gene TP53 sono risultati fortemente associati a casi di LLC con fenotipo aggressivo, sfavorevole outcome clinico e con fenomeni di resistenza a specifiche tipologie di farmaci (Wattel E et al, Blood 1994; Dohner H et al, Blood 1995). Attualmente è possibile identificare alterazioni di p53 attraverso l utilizzo di differenti metodologie che possono prendere in considerazione sia la proteina, mediante immunoistochimica (IHC), immunocitochimica (ICC), Western blotting o citometria a flusso, che il gene TP53, mediante tecnica FISH, DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography), AmpliChip p53 e sequenziamento automatico diretto. Con riferimento alle metodologie che prendono in considerazione il gene TP53, mentre l analisi FISH identifica la presenza di ampie delezioni che interessano l intero gene presente su un allele, le altre metodologie elencate consentono l identificazione, nell ambito della sequenza genica, della presenza di mutazioni e/o polimorfismi. L espressione di p53 a livello proteico può essere, invece, valutata sia attraverso metodiche di IHC ed ICC che attraverso l utilizzo di Western blotting. Le prime due, mediante utilizzo di anticorpi monoclonali anti-p53 permettono di identificare la proteina accumulata a livello nucleare mentre l altra è in grado di rilevarne la presenza a livello delle cellule leucemiche sempre utilizzando anticorpi monoclonali anti-p53 ma valutandone la positività prima in condizioni basali e successivamente ad esposizione cellulare a dosi specifiche di radiazioni ionizzanti. I meccanismi che portano all inattivazione del gene TP53 possono essere differenti. In primo luogo sicuramente le delezioni che si verificano a livello della regione che contiene tale gene, localizzata sul braccio corto del cromosoma 17 (del17p13.1) (Dohner H et al, Blood 1995) e responsabile delle iniziali evidenze del ruolo svolto dal gene TP53 nella LLC. Accanto a ciò, la modesta grandezza del gene (11 esoni, 393 amminoacidi) ha permesso anche lo studio dell intera regione codificante consentendo l identificazione di specifiche mutazioni nella sua sequenza. Contrariamente ad altri geni oncosoppressori, le mutazioni che coinvolgono il gene TP53 sono per la maggior parte mutazioni missenso responsabili di un singolo cambio ammioacidico in posizioni differenti del gene, più frequentemente a livello del dominio di legame al DNA. Esse possono essere, quindi, di tipo diverso, nel contesto della sequenza, e per questo mostrare un impatto differente sulla struttura e quindi sulla funzione della relativa proteina, permettendo l identificazione di un vero e proprio pattern mutazionale. In alcuni casi possono riscontrarsi anche mutazioni frameshift e nonsenso che 94

determinando la formazione di una proteina tronca non causano, a differenza di quanto avviene in presenza di mutazioni missenso, accumulo proteico a livello cellulare. Accanto a quanto descritto, l inattivazione del gene TP53 può avvenire anche in seguito ad alterazioni del gene ATM, principale attivatore di TP53, a causa di mutazioni dello stesso o di delezione nella regione 11q (del11q) a livello della quale esso si localizza (Austen B et al, Blood 2005). Infine, in maniera analoga, alterazioni di MDM2, regolatore negativo di TP53 può risultare responsabile dell accumulo cellulare di quest ultima (Vousden KH and Lu X, Nat Rev Cancer 2002). Mutazioni di TP53 sono riscontrabili in circa il 10% dei casi di LLC in fase di diagnosi (Rossi D et al, Clin Cancer Res 2009) con un incrementata incidenza nell ambito dei casi in progressione di malattia ed, ancor piu, in quei casi resistenti al trattamento con fludarabina (Lozanski G et al, Blood 2004). Con una simile frequenza, la delezione a livello della regione 17p si verifica in circa il 7% dei casi di LLC che non hanno ricevuto alcun trattamento terapeutico (Dohner H et al, N Engl J Med 2000). Nonostante molti studi abbiano evidenziato una significativa correlazione tra la del(17p) e la presenza di mutazioni (Zenz T et al, Blood 2008; Rossi D et al, Clin Cancer Res 2009), esiste comunque una percentuale di casi, pari al 4-5% circa, che presenta mutazioni a carico del gene TP53 in assenza della rispettiva delezione (Zenz T et al, Blood 2008; Rossi D et al, Clin Cancer Res 2009). Resta però controversa ed ampiamente discussa la capacità della sola mutazione di conferire lo stesso profilo biologico, medesime caratteristiche cliniche ed outcome sovrapponibile a quanto si rileva nei casi con presenza di delezione. Ad ogni modo, la maggiore incidenza di mutazioni di TP53 riscontrata nei pazienti resistenti a specifiche terapie, rispetto ai pazienti valutati nella fase di diagnosi, suggerirebbe un coinvolgimento diretto del gene nell evoluzione clonale della malattia e quindi la presenza di un link biologico tra i fenomeni di resistenza e le mutazioni del gene. In uno studio di Zenz e colleghi, è stato per la prima volta dimostrato, in analisi multivariata, l impatto prognostico delle mutazioni di TP53 (senza delezione 17p) e la loro indipendenza dagli altri fattori con ormai riconosciuto valore prognostico, quali stato mutazionale delle IgVH, del(11q), del(17p), stadio di malattia, ecc. (Zenz T et al, Blood 2008). Tutto ciò è stato poi successivamente confermato da un altro studio condotto su un ampia casistica di pazienti in fase di diagnosi (Rossi D et al, Clin Cancer Res 2009) dove è stato dimostrato come casi di LLC con presenza di mutazioni senza delezione mostravano medesime caratteristiche clinico-biologiche rispetto al più frequente subset di LLC con sola delezione 17p, dimostrando come le mutazioni del gene TP53 rappresentino 95

un fattore indipendente e predittivo di una minore sopravvivenza e sviluppo di fenomeni di chemioresistenza. Dunque, il solo screening citogenetico mediante FISH, nei pazienti affetti da LLC in fase diagnostica, cosi come previsto dalle linee guida (Hallek M et al, Blood 2008), causerebbe una esclusione di quei casi che seppur negativi per la presenza della delezione 17p, presentano invece mutazioni a carico del gene TP53. Ciò, risulta estremamente importante nel contesto della gestione clinica e quindi dei trattamenti terapeutici utilizzabili nei pazienti affetti da LLC. Agenti alchilanti quali il clorambucile hanno rappresentato per molti anni una pietra miliare nel trattamento di tale patologia. Alla fine degli anni 90 però, la dimostrata efficacia degli analoghi delle purine nel trattamento della LLC, ha portato ad un progressivo spostamento verso l utilizzo di tali agenti nei trattamenti di prima linea. Tale trend è stato senza dubbio accelerato da lavori che, nonostante la maggiore tossicità, hanno messo in evidenza la netta superiorità di tali farmaci rispetto a quanto ottenuto con il clorambucile in termini di remissione di malattia, sia dal punto di vista della qualità che della durata. A dispetto di tale giustificato ottimismo però vanno sicuramente considerati i casi in cui si osserva una resistenza all utilizzo di tali farmaci che, per essere compresa, richiede ovviamente una ampia comprensione dei meccanismi di azione del farmaco a livello cellulare. A tal proposito, tenendo presente il ruolo svolto dall oncosoppressore p53 nell indurre morte cellulare in seguito a trattamento con analoghi delle purine quali la fludarabina e considerata la disponibilità di trattamenti di prima linea basati sull utilizzo di farmaci che agiscano indipendentemente dai pathways di danno al DNA p53-mediato (quali AcMo o elevate dosi di steroidi), risulta estremamente utile stratificare i pazienti anche sulla base della presenza di mutazioni a carico del gene TP53. 96

SCOPO DELLO STUDIO La tempestiva identificazione di parametri biologici che siano in grado di predire anticipatamente la natura indolente o progressiva del clone leucemico riveste particolare importanza nel contesto della LLC soprattutto alla luce delle molteplici opzioni terapeutiche disponibili per il trattamento dei pazienti affetti da tale patologia. Accanto ai già noti fattori prognostici, la correlazione identificata tra la presenza della del(17p) ed un profilo prognostico ben definito e caratterizzato da una più rapida progressione di malattia e, in molti casi, da fenomeni di resistenza a specifici trattamenti chemioterapici, ha messo in evidenza il ruolo svolto dal gene TP53 nel contesto della LLC. La presenza di mutazioni a suo carico, causerebbe un alterato comportamento della proteina risultante con conseguenti alterazioni strutturali e funzionali responsabili di un vantaggio di crescita e sopravvivenza cellulare che determinerebbero ad una espansione incontrollata del clone leucemico. Alla luce di ciò, assume una importanza clinica rilevante l esecuzione di un rapido screening dello stato del gene TP53 nei pazienti con diagnosi di LLC. A tal riguardo, in uno studio condotto da Chang e colleghi (Chang H et al, Am J Clin Pathol 2010) si evidenziava la possibilità mediante metodica IHC di identificare in maniera rapida e praticamente tutti i casi che, all analisi FISH, mostravano del(17p), con una concordanza tra i due metodi superiore al 90%. Inoltre, sulla base delle associazioni precedentemente identificate tra accumulo proteico e mutazioni del rispettivo gene (Cordone I et al, Blood 1998) e tra mutazioni geniche e delezione cromosomica (Zenz T et al, Blood 2008), il lavoro di Chang e colleghi concludeva che, sebbene la loro casistica non fosse stata valutata sotto il profilo dell analisi mutazionale, l analisi IHC avrebbe potuto comunque rappresentare un surrogato tanto della del(17p) quanto della presenza di mutazioni a livello dell allele del gene non deleto. Tali conclusioni hanno fornito lo spunto per l analisi effettuata in questo studio. Lo scopo è stato quello di valutare in maniera retrospettiva, in una coorte di 440 pazienti affetti da LLC, disfunzioni di TP53 attraverso il confronto di due differenti metodologie: il sequenziamento diretto degli esoni 5-8 del gene TP53 e l analisi mediante ICC dell accumulo della proteina p53 a livello cellulare. Ciò con l intento di indagare quanto l utilizzo di metodologie in grado di identificare l aberrante espressione proteica, potesse rappresentare un surrogato dell analisi della presenza di mutazioni e/o delezioni del gene TP53 in pazienti affetti da LLC. 97

MATERIALI E METODI Pazienti Nella presente analisi sono stati presi in considerazione retrospettivamente 440 pazienti affetti da LLC afferenti alla Divisione di Ematologia del Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia della Sapienza di Roma. Di questi, il 36% è stato valutato al momento della diagnosi, il 53% alla prima progressione di malattia, mentre l 11% dei casi risultava in recidiva di malattia o resistente ad una o più linee di chemioterapia. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato per l esecuzione di tali studi biologici. L intera casistica analizzata rispondeva ai criteri stabiliti per la diagnosi di LLC. Oltre a presentare una linfocitosi periferica, con un numero di linfociti 5000x10 9 /L, ciascun caso mostrava una morfologia caratteristica ed all analisi immunofenotipica risultava positivo per gli antigeni CD20, CD5, CD22, CD23 con restrizione clonale per le catene leggere delle immunoglobuline Ig kappa o Ig lambda, espresse a debole intensità. Al momento dello studio i pazienti si presentavano con una età mediana pari a 52 anni (range 32-86) ed un valore mediano di globuli bianchi pari a 53,566 x10 9 /L (range: 5,500-511,400 x10 9 /L). In tutti i casi presi in considerazione è stato valutato l accumulo proteico mediante metodiche di ICC; l analisi mutazionale del gene TP53 è stata eseguita mediante sequenziamento diretto degli esoni più frequentemente mutati (esoni 5, 6, 7, 8). In 300/440 casi è stata inoltre valutata la presenza della del17p mediante metodiche di FISH (Guarini A et al, Blood 2003), prendendo come riferimento un cut-off di positività pari al 10%. ICC Le cellule mononucleate sono state separate da ciascun campione di sangue venoso periferico, raccolto in provette contenenti EDTA come anticoagulante, mediante separazione ficoll su gradiente di densità ed utilizzate per la preparazione di citocentrifugati ad una concentrazione di 3-5x10 4 cellule per ciascun vetrino. In seguito a fissazione delle cellule su vetrino mediante essiccamento all aria per circa 16-18 ore, le cellule sono state tipizzate o, qualora non fosse stato possibile eseguire subito la tipizzazione, congelate a -20 C in ambiente secco, per permettere il mantenimento delle caratteristiche antigeniche della cellula. 98

La reazione immunocitochimica è stata eseguita utilizzando la tecnica dell immunoperossidasi (IP) che permette di rilevare la presenza di antigeni intracitoplasmatici e nucleari grazie all impiego di anticorpi coniugati con l enzima perossidasi di rafano. Per mezzo di tale reazione enzimatica, gli antigeni vengono riconosciuti da anticorpi primari, generalmente monoclonali, a loro volta riconosciuti da anticorpi secondari e terziari coniugati con l enzima perossidasi. Per l esecuzione di tale studio, in qualità di anticorpo primario è stato utilizzato l anticorpo monoclonale anti-p53, clone DO-7 (Dako, Glostrup, Denmark), diluito 1:50 in soluzione salina PBS. Esso è in grado di riconoscere i residui amminoacidici 35-45 della regione N-terminale sia della forma wild-type che mutata della proteina p53. Come anticorpo secondario è stato utilizzato l anticorpo RαM (Rabbit anti-mouse) (P260, Dako) e come terziario l anticorpo SαR (Suine anti- Rabbit) (P217, Dako). L utilizzo della DAB (diammino benzidina) come substrato cromogeno, in presenza di perossido di idrogeno ha permesso all enzima perossidasi di sviluppare una colorazione marrone nel sito cellulare in cui si localizzava l antigene, identificabile mediante colorazione di contrasto. Citocentrifugati ottenuti dalla linea cellulare Raji sono stati utilizzati come controllo della avvenuta reazione con l anticorpo primario anti-p53. Tali cellule, infatti, presentano mutazioni a livello di entrambi gli alleli del gene TP53 con conseguente aumento della concentrazione intracellulare della rispettiva proteina, per questo utilizzabili come controlli positivi. La proporzione delle cellule positive per p53 è stata valutata utilizzando un microscopio ottico e calcolando la percentuale di cellule che risultavano intensamente colorate a livello nucleare su un totale di 500 cellule per campione (Figura 2). La positività dei campioni per accumulo della proteina p53 a livello nucleare è stata stabilita considerando un cut-off di riferimento al 10%. 99

RISULTATI E DISCUSSIONE In corso di LLC, è ormai dimostrato come l identificazione di alterazioni a carico del gene TP53 risulti strettamente associata ad una patologia aggressiva, resistente a particolari regimi terapeutici e quindi con uno scarso indice di sopravvivenza (Oscier DG et al, Blood 2002; Krober A et al, Blood 2002; Dohner H et al, Blood 1995). Tale parametro biologico si è, inoltre, dimostrato particolarmente importante nella scelta del trattamento terapeutico fino a consentire l indicazione al trapianto allogenico di cellule staminali (Dreger P et al, Leukemia 2007). Sulla base di tali constatazioni, in questo studio è stato valutato il ruolo che l aberrante espressione proteica a livello cellulare potesse svolgere come eventuale valido surrogato della presenza di aberrazioni a livello del gene TP53 dovute alla presenza di mutazioni geniche e/o delezioni cromosomiche. Tale analisi ha fatto seguito alla pubblicazione di un lavoro condotto da Chang e colleghi (Chang H et al, Am J Clin Pathol 2010) nel quale veniva sottolineata la possibilità di predire la presenza di delezione di TP53 mediante identificazione di accumulo nucleare della rispettiva proteina tramite l utilizzo di metodiche di IHC. Considerata inoltre la possibilità di eseguire tali metodiche in maniera rapida e con costi contenuti, l analisi immunoistochimica della proteina p53 diverrebbe importante nella pratica clinica per l identificazione di un sottogruppo di pazienti ad elevato rischio biologico per i quali mettere in atto specifici regimi chemioterapici. Infine, nello studio di Chang e colleghi preso come riferimento, si sottolineava che, sebbene non fosse stata eseguita alcuna analisi mutazionale del gene TP53, le evidenze in merito alla stretta associazione tra mutazione e delezione in emizigosi del gene TP53 permettevano di suggerire uno screening mediante analisi IHC come valida alternativa alle più complesse procedure di sequenziamento genico ed analisi citogenetica mediante FISH. Con lo scopo di confermare o meno tali conclusioni, questo studio ha preso in considerazione retrospettivamente un ampia coorte di pazienti affetti da LLC per i quali erano disponibili i risultati ottenuti dall analisi immunocitochimica della proteina p53, dall analisi mutazionale del gene TP53 ed in 300/440 casi totali quelli ottenuti dall analisi FISH. Dei 440 casi analizzati, 19 (4,3%) mostravano un accumulo della proteina p53 in più del 10% delle cellule circolanti mentre in 35 campioni (7,9%) si riscontrava la presenza di mutazioni a livello del gene TP53. Considerando i casi analizzati mediante FISH, dei 300 disponibili, 27 (9%) mostravano del(17p) in più del 10% delle cellule. 100

Con riguardo ai 19 casi che risultavano positivi per accumulo proteico all analisi ICC, solo in 10 casi è stata riscontrata anche presenza di alterazioni di sequenza mentre nei rimanenti 9 casi il sequenziamento genico non rilevava presenza di mutazioni. D altro canto, i casi che risultavano negativi all analisi ICC, 396/421 pazienti, nella maggior parte non presentavano mutazioni geniche ma in 25 casi si evidenziava presenza di alterazioni di sequenza. Da ciò ne deriva che l identificazione di un accumulo proteico evidenziato mediante analisi ICC mostra una sensibilità pari al 29% ed una specificità pari al 98% nell identificare la presenza di eventuali mutazioni a carico del rispettivo gene. Di conseguenza, il valore predittivo positivo (Positive Predictive Value, PPV) ovvero la capacità dell analisi ICC di predire positivamente la presenza di mutazioni ed il valore predittivo negativo (Negative Predictive Value, NPV), ovvero la capacità dell analisi ICC di predire l assenza di mutazioni, risultano rispettivamente pari a 53% e 94%. Confrontando tra loro i risultati derivanti dall analisi ICC con quelli dell analisi FISH è possibile osservare come 7 dei 13 casi che presentavano un accumulo proteico, risultando quindi ICC positivi, mostravano anche la del(17p), laddove i rimanenti 6 casi risultavano essere non deleti. Al contrario, nell ambito dei casi negativi all analisi ICC, mentre la maggior parte (267/287) dei casi risultavano non deleti, in 20 casi era possibile evidenziare la presenza della del(17p). Dunque, andando a valutare la sensibilità e specificità con cui l analisi ICC è in grado di identificare la presenza della del(17p), sono stati ottenuti valori percentuali pari al 26% e 98%, rispettivamente. Inoltre, analogamente a quanto identificato nel contesto del confronto tra ICC ed analisi di sequenza, anche in questo caso è stato possibile calcolare il PPV ed il NPV che sono risultati pari a 54% e 93%, rispettivamente. Analizzando complessivamente i risultati ottenuti da tale studio emerge che, basandosi sui valori ottenuti dall analisi ICC, 25 dei 35 casi (71%) mutati a livello del gene TP53 e 20 dei 27 casi (74%) che presentavano del(17p) sarebbero stati considerati come negativi se fosse stata eseguita solo l analisi ICC. Essa, infatti, non ha messo in evidenza alcun accumulo proteico a livello nucleare. Inoltre, focalizzando l attenzione sui casi che mostravano del(17p) in più del 20% dei nuclei analizzati (20 dei 27 pazienti deleti), quindi considerando un cut-off di positività superiore, comunque nel 65% dei casi l analisi della proteina p53 mediante ICC forniva risultati negativi, non consentendo quindi neppure una eventuale associazione tra percentuale di cellule che mostrano delezione e percentuale di cellule che presentano accumulo proteico a livello nucleare. Ad oggi, questa rappresenta una delle più ampie serie di casi che ha avuto come scopo quello di valutare quanto l accumulo cellulare della proteina p53 rappresenti un valido mezzo per identificare 101

quei pazienti affetti da LLC che presentano aberrazioni a carico del rispettivo gene TP53 dovute a mutazioni e/o delezioni dello stesso. In questo contesto l impatto clinico dei casi identificabili come falsi negativi rappresenta l aspetto più rilevante da prendere in considerazione. Come è noto, la tipologia di mutazione che si verifica a livello del gene TP53 può, in alcuni casi, giustificarne alcuni di essi. Infatti, l attenta analisi dei 9 casi tra i 25 (36%) che, nonostante i risultati negativi dell analisi ICC, sono risultati mutati a livello del gene TP53, ha evidenziato la presenza di microdelezioni o mutazioni nonsenso. In condizioni normali, l assenza di mutazioni geniche e quindi la presenza della proteina p53 in forma wild-type, fa si che essa si localizzi a livello nucleare ma possedendo una breve vita media ed essendo presente in piccole quantità, non risulta identificabile mediante le metodologie di analisi proteica quali IHC o ICC. La presenza di mutazioni a carico del gene TP53, in particolare la presenza di mutazioni missenso determina, in molti casi, un incremento della vita media nonché della quantità della proteina, permettendone l identificazione (Greenblatt MS et al, Cancer Res, 1994). Tale meccanismo, non sarebbe pero valido in presenza di mutazioni, quali le nonsenso e le microdelezioni, che determinando la formazione di una proteina tronca o la perdita di una porzione della stessa, non causerebbero alcun accumulo proteico (Greenblatt MS et al, Cancer Res, 1994; Lepelley P et al, Leukemia 1994). Ciò potrebbe quindi giustificare alcuni dei casi falsi negativi (36%) risultanti dall analisi ICC che, in questo studio, presentavano appunto microdelezioni o mutazioni nonsenso. Analogamente, 8 dei 20 casi che risultavano negativi all analisi ICC ma con presenza di del(17p), mostravano la stessa tipologia di mutazione o una configurazione wild-type del rimanente allele del gene TP53. In questo modo, potrebbero giustificarsi il 40% dei casi falsi negativi relativamente al confronto tra analisi ICC e citogenetica. Il suggerimento all utilizzo di un metodo piuttosto che un altro per l analisi di un qualsiasi parametro biologico proviene oltre che dalla presenza di falsi negativi anche dalla presenza di falsi positivi. In questa analisi, seppur considerabili clinicamente meno rilevanti rispetto ai casi falsi negativi, la presenza di casi falsi positivi all analisi ICC, potrebbe essere giustificata con il fatto che l accumulo della proteina p53 può verificarsi anche in assenza di mutazioni del gene TP53. Sono, infatti, descritte potenziali alterazioni addizionali a carico di geni i cui prodotti sono coinvolti nel pathway di p53, giocando un ruolo anche nella stabilizzazione proteica, quali mutazioni e/o delezioni a carico di ATM o over-espressione del gene MDM2 (Zenz T et al, Cell Cycle 2008). Due lavori avevano precedentemente preso in considerazione il ruolo della determinazione immunocitochimica della proteina p53 nei pazienti affetti da LLC. In un primo lavoro, il gruppo di 102

Lepelley e colleghi, metteva in evidenza risultati concordanti tra la valutazione ICC e l analisi mutazionale del gene TP53 in 123/128 (96%) pazienti affetti, però, da differenti patologie ematologiche, tra cui anche casi di LLC (Lepelley P et al, Leukemia 1994). L analisi dei casi risultati essere falsi negativi all analisi ICC, evidenziava, anche in questo caso, la presenza di mutazioni nonsenso a carico di TP53 che determinerebbero presumibilmente una riduzione dei livelli di accumulo della proteina tronca p53. Analogamente, qualche anno più tardi, il nostro gruppo dimostrava il ruolo predittivo dell analisi ICC nell identificare mutazioni geniche in una percentuale pari all 88% dei casi di LLC analizzati (Cordone I et al, Blood 1998). In questo caso, però, non sono stati riportati dati in merito ai casi falsi negativi all analisi ICC ma con anomalie del gene TP53 in quanto in tale studio l analisi molecolare del gene TP53 è stata eseguita soltanto in quei casi che risultavano positivi all ICC. Per concludere, da questa analisi condotta su un ampia serie di casi con diagnosi di LLC emerge come la sensibilità della valutazione di alterazioni di p53 mediante ICC risulta tale da non permettere l utilizzo di tale metodica come unico e valido mezzo per l identificazione di una categoria di pazienti associata ad elevato rischio biologico. Inoltre, sebbene le differenze in termini di risultati ottenuti da tale studio rispetto a quello condotto da Chang e colleghi (Chang H et al, Am J Clin Pathol 2010) possano essere principalmente ascrivibili all utilizzo di due procedure metodologiche differenti, ICC da una parte ed IHC dall altra, utilizzando, però la stessa tipologia di anticorpo anti-p53, non può però non essere considerato come, in più di un quarto dei casi con mutazioni a carico del gene TP53 (9/35), la tipologia di mutazione non determinerebbe alcun accumulo proteico a livello nucleare, rendendone impossibile l identificazione con tecniche quali l ICC. Tali considerazioni risultano ancora una volta estremamente importanti nel contesto dell utilizzo clinico di dati biologici che permettono, ad oggi, una stratificazione dei pazienti in fasce di rischio diverse, nonché l utilizzo di specifiche tipologie di farmaci e, nel caso specifico delle alterazioni di p53, il non utilizzo di altri. 103

Figura 1: Pathway cellulare di p53. Modificato da Badoux XC et al, Curr Hematol Malig Rep (2011). 104

Figura 2: Esempio di positività immunocitochimica della proteina p53 nel nucleo delle cellule di LLC. 105

Tabella 1: a) numero (e valore percentuale) dei casi concordanti e discordanti risultanti dal confronto tra l analisi ICC e l analisi di sequenza del gene TP53; b) numero (e valori percentuali) dei casi concordanti e discordanti risultanti dal confronto tra l analisi ICC e l analisi FISH. a) TP53 mutato TP53 Wild-type ICC 10% 10 (2%) 9 (2%) ICC<10% 25 (6%) 396 (90%) b) Del (17p) 5% Del (17p) <5% ICC 10% 7 (2%) 6 (2%) ICC<10% 20 (7%) 267 (89%) 106

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CAPITOLO IV PROGETTO V: Citofluorimetria e biologia molecolare: metodologie a confronto per la valutazione della malattia minima residua in pazienti adulti affetti da leucemia acuta linfoblastica 111

INTRODUZIONE Attualmente, la disponibilità di molteplici protocolli terapeutici, spesso estremamente specifici, consente l ottenimento di percentuali elevate di remissioni complete di malattia nel contesto dei pazienti affetti da leucemia acuta linfoblastica (LAL). Ciononostante, un numero non trascurabile di casi rispondente ai criteri clinici e morfologici di remissione completa, và incontro a ricaduta di malattia a causa della persistenza a livello midollare di cellule patologiche residue clonali resistenti al trattamento effettuato (Szczepanski T et al, Lancet Oncol 2001). Secondo i criteri attualmente in uso, i pazienti affetti da LAL raggiungono la remissione completa quando, alla valutazione citomorfologica, i blasti a livello midollare costituiscono meno del 5% delle cellule nucleate. Di conseguenza, è intuitivo concludere come l analisi morfologica dell aspirato midollare sia in grado di fornire informazioni limitate circa l effettiva efficacia del trattamento utilizzato, in quanto capace di identificare solo i casi classificabili a cattiva prognosi e che quindi non raggiungono la remissione di malattia. Nell ambito, invece, dei casi che risultano in fase di remissione, tale metodica non è in grado di distinguere i pazienti a basso o elevato rischio di recidiva. Per tali motivi, il monitoraggio della quota di malattia minima residua (MMR) dopo trattamento ha assunto un ruolo sempre maggiore nel contesto della gestione clinica dei pazienti affetti da LAL (Campana D and Pui CH, Blood 1995; Bruggemann M et al, Blood 2006). Valutazioni della riduzione della massa tumorale durante e successivamente al trattamento terapeutico forniscono cruciali informazioni in merito alla risposta alla terapia nonché al rischio di recidiva, permettendo l attribuzione dei singoli casi a fasce di rischio differenti con la possibilità di beneficiare di riduzioni o intensificazioni terapeutiche (Vidriales MB et al, Blood 2003; Flohor T et al, Leukemia 2008; Bassan R et al, Blood 2009). Molti studi di casistiche pediatriche hanno dimostrato come la valutazione della MMR ed i risultati da essa ottenuti rappresentino rilevanti mezzi per stabilire l outcome di ciascun paziente (Flohor T et al, Leukemia 2008; Borowitz MJ et al, Blood 2008; Stow P et al, Blood 2010). Al contrario, informazioni in merito al valore prognostico della MMR nel contesto dei pazienti adulti affetti da LAL, risultano essere sicuramente meno numerose (Vidriales MB et al, Blood 2003; Holowiecki J et al, Br J Haematol 2008; Bassan R et al, Blood 2009). Ad oggi, si dispone di differenti metodologie che permettono un monitoraggio quantitativo della quota di MMR nelle LAL e che differiscono tra loro per sensibilità e specificità nell identificare la cellula leucemica successivamente ad un trattamento terapeutico. Tali cellule possono essere distinte dalla controparte normale sulla base delle differenti caratteristiche fenotipiche e genetico-molecolari 112

che le contraddistinguono. La ricerca di fenotipi aberranti identificabili mediante analisi citofluorimetrica, unitamente all identificazione di aberrazioni cromosomiche e/o di riarrangiamenti specifici a livello dei geni codificanti le immunoglobuline o il T cell receptor (Ig/TCR), entrambi identificabili mediante amplificazione per PCR quantitativa, consentono di monitorare l andamento della malattia nell ambito di specifici protocolli clinici e terapeutici (Vidriales MB et al, Best Pract Res Clin Haematol, 2003; Malec M et al Leukemia 2004; Cazzaniga G and Biondi A, Haematologica 2005; Holowiecki J et al, Br J Haematol 2008). In particolare, la possibilità di effettuare un attento monitoraggio fenotipico della malattia passa attraverso una estesa caratterizzazione del clone leucemico in fase diagnostica con lo scopo di identificare e selezionare fenotipi aberranti, leucemia-associati, specifici di ciascun paziente. Tali LAIPs (leukemia associated immunophenotypes) possono essere il risultato della coespressione di markers linfoidi e mieloidi, di una over-espressione o down-modulazione antigenica rispetto alla controparte normale, dell espressione ectopica di specifici antigeni, piuttosto che derivanti da asincronie maturative che si riscontrano in seguito all espressione di marcatori linfoidi immaturi contemporaneamente alla presenza di marcatori tipici della cellula linfoide matura. Più in generale, alla base della possibiltà di monitorare la MMR mediante analisi citofluorimetrica risiede sempre la necessità di effettuare un confronto tra le caratteristiche fenotipiche della cellula leucemica e quelle dei normali progenitori midollari presenti in un midollo osseo rigenerante. Differenze di espressione antigenica qualitative e/o quantitative - ovvero presenza di antigeni o combinazioni di essi normalmente assenti a livello dei normali precursori linfoidi unitamente o alternativamente a modulazioni dell espressione di alcuni di essi a livello del blasto leucemico permettono una precisa distinzione dei due subset cellulari. In particolare, nella LAL di linea T, l interessamento del distretto timico per la maturazione delle cellule T linfocitarie, rende immediata l identificazione di fenotipi caratteristici ed aberranti relativi a ciascun campione; la presenza di cellule T immature a livello midollare si associa inequivocabilmente alla persistenza di blasti leucemici residui. Diverso è il discorso per le LAL di linea B dove la controparte normale delle cellule leucemiche risulta costituita da cellule progenitrici che risiedono normalmente nel midollo osseo. Tali cellule, definite come ematogoni (Rimsza LM et al, Am J Clin Pathol 2000), risultano ben rappresentate nei bambini e nel midollo osseo attivamente proliferante di pazienti sottoposti a trattamenti chemioterapici o a trapianto di midollo osseo e la loro presenza, con un fenotipo che risulta essere in parte simile a quello delle cellule patologiche (TdT/CD10/CD34/CD19 positive), può rendere complessa l identificazione della 113

eventuale quota di malattia presente durante il periodo di follow-up. Per tale ragione, risulta importante l identificazione di specifici LAIPs che, grazie a differenze nell intensità di espressione di alcuni antigeni e/o alla presenza di markers fenotipici aberranti e non presenti sulle normali cellule rigeneranti, rende possibile la distinzione di queste ultime dal blasto leucemico residuo a livello midollare. Tanto per le LAL-B quanto per le LAL-T, la quantizzazione della quota di MMR mediante citofluorimetria si basa sull espressione in termini percentuali del numero di cellule patologiche residue sul totale della popolazione leucocitaria analizzata. Tale metodologia risulta generalmente accurata ed applicabile praticamente nella quasi totalità dei casi affetti da LAL, con una sensibilità pari a 10-3 -10-4 (Vidriales MB et al, Best Pract Res Clin Haematol, 2003). Accanto a ciò, l analisi mediante RQ-PCR dei geni di fusione derivanti da traslocazioni cromosomiche note quali t(4;11), t(9;22), t(12;21), t(1;19) è in grado, con maggiore specificità e sensibilità, di individuare targets molecolari altrettanto importanti per lo studio di MMR. A dispetto del fatto che gli mrna di fusione risultano pressoché identici da paziente a paziente, le differenti regioni di rottura a livello del DNA possono essere utilizzate come breakpoints paziente-specifici per l analisi di MMR attraverso la scelta di altrettanto specifici primers (van der Velden VH et al, Leukemia 2003). Inoltre, nonostante la elevata sensibilità pari a 10-4 -10-6, lo svantaggio dell analisi dei geni di fusione consiste nella sua bassa applicabilità considerato che la loro presenza ricorre solo nel 30-50% dei casi con LAL (Van Dongen JJ et al, Leukemia 1999; Gabert J et al, Leukemia 2003). Discorso a parte, invece, va fatto per l analisi molecolare del riarrangiamento dei geni che codificano per le immunoglobuline o il T cell receptor la quale consente lo studio di più del 90% dei casi con diagnosi di LAL con una sensibilità minima di 10-4 e comunque variabile sulla base della tipologia di riarrangiamento e della regione di giunzione (van der Velden VH et al, Leukemia 2003, Cazzaniga G and Biondi A, Haematologica 2005). E noto, infatti, che durante l ontogenesi dei linfociti B e T, i geni Ig e TCR vengono assemblati mediante un processo di ricombinazione somatica. Poiché tali ricombinazioni sono di origine clonale, l analisi della configurazione genica delle Ig e del TCR può essere utilizzata per valutare la persistenza di cloni patologici residui dopo terapia i cui riarrangiamenti sono stati determinati al momento della diagnosi. Conseguentemente, le regioni di giunzione possono considerarsi come DNA-fingerprints delle cellule patologiche e perciò utilizzabili come targets tumore-specifici per lo studio di MMR (van der Velden VHJ et al, Leukemia 2003). 114

Ad oggi, la maggior parte dei dati pubblicati in merito alla MMR nelle LAL, ha riguardato principalmente l impiego di una sola metodologia di valutazione; diversi studi riportano dati di MMR ottenuti mediante analisi molecolare ed immunofenotipica prendendo in considerazione prevalentemente casistiche pediatriche (Neale GAM et al Leukemia 1999; Malec M et al Leukemia 2001; Malec M et al Leukemia 2004; Neale GAM et al Leukemia 2004; Kerst G et al Br J Haematol 2005, Thorn I et al Leuk Res 2009, Gaipa G et al, Haematologica 2012). Sulla base di tali considerazioni, in questa analisi sono stati valutati i dati di MMR ottenuti utilizzando le metodologie citofluorimetrica e di biologia molecolare (RQ-PCR), quest ultima con l intento di valutare sia i geni di fusione che i riarrangiamenti dei geni Ig/TCR, in 18 casi adulti affetti da LAL, con lo scopo di comparare i risultati così ottenuti e di valutare l applicabilità delle differenti metodologie per il monitoraggio della MMR nel contesto specifico delle LAL. 115

MATERIALI E METODI Pazienti Sono stati inclusi in questa analisi 18 pazienti affetti da LAL in fase di diagnosi con età compresa tra i 21 ed i 59 anni, afferenti alla Divisione di Ematologia del Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia della Sapienza di Roma. Sono stati successivamente valutati i loro rispettivi 49 campioni di midollo osseo prelevati in specifiche fasi del follow-up di ciascun paziente analizzato. Tutti i casi presi in considerazione erano arruolati nel protocollo clinico GIMEMA 0904 ed avevano fornito il loro consenso informato per gli studi biologici eseguiti. La diagnosi è stata stabilita sulla base di criteri morfologici, citochimici ed immunologici in accordo con le classificazioni FAB e WHO. Gli studi effettuati sui 18 campioni di midollo osseo in fase di diagnosi hanno permesso di determinare specifici LAIPs nonché di identificare la presenza di specifici riarrangiamenti genici a livelo di Ig/TCR e di valutare la presenza di particolari trascritti derivanti dalle traslocazioni cromosomiche note. Da tali analisi è emerso che 17/18 dei casi analizzati mostravano un fenotipo linfoide B mentre solo in un caso si evidenziava un fenotipo linfoide T. In tutti i casi è stata riscontrata la presenza di un gene di fusione ed in particolare: 12/18 casi risultavano BCR/ABL positivi (9 p190 e 3 p210), 2/18 ALL1/AF4 positivi, 1/18 ALL1/ENL positivo mentre i 3 rimanenti erano positivi al gene di fusione E2A/PBX1. In aggiunta a ciò, in tutti i casi è stato possibile identificare un riarrangiamento specifico a livello dei geni Ig/TCR. La valutazione della MMR è stata eseguita mediante analisi citofluorimetrica e molecolare in tre differenti momenti, sulla base di quanto stabilito dal protocollo terapeutico nel quale i pazienti analizzati erano stati arruolati: al giorno +35, alla fine della terapia di induzione (giorno+50) ed alla fine della terapia di consolidamento. Criterio necessario per il monitoraggio della MMR era la remissione ematologica al momento di ogni singola valutazione. I campioni di midollo osseo sia alla diagnosi che alle successive rivalutazioni è stato raccolto in provette contenenti EDTA e sodio citrato rispettivamente per le analisi citofluorimetriche e di biologia molecolare e conservato a temperatura ambiente fino al momento della lavorazione. L analisi citofluorimetrica è stata eseguita su sangue intero entro le 24 ore dall esecuzione del prelievo; per le analisi di biologia molecolare, al contrario, è stata sempre effettuata una separazione delle cellule su gradiente di densità Ficoll. In particolare, per l analisi mediante PCR dei 116

riarrangiamenti a livello dei geni Ig/TCR, il DNA è stato estratto mediante un apposito kit (Puregene DNA purification Kit) (Gentra System, Minneapolis, Minnesota, USA) e successivamente conservato a -20 C, mentre per l analisi dei geni di fusione veniva estratto l RNA in seguito a criopreservazione a 20 C delle cellule mononucleate risospese in guanidina isotiocianato 4M. Citofluorimetria In fase di diagnosi è stata eseguita una estesa caratterizzazione immunofenotipica del blasto leucemico mediante analisi citofluorimetrica multiparametrica avvalendosi dell utilizzo di varie e specifiche combinazioni di anticorpi monoclonali (AcMo) coniugati ai fluorocromi fluorescina isotiocianato (FITC), ficoeritrina (PE), peridin-clorofil proteina (PerCP), ficoeritrina-cianina 7 (Pe- Cy7), alloficocianina (APC) e alloficocianina-cianina 7 (APC-Cy7), in grado di riconoscere i seguenti antigeni: CD1a, CD10, (Dako, Glostrup, Denmark), CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD13, CD15, CD19, CD20, CD22, CD33, CD34, CD38, CD45, CD56, HLA-DR, TCR α/β, TCR γ/δ (Becton Dickinson, San Jose, CA), CD7, CD58, CD66c, CD117, NG2 (Immunotech Coulter Company, Marseille, France), CD99 (BD Pharmigen, San Diego, CA), CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany), CD52 (AbD Serotec, Oxford, UK). Per la valutazione dell espressione di antigeni di natura citoplasmatica quali MPO, CD3, CD79a (Beckman Coulter, Brea, CA), IgM-heavy chain (cyigm) (Southern Biotech, Birmingham, AL) e nucleare, quali la deossinucleotidil transferasi terminale (TdT) (Dako) è stato utilizzato il kit FIX&PERM (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA) per consentire fissazione e permeabilizzazione cellulare. Per la preparazione e la procedura di marcatura dei campioni con AcMo, sono stati presi in considerazione protocolli operativi standardizzati già precedentemente descritti (Dworzak MN et al, Cytometry B Clin Cytom 2008). L estesa ed accurata analisi dei campioni effettuata in fase diagnostica ha come scopo principale quello di identificare fenotipi leucemici specifici siano essi di linea B o T e di scegliere tra di essi le più informative combinazioni di marcatori cellulari da poter poi utilizzare al momento della rivalutazione per MMR dello stesso paziente (Porwit-MacDonald A et al Leukemia 2000; Veltroni M et al Haematologica 2003; Dworzak MN et al Leukeamia 2004). La caratterizzazione immunofenotipica in fase di diagnosi è stata eseguita mediante acquisizione di almeno 30,000 eventi cellulari mentre per la valutazione ed il monitoraggio della MMR sono stati acquisiti almeno 900,000 cellule per ciascuna delle combinazioni anticorpali eseguite. Per 117

l acquisizione dei dati, in relazione ai fluorocromi presenti nelle differenti combinazioni, sono stati utilizzati due tipologie di strumenti, il citofluorimetro FACSCalibur ed il FACSCanto I (BD); analogamente l analisi dei dati è stata eseguita mediante l utilizzo, rispettivamente, dei programmi PAINT-A-GATE e FACSDiva (BD) (Figura 1). In particolare, l analisi dei dati di MMR è stata effettuata basandosi sulla presenza di empty space ovvero di regioni dei dot plots biparametrici nei quali non si posizionano mai i normali precursori linfoidi presenti a livello midollare e dove sono invece identificabili le cellule patologiche. Tale anomala localizzazione può essere il risultato di differenti alterazioni fenotipiche che possono verificarsi a livello del blasto leucemico dovute ad una anomala espressione, in termini di intensità, di alcuni antigeni, ad asincronie del processo maturativo linfoide o ad aberrante espressione di antigeni non di linea linfoide sulle cellule patologiche prese in considerazione. Metodologicamente parlando, l analisi è basata sulla possibilità fornita dai programmi di analisi di disegnare delle regioni specifiche, in primo luogo, sul citogramma biparametrico che mettendo in relazione la dimensione (forward scatter - FSC) e le caratteristiche cellulari morfologiche (side scatter - SSC) consente la definizione della regione fisica in cui si localizzano i blasti leucemici e successivamente, in maniera sequenziale, su ciascuno dei dot plots di fluorescenza che si intende considerare nell analisi. In accordo con i dati già riportati in letteratura, il valore di MMR così ottenuto veniva considerato positivo, se si evidenziava la presenza di almeno 10 eventi disposti su specifici dot plots a formare un cluster cellulare caratterizzato dalle necessarie proprietà di scatter morfologico e con le caratteristiche immunofenotipiche precisamente sovrapponibili a quanto riscontrato in fase di diagnosi (Dworzak MN et al Cytometry B Clin Cytom 2008). Infine, la quota di MMR presente a livello midollare veniva espressa come percentuale di cellule leucemiche presenti, sul totale della popolazione leucocitaria del campione preso in esame. Quantizzazione dei riarrangiamenti Ig/TCR e dei trascritti di fusione I campioni di DNA genomico sono stati analizzati in fase di diagnosi mediante amplificazione genica utilizzando specifiche miscele di reazione contenenti i rispettivi primers per i differenti riarrangiamenti genici Ig/TCR (Van Dongen JJM et al, Leukemia 1999). Sui prodotti così ottenuti è stata effettuata anche un analisi di clonalità mediante omo- etero duplex con lo scopo di distinguere amplificati derivanti da una popolazione monoclonale, dagli eterodimeri o da amplificati derivanti da una popolazione policlonale (Langerak AW et al, Leukemia 1997; Borowitz MJ et al, Blood 2008). La valutazione della MMR è stata condotta mediante amplificazione per RQ-PCR con 118

metodologia TaqMan ed utilizzo della strumentazione ABI 7700 e 7300 (Applied Biosystem) (Bruggemann M et al, Leukemia 2000; Cazzaniga G and Biondi A, Haematologica 2005). La valutazione della presenza di geni di fusione è stata invece valutata estraendo l RNA da cellule criopreservate risospese in guanidina isotiocianato in accordo con la metodologia descritta da Chomczynsky e Sacchi (Chomczynsky P and Sacchi N, Anal Biochem 1987). In particolare, l analisi, sia in fase di diagnosi che al momento delle valutazioni di MMR, è stata eseguita utilizzando una RT-PCR Multiplex (Elia L et al, Haematologica 2003). Il numero di copie dei differenti geni di fusione identificati alla diganosi è stato determinato basandosi sull European Concerted Action of the Europe Against Cancer (EAC) Program (Gabert J at al Leukemia 2003) e normalizzato rispetto al numero di copie del trascritto ABL utilizzato come gene di controllo. Tutte le reazioni di RQ-PCR sono state eseguite mediante piattaforma ABI 7500 (Applied Biosystem). Con particolare riguardo al gene di fusione MLL/ENL, identificato in uno solo dei casi analizzati, per la valutazione della quota di MMR è stata eseguita una Nested-RT-PCR con una sensibilità pari a 1x10-4. 119

RISULTATI Analisi citofluorimetrica L analisi citofluorimetrica eseguita in fase di diagnosi presso il nostro istituto in tutti i 18 campioni di LAL analizzati (Tabella 1), è stata utilizzata con l obiettivo principale di identificare delle firme immunofenotipiche specifiche e quindi di scegliere combinazioni di markers cellulari caratteristici di ciascuno dei pazienti preso in considerazione (Tabella 2). Sulla base di tale caratterizzazione fenotipica, al momento della diagnosi sono stati identificati 17 casi di LAL-B con una mediana del valore di blasti pari a 80,5% (range 33-90%) ed un solo caso di LAL-T che presentava all esordio di malattia l 88% di blasti. Sulla base della comparazione delle caratteristiche fenotipiche riscontrate alla diagnosi basate sui differenti livelli di espressione genica, sull aberrante espressione di markers mieloidi o sull espressione ectopica di alcuni di essi, è stato possibile identificare l eventuale presenza di cellule leucemiche residue in tutti i casi analizzati. I risultati di MMR così ottenuti sono stati espressi sotto froma di percentuale sul totale delle cellule midollari analizzate utilizzando, in accordo con i dati precedentemente pubblicati, un valore soglia pari a 0,01% per definire una condizione di positività. Considerando la totalità dei campioni di follow-up analizzati, da tale analisi è risultata una positività di MMR nella metà di essi con un valore mediano pari allo 0,05% (range 0,01-6%) laddove i rimanenti casi risultavano negativi alla valutazione immunofenotipica. Analisi dei riarrangiamenti Ig/TCR e dei geni di fusione L analisi dei riarrangiamenti Ig/TCR in fase di diagnosi è stata eseguita in tutti i pazienti: in 15/18 è stata riscontrata la presenza di un singolo marcatore, in 2/18 casi due marcatori di clonalità, mentre solo in un caso non è stato possibile identificare alcun marcatore. Sono state quindi riscontrate un totale di 20 differenti ricombinazioni 17 delle quali a carico di IgH e 3 a carico di IgK-Kde (Tabella 1). Solo in 15 dei 18 casi valutati in fase di diagnosi, è stato possibile monitorare molecolarmente l andamento della MMR in quanto in un caso è stato identificato un subclone, in un altro i marcatori di clonalità identificati non avevano un sensibilità tale da poter essere utilizzati in MMR, mentre in uno non era stato possibile identificare alcun marcatore di clonalità. Considerando a questo punto la totalità dei campioni di follow-up analizzati e con una sensibilità di analisi pari a 1x10-5, 12/21 120

campioni sono stati identificati come positivi per la presenza di livelli di MMR 1x10-4 mentre i rimanenti 9 risultavano negativi. Se si prendono in considerazione i risultati derivanti dall analisi dei geni di fusione, tutti i 18 pazienti valutati presentavano uno specifico trascritto di fusione (Tabella 1) dunque tutti risultavano eleggibili per il monitoraggio della MMR. Prendendo come riferimento il medesimo limite di sensibilità di quello considerato per l analisi Ig/TCR ed esprimendo i risultati di MMR in termini di numero di copie, 27 dei 44 campioni di follow-up risultavano positivi con valori di MMR 1x10-4 /1x10-5 mentre 14/44 non mostravano presenza di malattia. Infine, i tre campioni di follow-up relativi al caso che si presentava in esordio positivo per la presenza del gene MLL/ENL t(11;19)(q23;p13.3), risultavano positivi all analisi di MMR eseguita mediante Nested PCR. Confronto dei risultati di MMR ottenuti con le tre differenti metodologie Con l intento di stabilire le percentuali di concordanza tra le tre differenti metodologie prese in considerazione, sono stati stabiliti dei cut-off di positività pari a 0.0001% e 0.01% rispettivamente per le analisi di biologia molecolare e citofluorimetrica. Lo studio di MMR è stato eseguito utilizzando le tre differenti metodologie in 7 dei 18 pazienti presi in considerazione. Tale analisi ha fornito risultati concordanti in tutti i campioni eccetto in due per i quali i valori di MMR sono risultati positivi solo all analisi molecolare dei geni di fusione, laddove lo studio immunofenotipico e l analisi dei riarrangiamenti Ig/TCR mostrava risultati di MMR negativi. Prendendo in considerazione i risultati ottenuti dall analisi citofluorimetrica e dall analisi molecolare dei geni di fusione (Tabella 2), esse sono state contemporaneamente eseguite in 32/49 campioni di follow-up provenienti da 14 differenti pazienti. Di questi 32 campioni, in 26 (81.3%) l analisi di MMR ha fornito risultati concordanti mentre 5/32 risultavano positivi per presenza di MMR solo all analisi molecolare, ma erano negativi per lo studio immunofenotipico. In un solo caso, considerabile come reale discordante, il valore di MMR risultava positivo solo all analisi immunofenotipica laddove lo studio molecolare del gene di fusione, eseguito su un campione con bassa conta cellulare, mostrava risultati negativi. In maniera analoga, confrontando tra loro i risultati ottenuti dall analsi citofluorimetrica e molecolare dei riarrangiamenti Ig/TCR, metodiche eseguite contemporaneamente in 12/49 campioni di follow-up (Tabella 2) appartenenti a 9 differenti pazienti, è stata osservata una completa concordanza (100%) dei valori di MMR ottenuti. Infine, comparando i risultati ottenuti dalle due 121

metodologie di analisi molecolare (Tabella 2), eseguite in contemporanea in 28/49 campioni appartenenti a 15 differenti pazienti, dati concordanti sono stati ottenuti in 22 dei 28 campioni (78.6%) mentre nei rimanenti 6, l analisi dei geni di fusione mostrava risultati di MMR positivi laddove l analisi dei riarrangiamenti Ig/TCR risultava negativa. Dunque, considerando i campioni analizzati nella loro totalità, solo in 7/49 campioni di follow-up presi in considerazione si registravano risultati discordanti tra le differenti metodiche con una percentuale di concordanza complessiva pari all 85.7%. 122

DISCUSSIONE Sebbene non sia perfettamente chiaro se ed in che modo la presenza di MMR possa da sola rappresentare un fattore sufficiente nel predire l outcome dei pazienti affetti da emopatie o se sia invece importante la sua interazione con altri fattori di rischio, la presenza di cellule leucemiche residue successivamente a trattamenti chemioterapici nelle LAL è stato dimostrato svolgere un importante ruolo prognostico (Borowitz JM et al Blood 2008; Holowiecki J et al, Br J Haematol 2008). Ad oggi, l analisi mediante RQ-PCR dei geni di fusione e dei riarrangiamenti genici delle Ig/TCR, unitamente alla valutazione citofluorimetrica basata sulla identificazione di fenotipi aberranti della cellula leucemica, nonostante siano metodologie che richiedono adeguata expertise esse risultano quelle maggiormente sensibili e con risultati estremamente riproducibili per il monitoraggio della MMR in pazienti affetti da LAL. Diversi studi, effettuando una comparazione dei risultati di MMR ottenuti mediante analisi citofluorimetrica con quelli ottenuti dall utilizzo di una delle due metodologie di analisi molecolare (riarrangiamenti dei geni Ig/TCR o analisi dei geni di fusione), hanno dimostrato una concordanza dei risultati ottenuti quando veniva considerato lo 0.01% come valore soglia per definire un caso positivo per presenza di MMR (Neale GAM et al Leukemia 1999; Malec M et al Leukemia 2001; Malec M et al Leukemia 2004; Neale GAM et al Leukemia 2004; Kerst G et al Br J Haematol 2005). Oltre a ciò, un altro studio si è interessato al monitoraggio dei livelli di MMR mediante le tre differenti metodologie in una casistica di 8 pazienti pediatrici affetti da LAL con positività al gene di fusione BCR/ABL. In tale studio, il monitoraggio pre- e post-trapianto di midollo osseo, ha fatto emergere una cinetica di riduzione del clone leucemico, evidenziata in maniera similare dalle differenti metodologie e verificatasi in 6 degli 8 casi presi in considerazione (Thorn I et al Leuk Res 2009). Nello studio qui presentato, è stata invece presa in considerazione, per la prima volta, una casistica di 18 pazienti adulti affetti da LAL, con positività a differenti geni di fusione, nella quale la comparazione dei risultati di MMR ottenuti con le tre differenti metodologie ha avuto lo scopo di confermare i risultati precedentemente pubblicati nonché di investigare in merito all applicabilità di tali tecniche nello studio della MMR durante il follow-up dei pazienti affetti da LAL. Prendendo in considerazione i risultati ottenuti dal confronto delle tre differenti metodologie, sono stati evidenziati valori discordanti solo in 2 dei campioni di follow-up analizzati nei quali l analisi dei geni di fusione indicava bassi livelli di MMR, con un numero di copie pari a 2.5 e 3.5 rispettivamente, laddove le valutazioni effettuate mediante citofluorimetria ed analisi molecolare dei 123

riarrangiamenti Ig/TCR mostravano risultati negativi. Con riferimento all analisi citofluorimetrica, sicuramente una possibile spiegazione a ciò potrebbe essere il fatto che tale metodica permette una quantizzazione delle cellule vitali esprimenti un fenotipo aberrante su un background di normali cellule rigeneranti che ripopolano via via il midollo osseo. A tal proposito, la sua sensibilità pari a 10-4 risulta strettamente correlata al numero di cellule analizzate nonché alla forza del fenotipo aberrante identificato alla diagnosi nel permettere l identificazione della presenza di MMR (Malec M et al Leukemia 2004; Dworzak MN et al Cytometry 2008). La sensibilità non giustificherebbe, però, la negatività di tali campioni all analisi dei riarrangiamenti Ig/TCR con la quale è possibile raggiungere valori di sensibilità pari a 10-5 (van der Velden VH et al Leukemia 2003). Inoltre, mentre l analisi citofluorimetrica viene effettuata su cellule provenienti da sangue midollare intero, le analisi molecolari vengono eseguite su materiale genomico estratto da cellule mononucleate separate su gradiente di densità con un conseguente possibile arricchimento del campione in termini di cellule leucemiche presenti. Ad avvalorare tale ipotesi, in un lavoro precedentemente pubblicato da Neale e colleghi, sono state utilizzate cellule mononucleate sia per l analisi citofluorimetrica che per quella molecolare, che ha però riguardato solo i riarrangiamenti Ig/TCR, con lo scopo di comparare i risultati ottenuti in un ampia serie di pazienti affetti da LAL-B e con l ottenimento di dati concordanti in eccelente modo tra le due metodologie utilizzate (Neale GAM et al Leukemia 2004). Tutto ciò pero non renderebbe ragione della negatività dei risultati di MMR ottenuti dall analisi dei riarrangiamenti Ig/TCR quando comparati a quanto evidenziato negli stessi pazienti mediante analisi molecolare dei geni di fusione. Una delle possibili cause di tali casi falsi negativi potrebbe essere il risultato della instabilità di alcuni riarrangiamenti che andrebbero incontro ad uno processo di ricombinazione somatica secondario determinando una vera e propria perdita del target molecolare specifico relativo a quel determinato paziente. Differenti lavori hanno infatti riportato come il 25-30% dei riarrangiamenti Ig/TCR identificabili in fase di diagnosi, siano soggetti a ricombinazioni somatica continua o secondaria con la presenza di marcatori differenti in fase di recidiva di malattia, l impossibilità di seguire il marker molecolare paziente specifico identificato in fase di diagnosi nelle fasi di monitoraggio della MMR ed il conseguente ottenimento di risultati falsi negativi (Szczepanski T et al Blood 2002; Germano G et al Leukemia 2003; Szczepanski T et al Leukemia 2003). Della totalità dei campioni analizzati, solo in un caso si può parlare di reale discordanza in quanto non imputabile ai differenti livelli di sensibilità delle metodologie utilizzate. Esso è stato studiato per MMR solo mediante citofluorimetria ed analisi molecolare del gene di fusione E2A/PBX1 124

t(1;19)(q23;p13), per il quale era risultato positivo in fase di esordio di malattia, in quanto il materiale disponibile non risultava sufficiente anche per lo studio dei riarrangiamenti Ig/TCR. In questo campione veniva evidenziata una positività di MMR solo all analisi immunofenotipica mediante citofluorimetria con un valore percentuale di MMR pari a 0.01% mentre risultava negativo all analisi mediante RQ-PCR, per la quale però il campione risultava ipocellulare. Un importante concetto emergente da questo dato discordante è che, sebbene la citofluorimetria risulti meno sensibile rispetto all analisi molecolare, in questo caso essa si è dimostrata maggiormente indicata per lo studio di un campione che mostrava una bassissima conta cellulare e la cui presenza di MMR non sarebbe stato possibile identificare in altro modo, come a dimostrare che nessuna delle metodologie qui prese in considerazione può essere da sola in assoluto sufficiente per l identificazione di eventuali cellule patologiche residue. Dunque, è intuitivo affermare come per un attento ed accurato monitoraggio di MMR possa essere assolutamente indicato l utilizzo contemporaneo di differenti metodologie. Prendere in considerazione caratteristiche biologiche nettamente indipendenti del clone leucemico ha lo scopo di ridurre il più possibile eventuali risultati falsi negativi relativi a ciascuna metodologia che possono verificarsi tanto per shifts fenotipici dovuti all interferenza del trattamento terapeutico eseguito, quanto per minori sensibilità di alcune tecniche rispetto ad altre così come per perdita di target molecolari paziente-specifici in seguito ad evoluzione clonale della malattia. D altro canto, ciascuna differente tecnica presenta i suoi differenti vantaggi. Così, sebbene mediante l utilizzo di analisi di biologia molecolare sia possibile raggiungere livelli di sensibilità maggiori rispetto all analisi citofluorimetrica, quest ultima risulta sicuramente più rapida, meno costosa e laboriosa, concetto questo estremamente rilevante in un contesto in cui la tempistica di ottenimento dei risultati diventa un requisito importante per l applicabilità clinica di un dato laboratoristico soprattutto in momenti specifici del percorso clinico di un paziente affetto da LAL. L esperienza che risulta da tale studio dimostra come l utilizzo contemporaneo di differenti metodologie permetta il monitoraggio dei livelli di MMR in tutti i 18 pazienti presi in considerazione. Come già precedentemente riportato (Thorn I et al Leukemia Research 2009), da questa analisi è emerso che l analisi mediante RQ-PCR dei geni di fusione risulta la metodologia con peso maggiore nell identificare cellule leucemiche residue. Infatti, prendendo in considerazione tutti i campioni analizzati con entrambe le tipologie di analisi molecolare, nonostante la medesima sensibilità, l utilizzo dei geni di fusione risulta maggiormente in grado di identificare bassi livelli di MMR rispetto all utilizzo dei riarrangiamenti Ig/TCR. Con lo scopo di fornire una spiegazione a 125

tale differenza, facendo riferimento alla nostra personale esperienza, emerge come i casi con presenza di anomalie cromosomiche note presentino una particolare sequenza dei riarrangiamenti Ig/TCR. Ciò determinerebbe una minore efficienza degli ASO (oligonucleotide-allelic-specific) primer utilizzati rispetto ai casi che non presentano alcuna anomalia cromosomica come se il gene di fusione venisse riconosciuto come target leader della cellula leucemica. A conferma di tale ipotesi, tale studio ha messo in evidenza come in pazienti con presenza all esordio di malattia di un gene di fusione noto l analisi molecolare del trascritto di fusione risulti essere più forte e più sensibile nell identificare la presenza di MMR rispetto alla stessa analisi molecolare ma utilizzando i riarrangiamenti Ig/TCR. Ad ogni modo, l impossibilità di stimare precisamente la percentuale di cellule leucemiche presenti nel campione in esame a causa del fatto che la quantità di trascritto presente a livello di ciascuna cellula patologica può variare da paziente a paziente nonché essere influenzata dal trattamento chemioterapico o dall integrità cellulare al momento dello studio (Gabert J et al, Leukemia 2003), rende l analisi dei geni di fusione una metodica per certi versi meno precisa rispetto alle altre. Risulta, inoltre, complesso stabilire una precisa relazione tra la quantità di prodotto di PCR - ovvero il numero di copie relativo al trascritto di fusione - ed il numero di cellule leucemiche presenti. Da non dimenticare poi il fatto che essendo tali anomalie cromosomiche note presenti solo nel 30-50% dei casi di LAL, l analisi molecolare dei geni di fusione risulta avere un ridotto spettro di applicabilità. Al contrario, nonostante possa verificarsi un switch del clone leucemico sia a livello fenotipico che dei riarrangiamenti Ig/TCR, tali metodologie di analisi permettono una più precisa quantizzazione della quota di MMR oltre a dimostrarsi maggiormente applicabili. Tutto ciò, se da un lato suggerisce quanto una attenta e ampia caratterizzazione biologica in fase di diagnosi potrebbe essere importante per indirizzare gli studi di MMR verso l utilizzo del miglior metodo per ogni singolo paziente, dall altro dimostra come in realtà tutti i metodi presi in considerazione siano in grado di permettere un attento monitoraggio della MMR durante il follow-up dei pazienti affetti da LAL. Per lo studio virtuale di tutti i pazienti e per evitare di trovarsi di fronte a risultati falsi negativi o positivi, un ottimo atteggiamento potrebbe essere l utilizzo in tandem delle differenti metodologie oggi disponibili con lo scopo principale di consentire ai pazienti di poter beneficiare di trattamenti specifici stabiliti sulla base dei diversi livelli di MMR identificati. 126

Figura 1: a) esempio di analisi di MMR nella LAL-B effettuata utilizzando lo strumento FACSCalibur ed il programma di analisi PAINT-A-GATE. Nella colonna di sinistra, sono rappresentate le caratteristiche fenotipiche di un normale midollo osseo; nella colonna centrale i LAIPs identificati per questo specifico paziente in fase di esordio ed utilizzati successivamente (ultima colonna) per il monitoraggio della MMR; b) esempio di analisi di MMR nella LAL-T effettuata utilizzando lo strumento FACSCanto ed il programma di analisi FACSDiva. L identificazione della presenza di MMR (regione destra) è basata sulle caratteristiche fenotipiche individuate in fase di diagnosi (regione sinistra). a) 127

b) 128

Tabella 1: Caratteristiche dei pazienti analizzati, in fase di esordio di malattia. Paziente Immunofenotipo (CD) Riarrangiamento Gene di fusione Ig/TcR LAL B-1 10 bright, 19+, 34+, 20+, 22+, 38-, 45dim, TdT+ VKII-011/KDE BCR/ABL t(9;22)(q34;q11) p190+ LAL B-2 LAL B-3 LAL B-4 LAL T-5 10 bright, 19+, 34+, 20+, 22+, 38+, 45+, TdT dim, CD33+/-, CD66c+ 10 bright, 19+, 34+, 20-, 22+, 38+, 45+, TdT+, CD33+/-, CD13+, CD66c+ 10+, 19+, 34+, 20+/-, 22+, 38-, 45-, TdT+, CD66c+ 1a+, 99+, 2+, 5+, 7+, 4+, 8+, s3, c3+, TdT+, 34+/- LAL B-6 10-, 19+, 34+, 20-, 22-, 38+, 45+, TdT dim, c79a+, 13-, 33-, 133+ LAL B-7 10 bright, 19+, 34+, 20+/-, 22+, 38 dim, 45+, TdT+, CD66c+ VH3-13/D2-8/JH6 VH3-74/D1-1/JH4 VH4-59/D3-10/JH4 No markers VH3-13/D6-6/JH3 VH4-34/D3-9/JH6 LAL B-8 10+, 19+, 34+, 20+/-, 22+, 38 dim, 45 dim, TdT dim VH3-66/D2-8/JH4 LAL B-9 10-, 19+, 34-, 20-, 22+, 38+, 45+, DH3/JH4 TdT dim, 133+ LAL B-10 10+, 19+, 34-, 20-, 22+, 38+, 45+, TdT dim VH4-28/D2-2/JH3 LAL B-11 10+, 19+, 34+, 20-, 22+, 38+, 45+, TdT dim, 33+/-, 66c+ VH3-23/D6-6/JH6 VH3-66/JH6 BCR/ABL t(9;22)(q34;q11) p190+ BCR/ABL t(9;22)(q34;q11) p190+ BCR/ABL t(9;22)(q34;q11) p190+ BCR/ABL t(9;22)(q34;q11) p190+ ALL1/ENL t(11;19)(q23;p13.1) BCR/ABL t(9;22)(q34;q11) p190+ BCR/ABL t(9;22)(q34;q11) p210+ ALL1/AF4 t(4;11)(q21;q23) E2A/PBX1 t(1;19)(q23;p13) BCR/ABL t(9;22)(q34;q11) p210+ LAL B-12 10-, 19+, 34+/-, 20-, 22+, 38+, 45+, TdT dim, 133+, NG2+ VH3-13/D2-15/JH6 ALL1/AF4 t(4;11)(q21;q23) LAL B-13 10 bright, 19+, 34-, 20-, 22+, 38+, 45+, TdT+ VH3-33/D2-15/JH5 E2A/PBX1 t(1;19)(q23;p13) LAL B-14 10+, 19+, 34+, 20+/-, 22+, 38-, 45+, TdT+, CD66c+ VH4-31/D3-22/JH4 BCR/ABL t(9;22)(q34;q11) p190+ LAL B-15 LAL B-16 10 bright, 19+, 34+, 20-, 22+, 38 eterog, 45 dim, TdT dim, 13+, 33+/-, 66c+ 10 bright, 19+, 34+, 20+, 22+, 38+, 45+, TdT dim, 33+/-, 66c+ LAL B-17 10+, 19+, 34-, 20-, 22+, 38+, 45+, TdT dim, 13-, 33+ LAL B-18 10 bright, 19+, 34-, 20-, 22+, 38+, 45+, TdT dim, 13+, 33+ VH2-70/D3-9/JH6 IRSS KDE VH4-39/D3-22/JH4 VKII-A19/KDE VH3-21/D1-26/JH4 BCR/ABL t(9;22)(q34;q11) p190+ BCR/ABL t(9;22)(q34;q11) p210+ BCR/ABL t(9;22)(q34;q11) p190+ E2A/PBX1 t(1;19)(q23;p13) 129

Tabella 2: Risultati ottenuti dall analisi di MMR effettuata con i tre differenti metodi. N. campioni Concordanza (%) GF vs CF 32 GF+/CF+ 14 GF-/CF- 12 96.8 GF+CF- 5* GF-/CF+ 1 Ig/TCR vs CF 12 Ig/TCR+/CF+ 5 Ig/TCR-/CF- 7 100 Ig/TCR+/CF- 0 Ig/TCR-/CF+ 0 Ig/TCR vs GF 28 Ig/TCR+/GF+ 11 Ig/TCR-/GF- 11 78.6 Ig/TCR+/GF- 0 Ig/TCR-/GF+ 6 GF= RQ-PCR dei geni di fusione; CF = citofluorimetria; Ig/TcR= riarrangiamenti Ig/TcR. * Questi campioni non sono stati considerate come discordanti per la minore sensibilità dell analisi citofluorimetrica (10-4 ) rispetto a quella molecolare eseguita mediante RQ-PCR (10-4 - 10-6 ). 130

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