Ercole Olivario Concorso per la valorizzazione delle eccellenze olearie territoriali italiane Innovazioni analitiche nelle normative comunitaria ed internazionale per la qualità e la genuinità dell olio extra vergine di oliva 2011 a cura di Centro di ricerca per l olivicoltura e l industria olearia QUADERNI ERCOLE OLIVARIO N. 8
CENTRO DI RICERCA PER L OLIVICOLTURA E L INDUSTRIA OLEARIA SEDE DI CITTÀ S.ANGELO INNOVAZIONI ANALITICHE NELLE NORMATIVE COMUNITARIA ED INTERNAZIONALE PER LA QUALITÀ E LA GENUINITÀ DELL OLIO EXTRA VERGINE DI OLIVA A CURA DI LUCIANA DI GIACINTO L olio di oliva vergine è il più pregiato degli oli commestibili. Come dice il nome stesso, si estrae dalle olive cioè dai frutti della pianta dell olivo (Olea Europaea) coltivata in tutte le zone mediterranee e che oggi si sta diffondendo praticamente in tutto il mondo. L eccezionalità dell olio vergine di oliva proviene dal fatto che esso è uno dei pochi oli ottenuti dal frutto ed è l unico che può essere direttamente consumato senza la necessità dei processi di rettifica richiesti dalla maggioranza degli oli edibili. L olio di oliva vergine si distingue dagli altri oli vegetali per molti aspetti: è infatti dotato di caratteristiche qualitative che lo rendono unico. I pigmenti liposolubili, clorofille e carotenoidi, responsabili del tipico colore dell olio di oliva, e le sostanze fenoliche e volatili, che contribuiscono al complesso equilibrio che ne determina l aroma, distinguono l olio di oliva vergine dagli altri oli vegetali. Nell Unione Europea, con il Regolamento n. 1234/2007/CE, art. 118 Allegato XVI, sono state fissate le descrizioni e le definizioni degli oli d'oliva e degli oli di sansa di oliva, in particolare gli oli di oliva vergini sono definiti come <Gli oli ottenuti dal frutto dell'olivo soltanto mediante processi meccanici o altri processi fisici, in condizioni che non causano alterazioni dell'olio, e che non hanno subito alcun trattamento diverso dal lavaggio, dalla decantazione, dalla centrifugazione e dalla filtrazione, esclusi gli oli ottenuti mediante solvente o con coadiuvanti ad azione chimica o biochimica, o con processi di riesterificazione e qualsiasi miscela con oli di altra natura>. Nell ambito degli oli di oliva vergini lo stesso regolamento classifica l olio extra vergine di oliva come <olio di oliva vergine la cui acidità libera, espressa in acido oleico, è al massimo di 0,8 per 100 g e avente le altre caratteristiche conformi a quelle previste per questa categoria>. 1
La difesa e la certificazione della qualità e della genuinità delle varie categorie di oli di oliva sono oggi tutelate nell Unione Europea dal Regolamento n. 2568/91/CEE e successive modificazioni che prescrive una serie di parametri chimico-fisici, chimici e sensoriali capaci di definire gli standard di qualità e genuinità per tutti gli oli di oliva. A livello internazionale, classificazioni, definizioni, standard di qualità e genuinità per gli oli di oliva e gli oli di sansa di oliva sono previsti nella Norma Commerciale del Consiglio Oleicolo Internazionale (COI/T.15/NC No 3/Rev.4) e nel CODEX Alimentarius della FAO. Uno sforzo evidente è stato fatto nel cercare di armonizzare quanto più possibile tali norme tra loro e nel fornire quindi caratteristiche analitiche comuni per l accertamento della purezza e della qualità valide per tutti i Paesi produttori e importatori. Se anche un solo parametro non risulta conforme al valore stabilito come standard di qualità e genuinità, l olio in esame viene declassato di qualità o dichiarato non genuino. Malgrado questo, il settore della chimica analitica dell olio di oliva manifesta difficoltà oggettive che si concretizzano nella domanda di metodologie strumentali efficaci per una definizione più rigorosa della qualità e della genuinità dell olio di oliva a tutela del consumatore. Tre le problematiche emergenti più rilevanti: 1) Mancanza di un metodo standardizzato per la determinazione delle sostanze fenoliche; 2) Sofisticazione dell olio di oliva extra vergine con l aggiunta di olio deodorato. 3) Difficoltà oggettive nell applicazione del metodo del Panel test per la valutazione organolettica; DETERMINAZIONE DELLE SOSTANZE FENOLICHE L'importanza nutrizionale dell'olio extra vergine di oliva è soprattutto legata alla composizione acidica (caratterizzata da un alto livello del rapporto insaturi/saturi ed in particolare da una forte predominanza dell'acido oleico sull'acido linoleico e linolenico, quest'ultimo presente a basse concentrazioni) e al patrimonio antiossidante dovuto alla costituente fenolica e vitaminica. A tale patrimonio, ed in particolare alle sostanze secoiridoidi, è attribuito un ruolo predominante nella prevenzione di alcune importanti patologie: - cardio vascolari, - oncologiche, - invecchiamento precoce, - degenerative del sistema nervoso, tutte legate alla presenza di radicali liberi e ai loro effetti degenerativi. 2
Oltre agli effetti salutistici della componente fenolica, la letteratura già da alcuni anni ha messo in evidenza che i composti di natura secoiridoide, presenti negli oli di oliva vergini in diversa quantità in relazione alla varietà dei frutti, al loro grado di maturazione, al loro stato di conservazione e alla tecnologia impiegata per l estrazione, sono principalmente responsabili della sensazione di amaro e piccante e della resistenza dell olio all ossidazione (shelf life). Da tempo, in considerazione della rilevanza di tali sostanze, nei disciplinari degli oli a Denominazione di Origine Protetta (DOP) e a Indicazione Geografica Protetta (IGP), con i quali è possibile sfruttare il vantaggio competitivo legato all origine e alla specificità delle produzioni che possono essere garantite da un marchio europeo, è previsto un limite minimo per la quantità delle sostanze fenoliche. Purtroppo la mancanza, fino al 2009, di una metodica ufficiale standardizzata ha fatto sì che i limiti riportati nei disciplinari si riferiscano ad unità di misura diverse (mg/kg di acido caffeico, mg/kg di acido gallico, mg/kg di resorcina, ecc.) con la conseguente confusione nell accertamento del loro livello quantitativo. L esigenza di una metodica standardizzata è stata recepita dal gruppo degli esperti chimici del Consiglio Oleicolo Internazionale (COI) già dal 2006: due metodi, uno colorimetrico proposto dall Instituto de la Grasa di Siviglia (A. Cert, A. Romero, R. Cert Colorimetric method for the determination of o-diphenolic compound in olive oil ), l altro cromatografico proposto dalla Stazione Oli e Grassi di Milano (N. Cortesi, P. Rovellini, P. Fusari Dosaggio dei biofenoli degli oli vergini di oliva: idrossitirosolo e tirosolo, agliconi secoiridoidi, lignani e flavonoidi ), sono stati sottoposti a due verifiche circolari allo scopo di verificarne l affidabilità, ripetibilità e riproducibilità. Al termine di tali prove solo il metodo cromatografico ha mostrato il carattere di robustezza previsto per un metodo standardizzato ed è stato inserito nella norma Commerciale del COI come documento COI/T.20/Doc. No 29 Determinazione dei biofenoli degli oli di oliva mediante HPLC (Allegato A.) SOFISTICAZIONE DELL OLIO DI OLIVA EXTRA VERGINE CON L AGGIUNTA DI OLIO DEODORATO. 3
L olio deodorato si ottiene mediante una rimozione, in condizioni moderate di temperatura (80-120 C) e sottovuoto, delle sostanze volatili responsabili dell offflavor dell olio lampante. Tali condizioni blande non producono modificazioni facilmente rivelabili nella composizione chimica dell olio: parametri della regolamentazione comunitaria ed internazionale utilizzati per la ricerca dell olio rettificato nell olio di oliva vergine, quali l esame spettrofotometrico nell UV, la determinazione degli isomeri trans degli acidi grassi, la determinazione del contenuto di stigmastadieni, sono insufficienti a documentare l avvenuta sofisticazione dell olio di oliva vergine con olio deodorato. Alcuni ricercatori (A. Serani, D. Piacentini Sistema analitico per l identificazione di oli deodorati in oli vergini di oliva. Note 1,2,3 ) hanno prospettato soluzioni, incentrate sulla determinazione di pirofeofitine e digliceridi, per l individuazione dell olio deodorato negli oli vergini di oliva, ma la loro metodica, sottoposta a quattro verifiche circolari condotte dal 2001 al 2006 dalla Sottocommissione Tecnica Oli Vegetali della Stazione Oli e Grassi di Milano, non ha superato in maniera soddisfacente i test proposti. Nel 2006 A. Cert dell Instituto della Grasa di Siviglia suggerisce al gruppo degli esperti chimici del COI di dosare i metil ed etilesteri degli acidi grassi per valutare la presenza di particolari oli deodorati in oli extravergini di oliva, o alternativamente di attribuire a questi esteri un parametro di qualità dell olio. I suoi studi avevano infatti dimostrato che oli provenienti da olive che avevano subito una fermentazione possedevano discrete quantità di metil ed etilesteri di acidi grassi, sostanze che mantenevano il loro livello quantitativo iniziale anche dopo essere stati sottoposti alle condizioni normalmente utilizzate nei trattamenti di deodorazione. Nel 2008 C. Mariani e G. Bellan della Stazione Oli e Grassi di Milano propongono all attenzione del gruppo degli esperti chimici del COI un metodo per la determinazione degli alchil esteri negli oli di oliva che viene sottoposto a tre verifiche circolari dal 2008 al 2010. Al termine di tali prove il metodo, possedendo il carattere di robustezza previsto per un metodo standardizzato, è stato inserito nel novembre del 2010 nella Norma Commerciale del COI come documento COI/T.20/Doc. No 28 Determination of the content of waxes, fatty acid methyl esters and fatty acid ethyl esters by capillary gas chromatography. Nella stessa Norma al punto 4.9. viene previsto un criterio di qualità per gli oli extra vergini di oliva: 4
4.9. Metil ed etil esteri degli acidi grassi (FAME e FAEE) - ΣFAME + FAEE 75 mg/kg oppure - ΣFAME + FAEE > 75 mg/kg e 150 mg/kg e rapporto FAEE/FAME 1.5 Il metodo suddetto (Allegato B) ed i limiti proposti (Allegato C) per la categoria degli oli extra vergini di oliva sono stati quindi dibattuti in sede di Commissione UE, approvati e resi obbligatori in tutti gli Stati Membri a partire dal 1 aprile 2011 con il Regolamento (UE) N. 61/2011 della Commissione del 24 gennaio 2011, pubblicato sulla G.U. dell Unione Europea L. 23 del 27 gennaio 2011 (da considerare anche le rettifiche pubblicate sulla G.U. dell'unione Europea L. 48 del 23 febbraio 2011 ed L. 78 del 24 marzo 2011)" DIFFICOLTÀ OGGETTIVE NELL APPLICAZIONE DEL METODO DEL PANEL TEST PER LA VALUTAZIONE ORGANOLETTICA L attuale metodologia di valutazione delle caratteristiche organolettiche dell olio di oliva vergine (panel test) prevede l impiego di personale addestrato al riconoscimento olfattivo e mira esclusivamente a stabilire l appartenenza di un olio ad una delle categorie commerciali. Tuttavia, pur riconoscendo un ruolo di estrema rilevanza ai comitati di assaggio nella definizione della classificazione merceologica, il comparto oleario lamenta: i) tempi lunghi per la selezione dei campioni dovuti alla necessità di dover presentare un numero limitato di campioni per seduta di assaggio per non incorrere in valutazioni errate per stanchezza sensoriale degli assaggiatori; ii) alti costi per la formazione e il mantenimento della performance degli assaggiatori, il cui numero minimo è fissato in otto persone; iii) non continua disponibilità da parte dei membri del comitato, costituito generalmente da persone che svolgono altre attività in seno e/o al di fuori dell azienda; iv) una scarsa riproducibilità tra le valutazioni effettuate da diversi comitati di assaggio su medesimi campioni, riconducibile ad un training disomogeneo degli assaggiatori; v) la difficoltà applicativa 5
delle norme legislative inerenti all allegato XII del Reg. CEE 2568/91 e sue successive modifiche ed integrazioni, che prevede per la valutazione ufficiale, sia di prima che di seconda istanza, l'assaggio in duplicato del campione alla distanza di almeno un ora tra le prove, da effettuarsi entro i quattro mesi dalla data del prelievo. Da evidenziare, in conseguenza di ciò, la difficoltà a garantire la qualità del prodotto, come definita dal Reg. CEE 2565/91 e succ. modifiche, presente nel mercato nazionale ed estero e, quindi, la tutela del consumatore in considerazione del fatto che le altre analisi previste dal regolamento non mettono in evidenza la presenza di difetti organolettici. La già citata analisi degli alchilesteri (AE), determinazione analitica riproducibile ed affidabile, può essere di grande aiuto nel supportare la qualità di un olio extra vergine di oliva espressa mediante analisi sensoriale. E stato infatti rilevato da C. Mariani e G. Bellan della Stazione Oli e Grassi di Milano che oli extra vergini di elevata qualità non contengono praticamente AE, in altri casi sono presenti solo metilesteri (FAME) e piccolissime quantità di etilesteri (FAEE). Il totale degli AE comunque per gli oli extra vergini di oliva non supera mediamente i 30-40 mg/kg. E interessante notare che in casi sporadici campioni sicuri di oli extra vergini di oliva possono avere contenuti di AE che si avvicinano ai 100 mg/kg, in tutti questi casi però il rapporto FAEE/FAME ha valori molto bassi, di norma inferiori a 1. Infine si fa rilevare che gli AE non si formano durante la conservazione dell olio ma in seguito a processi di fermentazione subiti dalle olive dal momento della raccolta al processo estrattivo, gli stessi processi di fermentazione responsabili di difetti come quello di riscaldo o avvinato. Da queste considerazioni sono scaturiti i limiti proposti dalla Norma Commerciale del COI e dal Reg. N. 61/2011/UE per la categoria olio extra vergine di oliva. Il supporto analitico, fornito dall applicazione di tale metodologia, per una corretta valutazione della categoria merceologica degli oli di oliva extra vergini, favorirà l immissione sul mercato di produzioni agricole di media e piccola entità di buon livello qualitativo che attualmente devono confrontarsi con i prodotti della grande distribuzione, etichettati spesso impropriamente come extra vergini. 6
CONSIGLIO OLEICOLO INTERNAZIONALE COI/T.20/Doc. n. 29 Novembre 2009 ITALIANO Originale: ITALIANO Príncipe de Vergara, 154 28002 Madrid España Telef.: +34 915 903 638 Fax: +34 915 631 263 e-mail: iooc@internationaloliveoil.org http://www.internationaloliveoil.org/ DETERMINAZIONE DEI BIOFENOLI DEGLI OLI DI OLIVA MEDIANTE HPLC 1 OGGETTO La presente norma descrive un procedimento per l'estrazione ed il dosaggio dei composti minori polari di natura biofenolica (BMP) quali i derivati naturali e ossidati dell'oleuropeina e del ligstroside, i lignani, i flavonoidi e gli acidi fenolici presenti negli oli di oliva, utilizzando la tecnica HPLC. Il campo di misura va da 30 mg/kg a 800 mg/kg. AVVERTENZA: l'utilizzo della presente norma può richiedere l'impiego di apparecchiature e sostanze pericolose o l'esecuzione di operazioni che comportano un certo rischio. La presente norma internazionale non ha lo scopo di affrontare tutti i problemi di sicurezza connessi col suo impiego, perciò l'utilizzatore è responsabile della definizione di procedure di sicurezza e di igiene appropriate e del rispetto della legislazione vigente. 2 PRINCIPIO La metodica si basa su un'estrazione dei composti minori polari di natura biofenolica direttamente dall'olio di oliva mediante una soluzione metanolica e successiva determinazione quantitativa mediante HPLC con rivelatore UV a 280 nm. Lo standard interno è costituito da acido siringico. Il contenuto relativo ai derivati naturali e ossidati dell'oleuropeina e del ligstroside, dei lignani, dei flavonoidi e degli acidi fenolici viene espresso in mg/kg di tirosolo. 3 APPARECCHIATURA 3.1 Cromatografo liquido ad alta risoluzione (HPLC), a gradiente ternario, munito di colonna (4,6 mm x 25 cm) a fase inversa C18, del tipo Spherisorb ODS-2 5µm, 100 A, corredato di rivelatore spettrofotometrico UV a 280 nm e di integratore. Temperatura ambiente. La registrazione degli spettri per un tentativo di identificazione è facilitata dall'uso di un rivelatore di fotodiodi con range di acquisizione da 200 nm a 400 nm. 3.2 Matracci da 10 ml e 100 ml, classe A. 3.3 Pipetta da 100 µl, 1000 µl e 5000 µl. 3.4 Provette con tappo a vite, da 10 ml. 3.5 Agitatore per provette fn. 3.6 Bagno di estrazione a ultrasuoni. 3.7 Filtri a siringa 13 mm, tipo PVDF 0.45 µm.
COI/T. 20/Doc. n. 29 Pagina 2 3.8 Centrifuga in grado di assicurare una velocità di 5000 min -1. 3.9 Bilancia, in grado di garantire una accuratezza di ± 0,001 g. 3.10 Siringhe in plastica da 5 ml. 3.11 Normale vetreria da laboratorio. 4 REAGENTI I reagenti devono essere puri per analisi cromatografiche HPLC. 4.1 Acido orto-fosforico 85% (V/V). 4.2 Metanolo per cromatografia. 4.3 Acetonitrile per cromatografia. 4.4 Acqua per cromatografia. 4.5 Gradiente ternario lineare di eluizione: acqua 0,2 % H 3PO 4 (V/V) (A), metanolo (B), acetonitrile (C). I solventi di eluizione devono essere degassati. Lo sviluppo del gradiente deve avvenire secondo lo schema: Gradiente di eluizione Tempo Flusso A B C min ml/min % % % 0 1.00 96 2 2 40 1.00 50 25 25 45 1.00 40 30 30 60 1.00 0 50 50 70 1.00 0 50 50 72 1.00 96 2 2 82 1.00 96 2 2 4.6 2- (4 - Idrossifenil) etanolo (tirosolo) 98 %. 4.7 Acido 3,5 dimetossi 4-idrossi benzoico (acido siringico) 97 %. 4.8 Soluzione per l'estrazione: metanolo/acqua 80/20 (V/V). 4.9 Soluzione degli standard esterni di calibrazione (tirosolo e acido siringico). Pesare accuratamente 0,030 g di tirosolo (4.6) e 0,015 g di acido siringico (4.7) in un matraccio tarato da 10 ml (3.2). Diluire a volume con la soluzione di metanolo/acqua 80/20 (V/V) (4.8). Prelevare 100 µl (3.3) della soluzione e trasferirli in un matraccio tarato da 10 ml. Diluire a volume con la soluzione di metanolo/acqua 80/20 (V/V) (4.8). Le concentrazioni della soluzione di calibrazione esterna sono le seguenti: tirosolo 0,030 mg/ml, acido siringico 0,015 mg/ml. Tale soluzione è stabile per 3 mesi in frigorifero a + 4 C.
COI/T. 20/Doc. n. 2 Pagina 3 4.10 Preparazione della soluzione di standard interno (acido siringico). Pesare accuratamente 0,015 g di acido siringico (4.7) in un matraccio tarato da 10 ml e portare a volume con la soluzione di metanolo/acqua 80/20 (V/V) (4.8). Prelevare 1 ml (3.3) della soluzione e trasferirli in un matraccio tarato da 10 ml (3.2). Diluire a volume con la soluzione di metanolo/acqua 80/20 (V/V) (4.8). La concentrazione finale è di 0,015 mg/ml. Tale soluzione è stabile per 3 mesi in frigorifero a + 4 C. 5 PROCEDIMENTO 5.1 Preparazione del campione Pesare accuratamente 2,0 g di olio di oliva in una provetta con tappo a vite da 10 ml (3.4). Trasferire 1 ml della soluzione di standard interno (4.10) nel campione precedentemente pesato. Chiudere con tappo a vite e agitare (3.5) per 30 secondi esatti. Aggiungere 5 ml (3.3) della soluzione di estrazione costituita da metanolo/acqua 80/20 (V/V) (4.8). Agitare (3.5) per 1 minuto esatto. Estrarre in bagno a ultrasuoni (36) per 15 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 5000 giri/min per 25 minuti (3.8). Prelevare un'aliquota del surnatante e filtrare su siringa in plastica da 5 ml (3.10), con filtro in PVDF da 0,45 µm (3.7). 5.2 Analisi HPLC L'accensione dello spettrofotometro UV deve avvenire almeno 1 ora prima dell'analisi. La colonna cromatografica deve essere condizionata per almeno 15 minuti con il solvente di eluizione di composizione iniziale (acqua 0,2% H 3PO 4 (V/V)/metanolo/acetonitrile 96/2/2 (V/V/V)) (gradiente di eluizione). È necessario effettuare sempre una prima corsa cromatografica definita "gradiente a vuoto" (per essere sicuri che non ci siano picchi interferenti di coeluizione), iniettando 20 µl di metanolo/acqua 80/20 (V/V) nel sistema HPLC. Iniettare 20 µl della soluzione degli standard esterni di calibrazione (4.9), registrando il cromatogramma a 280 nm. Calcolare i valori dei fattori di risposta RF relativi a 1 µg di tirosolo e a 1 µg di acido siringico. Calcolare il rapporto tra il fattore di risposta dell'acido siringico rispetto al tirosolo, denominato RRF sir/tir. Registrare i valori in un apposito quaderno (6.2). Iniettare 20 µl della soluzione finale del campione nel sistema HPLC, registrando il cromatogramma a 280 nm. Eseguire due diverse determinazioni indipendenti sullo stesso campione e verificare che i risultati rientrino nei parametri di precisione del metodo. Nella figura 1 viene riportato un cromatogramma tipico dei biofenoli di un olio extra vergine di oliva caratterizzato per singolo componente. Per la valutazione del contenuto totale deve essere considerata la somma delle aree dei singoli picchi. A fine giornata far fluire sulla colonna cromatografica metanolo/acetonitrile 1/1 (V/V) a flusso di 1,0 ml/min per almeno 15 minuti e conservare la colonna in metanolo/acetonitrile 1/1 (V/V).
COI/T. 20/Doc. n. 29 Pagina 4 Figura 1 Cromatogramma HPLC registrato a 280 nm relativo ai biofenoli presenti in un olio extra vergine di oliva 6 ESPRESSIONE DEI RISULTATI 6.1 Calcolo dei fattori di risposta degli standard esterni di calibrazione (RF) RF 1µg (acido siringico) = Area acido siringico/µg iniettati acido siringico RF 1µg (tirosolo) = Area tirosolo/µg iniettati tirosolo 6.2 Calcolo del rapporto tra i due fattori di risposta (RRF) RRF sir/tir = RF 1 µg (acido siringico)/rf 1 µg (tirosolo) Il valore di RRF sir/tir deve essere costante e compreso nel range 5,1 ± 0,4. Tale valore permette di esprimere il risultato finale in tirosolo, utilizzando come standard interno l'acido siringico.
COI/T. 20/Doc. n. 2 Pagina 5 6.3 Calcolo del contenuto in biofenoli nell'olio vergine di oliva Il contenuto in biofenoli (derivati naturali e ossidati dell'oleuropeina e del ligstroside, lignani, flavonoidi e acidi fenolici), espresso in mg/kg, viene calcolato misurando la somma delle aree dei relativi picchi cromatografici (identificati nella tabella 1), secondo la formula che segue, esprimendo il risultato senza cifre decimali. (mg/kg) = (ΣA) 1000 RRF sir/tir (P ac. sir.) (A ac. sir.) (P) dove: (ΣA) è la somma delle aree dei picchi dei biofenoli (idrossitorosolo, tirosolo, derivati naturali e ossidati dell'oleuropeina e del ligstroside, lignani, flavonoidi e acidi fenolici) registrate a 280 nm; A ac. sir. è l'area dello standard interno dell'acido siringico registrata a 280 nm; 1000 è il fattore utilizzato per esprimere il risultato in mg/kg; P RRF sir/tir P ac. sir. è il peso in grammi di olio utilizzato; è il coefficiente di moltiplicazione utilizzato per esprimere i risultati finali in tirosolo; è il peso in milligrammi di acido siringico utilizzato come standard interno in 1 ml di soluzione aggiunta al campione.
COI/T. 20/Doc. n. 29 Pagina 6 Tabella 1 Identificazione dei picchi dei biofenoli Valori dei massimi di assorbimento (max UV abs) e dei tempi di ritenzione relativi (RRT)* N. picco Biofenoli RRT* Max UV abs. nm 1 Idrossitirosolo 0.62 230-280 2 Tirosolo 0.80 230-275 3 Acido vanillico 0.96 260 4 Acido caffeico 0.99 325 5 Acido siringico (standard Interno) 1.00 280 6 Vanillina 1.10 310 7 Acido p-coumarico 1.12 310 8 Idrossitirosilacetato 1.20 232-285 9 Acido ferulico 1.26 325 10 Acido orto-coumarico 1.31 325 11;11a Aglicone decarbossimetiloleuropeina, forma dialdeidica ossidata - 235-280 12 Aglicone decarbossimetiloleuropeina, forma dialdeidica 1.45 235-280 13 Oleuropeina 1.48 230-280 14 Aglicone oleuropeina forma dialdeidica 1.52 235-280 15 Tirosilacetato 1.54 230-280 16;16a Aglicone decarbossimetilligstroside forma dialdeidica ossidata 1.63 235-275 17 Aglicone decarbossimetilligstroside, forma dialdeidica 1.65 235-275 18 Pinoresinolo, 1 acetossipinoresinolo 1.69 232-280 19 Acido cinnamico 1.73 270 20 Aglicone ligstroside, forma dialdeidica 1.74 235-275 21;21a;21b Aglicone oleuropeina, forma aldeidica e idrossilica ossidata - 235-280 22 Luteolina 1.79 255-350 23 Aglicone oleuropeina, forma aldeidica e idrossilica 1.87 235-280 24;24a;24b Aglicone ligstroside, forma aldeidica e idrossilica ossidata - 235-275 25 Apigenina 1.98 230-270-340 26 Metil-luteolina - 255-350 27 Aglicone ligstroside, forma aldeidica e idrossilica 2.03 235-275 (*) Il valore del tempo di ritenzione relativo è calcolato rispetto al tempo di ritenzione dell'acido siringico. L'identificazione è stata eseguita per HPLC-MS. 7 RAPPORTO DI PROVA Nel rapporto di prova dovranno essere riportate le informazioni seguenti: (a) Il riferimento al presente metodo. (b) I risultati di prova espressi in mg/kg di olio (senza cifre decimali). (c) Il valore di RRF utilizzato per il calcolo. (d) Qualsiasi deviazione dalla presente norma risultante da un accordo tra le parti o da altre circostanze. (e) I dati di riconoscimento del laboratorio, la data di effettuazione della prova e la firma del responsabile.
COI/T. 20/Doc. n. 2 Pagina 7 MARGINI DI PRECISIONE 1. Analisi dei risultati della prova interlaboratorio I margini di precisione del metodo figurano nella tabella allegata. Nel 2008, 17 laboratori di 8 paesi riconosciuti dal COI hanno svolto una prova collettiva proposta dal Segretariato esecutivo. Campione A Olio extra vergine di oliva (Italia) Campione B Olio extra vergine di oliva (Spagna) Campione C Olio extra vergine di oliva (Tunisia) Campione D Olio extra vergine di oliva (Slovenia) Campione E Olio extra vergine di oliva (Grecia) Campione R Olio extra vergine di oliva (Italia) Il Segretariato esecutivo del COI ha condotto l'analisi statistica dei risultati della prova interlaboratorio secondo le regole definite dalla norma ISO 5725. Accuratezza (veridicità e precisione) dei metodi e dei risultati delle misurazioni L'analisi dei valori aberranti è stata condotta applicando il test di Cochran e il test di Grubbs sui risultati dei laboratori per tutte le determinazioni (a e b in duplicato). La tabella riporta: N Outlier Mean r Sr RSDr R metodo, diverse. S R RSD R Ho R Numero dei laboratori che hanno partecipato alla prova Numero di laboratori che presentano risultati aberranti Media dei risultati accettati Valore al di sotto del quale è situato, con una probabilità del 95%, il valore assoluto della differenza tra i risultati ottenuti nel corso di due prove individuali indipendenti condotte con lo stesso metodo, su campione identico, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore che usa la stessa apparecchiatura e in breve intervallo di tempo. Deviazione standard della ripetibilità Coefficiente di variazione della ripetibilità (Sr x 100 / mean) Valore al di sotto del quale è situato, con una probabilità del 95%, il valore assoluto della differenza tra i risultati ottenuti nel corso di due prove individuali, condotte con lo stesso su identico campione, in laboratori diversi, da operatori diversi che usano apparecchiature Deviazione standard della riproducibilità Coefficiente di variazione della riproducibilità (Sr x 100 / mean) è il valore di HORRAT per la riproducibilità, [RSD R effettivo/ RSD R teorico] = 2 ( 1-0.5logC ) e C è la concentrazione del composto espressa elevata alla decima (equazione di Horwitz).
COI/T. 20/Doc. n. 29 Pagina 8 Margini di previsione del contenuto totale dei biofenoli, (mg/1000 g) CAMPIONE CAMPIO NE CAMPIO NE CAMPION E CAMPIO NE CAMPIO NE A B C D E R mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg Mean 694 573 153 343 297 301 N 17 17 17 17 17 17 Outlier 3 3 1 2 2 2 non-outlier 14 14 16 15 15 15 numero 28 28 32 30 30 30 prove R 29 36 18 24 22 17 S r 10.4 12.7 6.4 8.7 7.7 6.2 RSD r 2 2 4 3 3 2 R 101 84 60 63 77 32 S R 36,0 29,9 21,3 22,4 27,5 11,5 RSD R 5 5 14 7 9 4 HO R 0.9 0.8 1.9 1.0 1.4 0.6 2. Bibliografia ISO 5725-1:1994 ISO 5725-2:1994 ISO 5725:5:1998 ISO 5725:6:1994 Accuratezza (veridicità e precisione) dei metodi e dei risultati delle misurazioni Parte 1: Principi generali e definizioni. Accuratezza (veridicità e precisione) dei metodi e dei risultati delle misurazioni Parte 2: Metodo di base per la determinazione della ripetibilità e riproducibilità di un metodo di prova normalizzato. Accuratezza (veridicità e precisione) dei metodi e dei risultati delle misurazioni Parte 5: Metodi alternativi per la determinazione della ripetibilità e riproducibilità di un metodo di prova normalizzato. Accuratezza (veridicità e precisione) dei metodi e dei risultati delle misurazioni Parte 6: Applicazione pratica dei valori di accuratezza
ALLEGATO XX METODO PER LA DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI CERE E METIL ED ETIL ESTERI DEGLI ACIDI GRASSI MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA CON COLONNA CAPILLARE 1. OGGETTO Il presente metodo permette di determinare il contenuto di cere e metil ed etil esteri degli acidi grassi negli oli di oliva. Le singole cere e gli alchil esteri sono separati in funzione del numero di atomi di carbonio. L impiego del metodo viene consigliato come mezzo atto a differenziare l olio di oliva dall olio di sansa di oliva e come parametro di qualità per gli oli extra vergini, in quanto permette di individuare false miscele di oli extra vergini di oliva e oli di bassa qualità e di capire se si tratta di oli vergini, lampanti o deodorati. 2. PRINCIPIO La sostanza grassa, addizionata di opportuni standard interni, viene frazionata mediante cromatografia su colonna di gel di silice idratato; la frazione eluita nelle condizioni di prova (con polarità minore di quella dei trigliceridi) viene recuperata e analizzata direttamente mediante gascromatografia in colonna capillare. 3. APPARECCHIATURA 3.1. Beuta da 25 ml. 3.2. Colonna in vetro per cromatografia liquida avente diametro interno di 15 mm e altezza da 30 a 40 cm con opportuno rubinetto. 3.3. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare, dotato di sistema di introduzione diretta in colonna costituito da: 3.3.1. Camera termostatica per le colonne con programmatore di temperatura 3.3.2. Iniettore a freddo per iniezione diretta in colonna 3.3.3. Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore 3.3.4. Registratore-integratore (Nota 1) idoneo per il funzionamento con il convertitoreamplificatore (3.3.3), con tempo di risposta non maggiore di 1 secondo e con velocità della carta variabile. Nota 1: È possibile utilizzare anche sistemi computerizzati che prevedono l acquisizione dei dati gascromatografici attraverso Personal Computer. 3.3.5. Colonna capillare di silice fusa (per analisi di cere e metil ed etil esteri), lunga da 8 a 12 m, diametro interno da 0,25 a 0,32 mm, internamente ricoperta con liquido di ripartizione (Nota 2) con spessore uniforme compreso fra 0,10 e 0,30 μm. Nota 2: Liquidi di ripartizione idonei allo scopo reperibili in commercio sono per es. il SE52, il SE54, ecc. 1
3.4. Microsiringa da 10 μl con ago cementato, idonea per iniezione diretta in colonna. 3.5. Vibratore elettrico 3.6. Evaporatore rotante 3.7. Muffola 3.8. Bilancia analitica in grado di garantire un accuratezza della misura di ± 0,1 mg 3.9. Normale vetreria da laboratorio 4. REAGENTI 4.1. Gel di silice con granulometria compresa tra 60 e 200 μm. Porre il gel di silice in muffola a 500 C per almeno 4 h. Dopo il raffreddamento addizionare il 2 % di acqua riferito alla quantità di gel di silice prelevata. Agitare bene allo scopo di omogeneizzare la massa e conservare nell essiccatore almeno per 12 h prima dell impiego. 4.1. n-esano per cromatografia o analisi dei residui (verificare la purezza). AVVERTENZA: i vapori possono incendiarsi. Tenere lontano da sorgenti di calore, scintille o fiamme libere. Tenere i contenitori ben chiusi. Usare con ventilazione adeguata. Evitare l accumulo di vapori ed eliminare ogni possibile causa di incendio, quali riscaldatori o apparecchi elettrici non antideflagranti. Nocivo per inalazione: può causare danni alle cellule del sistema nervoso. Evitare di respirare i vapori, usare se necessario un apparecchio respiratorio adatto. Evitare il contatto con gli occhi e la pelle. 4.2. Etere etilico, per cromatografia AVVERTENZA: prodotto altamente infiammabile. Moderatamente tossico. Irritante per la pelle. Nocivo per inalazione. Può causare danni agli occhi. Gli effetti possono essere differiti. Può formare perossidi esplosivi. I vapori possono incendiarsi. Tenere lontano da sorgenti di calore, scintille o fiamme libere. Tenere i contenitori ben chiusi. Usare con ventilazione adeguata. Evitare l accumulo di vapori ed eliminare ogni possibile causa di incendio, quali riscaldatori o apparecchi elettrici non antideflagranti. Non evaporare a secchezza o quasi-secchezza. L aggiunta di acqua o di un agente riducente appropriato può ridurre la formazione di perossidi. Non ingerire. Evitare di respirare i vapori. Evitare il contatto prolungato o ripetuto con la pelle. 4.4. n-eptano per cromatografia o Isottano AVVERTENZA: prodotto infiammabile. Nocivo per inalazione. Tenere lontano da sorgenti di calore, scintille o fiamme libere. Tenere i contenitori ben chiusi. Usare con ventilazione adeguata. Evitare di respirare i vapori. Evitare il contatto prolungato o ripetuto con la pelle. 2
4.5. Soluzione campione di lauril arachidato (Nota 3), allo 0,05 % (m/v) in eptano (standard interno per cere). Nota 3: È possibile utilizzare anche palmitil palmitato o miristil stearato o arachidil laurato. 4.6. Soluzione campione di metileptadecanoato, allo 0,02 % (m/v) in eptano (standard interno metil ed etil esteri). 4.7. Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftolo) 4.8. Gas vettore: idrogeno o elio puri per gascromatografia AVVERTENZA Idrogeno. Altamente infiammabile, sotto pressione. Tenere lontano da fonti di calore, scintille o fiamme libere o apparecchi elettrici non antideflagranti. Tenere sempre la valvola della bombola chiusa quando non si usa. Usare sempre un regolatore di pressione. Togliere la tensione alla molla del riduttore prima di aprire la valvola della bombola. Non sostare davanti al foro di uscita della bombola quando si apre la valvola. Usare con ventilazione adeguata. Non trasferire l idrogeno da una bombola a un altra. Non miscelare gas nella bombola. Tenere sempre ben assicurate le bombole affinché non possano cadere. Tenere le bombole lontane dal sole o da sorgenti di calore. Non tenere in ambienti corrosivi. Non usare bombole danneggiate o senza etichetta. Elio. Gas compresso sotto alta pressione. Riduce l ossigeno disponibile per la respirazione, tenere il contenitore chiuso. Usare con ventilazione adeguata. Non entrare nei locali di conservazione se non sono adeguatamente ventilati. Usare sempre un regolatore di pressione. Togliere la tensione alla molla del riduttore prima di aprire la valvola della bombola. Non trasferire il gas da una bombola a un altra. Tenere sempre ben assicurate le bombole affinché non possano cadere. Non sostare davanti al foro di uscita della bombola quando si apre la valvola. Tenere le bombole lontane dal sole o da sorgenti di calore. Non tenere in ambienti corrosivi. Non usare bombole danneggiate o senza etichetta. Non usare per inalazione e farne solo uso tecnico. 4.9. Gas ausiliari: idrogeno, puro per gascromatografia aria, pura per gascromatografia AVVERTENZA Aria. Gas compresso sotto alta pressione. Usare con cautela in presenza di sostanze combustibili in quanto la temperatura di autoaccensione della maggior parte dei composti organici nell aria si abbassa notevolmente ad alta pressione. Tenere sempre la valvola della bombola chiusa quando non si usa. Usare sempre un regolatore di pressione. Togliere la tensione alla molla del riduttore prima di aprire la valvola della bombola. Non 3
sostare davanti al foro di uscita della bombola quando si apre la valvola. Non trasferire il gas da una bombola a un altra. Non miscelare gas nella bombola. Tenere sempre ben assicurate le bombole affinché non possano cadere. Tenere le bombole lontane dal sole o da sorgenti di calore. Non tenere in ambienti corrosivi. Non usare bombole danneggiate o senza etichetta. Non usare per inalazione o per apparecchi respiratori l aria destinata a usi tecnici. 5. PROCEDIMENTO 5.1. Preparazione della colonna cromatografica Mettere in sospensione 15 g di gel di silice (4.1) in n-esano (4.2) e introdurla in colonna (3.2). A sedimentazione avvenuta completare l assestamento mediante l uso di un vibratore elettrico al fine di rendere più omogeneo il letto cromatografico. Percolare 30 ml di n-esano allo scopo di allontanare le eventuali impurezze. Pesare esattamente, nella beuta da 25 ml (3.1), circa 500 mg di campione con la bilancia analitica (3.8). Addizionare l opportuna quantità di campione di riferimento (4.5) in funzione del presunto contenuto di cere. Ad esempio aggiungere 0,1 mg di lauril arachidato nel caso di olio di oliva, da 0,25 a 0,50 mg nel caso di olio di sansa e 0,05 mg di metileptadecanoato per gli oli di oliva (4.6). Trasferire il campione così preparato nella colonna cromatografica aiutandosi con due porzioni da 2 ml ciascuna di n-esano (4.2). Lasciare fluire il solvente fino a un battente di 1 mm, quindi far percolare altro n- esano/etere etilico (99:1) e raccogliere 220 ml, rispettando un flusso di circa 15 gocce ogni 10 secondi. (Questa frazione contiene i metil ed etil esteri e le cere). (Nota 4) (Nota 5). Nota 4: La miscela n-esano/etere etilico (99:1) dovrà essere preparata ogni giorno. Nota 5: Onde controllare visivamente la corretta eluizione delle cere, è possibile aggiungere al campione in soluzione 100 μl di Sudan I all 1 % nella miscela di eluizione. Il colorante ha un tempo di ritenzione intermedio tra le cere e i trigliceridi, pertanto quando la colorazione raggiunge il fondo della colonna cromatografica bisogna sospendere l eluizione, in quanto tutte le cere sono state eluite. Evaporare la frazione così ottenuta mediante evaporatore rotante fino ad allontanamento quasi completo del solvente, eliminare gli ultimi 2 ml con l aiuto di un debole flusso di azoto e riprendere la frazione che contiene i metil ed etil esteri e che va diluita con 2-4 ml di n-eptano o isottano. 4
5.2. Analisi gascromatografica 5.2.1. Operazioni preliminari Installare nel gascromatografo (3.3) la colonna, collegando il terminale di ingresso connesso al sistema in colonna e il terminale di uscita al rilevatore. Eseguire i controlli generali del complesso gascromatografico (tenuta dei circuiti dei gas, efficienza del rivelatore e del sistema di registrazione, ecc.). Se la colonna è messa in uso per la prima volta è consigliabile procedere al suo condizionamento: far fluire un leggero flusso di gas attraverso la colonna quindi avviare il complesso gascromatografico e iniziare un riscaldamento graduale fino a raggiungere, dopo circa 4 h, la temperatura di 350 C. Mantenere tale temperatura per almeno 2 h, quindi portare il complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso del gas, accensione della fiamma, collegamento con il registratore elettronico (3.3.4), regolazione della temperatura della camera per colonna, del rivelatore, ecc.) e registrare il segnale a una sensibilità almeno due volte superiore a quella prevista per l esecuzione dell analisi. Il tracciato della linea di base deve risultare lineare, esente da picchi di qualsiasi natura e non deve presentare deriva. Una deriva rettilinea negativa indica imperfetta tenuta delle connessioni della colonna, una deriva positiva indica un insufficiente condizionamento della colonna. 5.2.2. Scelta delle condizioni operative per le cere ed i metil ed etil esteri (Nota 6) Le condizioni operative di massima sono le seguenti: Temperatura della colonna: 20 C/min 5 C/min inizio a 80 C (1 ) --------------- 140 C -------------- 335 C (20 ) Temperatura del rivelatore: 350 C. Quantità di sostanza iniettata: 1 μl della soluzione (2-4 ml) di n-eptano. Gas vettore: elio o idrogeno alla velocità lineare ottimale per il gas prescelto (vedere Appendice A) Sensibilità strumentale: idonea a soddisfare le condizioni di cui sopra. Nota 6: Vista l elevata temperatura finale è ammessa una deriva positiva che non deve superare il 10 % del fondo scala. Tali condizioni possono essere modificate in funzione delle caratteristiche della colonna e del gascromatografo in modo da avere una separazione di tutte le cere e dei metil ed etil esteri degli acidi grassi e una risoluzione soddisfacente dei picchi (vedi figure 2, 3 e 4) e 5
un tempo di ritenzione dello standard interno del lauril arachidato di 18 ± 3 minuti. Il picco delle cere più rappresentativo deve superare di oltre il 60 % il fondo scala, mentre lo standard interno del metileptadecanoato dei metil ed etil esteri deve raggiungere il valore del fondo scala. I parametri di integrazione dei picchi dovranno essere impostati in modo da ottenere una corretta valutazione delle aree dei picchi presi in considerazione. 5.3. Esecuzione dell analisi Con la microsiringa da 10 μl si prelevano 1 μl di soluzione; si alza lo stantuffo della siringa in modo che l ago sia vuoto. Si introduce l ago attraverso il dispositivo di iniezione e dopo 1-2 secondi si inietta rapidamente e si estrae quindi lentamente l ago dopo circa 5 secondi. Si effettua la registrazione fino a completa eluizione delle cere e degli stigmastadieni a seconda della frazione che viene analizzata. La linea di base deve essere sempre corrispondente ai requisiti richiesti. 5.4. Identificazione dei picchi L identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di ritenzione e per paragone con miscele di cere a tempi di ritenzione noti, analizzate nelle medesime condizioni. Per gli alchil esteri l identificazione viene effettuata mediante miscele di metil ed etil esteri dei principali acidi grassi degli oli di oliva (palmitico e oleico). Nella figura 1 è riportato un cromatogramma delle cere presenti in un olio di oliva vergine. Nelle figure 2 e 3 sono riportati i cromatogrammi di due oli extra vergini di oliva del commercio, uno con metil ed etil esteri e un altro senza. Nella figura 4 vengono riportati i cromatogrammi relativi a un olio extra vergine di ottima qualità e dello stesso olio addizionato del 20 % di olio deodorato. 5.5. Valutazione quantitativa delle cere Si procede al calcolo delle aree dei picchi corrispondente allo standard interno del lauril arachidato e agli esteri alifatici da C 40 a C 46 mediante un integratore. Si calcola il contenuto totale in cere aggiungendo ogni singola cera, in mg/kg di sostanza grassa, come segue: dove: Cere, mg/kg = (ΣΑ x ) m s 1000 A s m A x = area del picco del singolo estere, in unità di calcolo dell integratore 6
A s = area del picco dello standard interno del lauril arachidato, in unità di calcolo dell integratore m s = massa di standard interno del lauril arachidato aggiunto, in milligrammi m = massa di campione prelevato per la determinazione, in grammi 5.6. Valutazione quantitativa dei metil ed etil esteri Si procede al calcolo delle aree dei picchi corrispondenti allo standard interno del metileptadecanoato, ai metil esteri degli acidi grassi a C 16 e C 18 e agli etil esteri degli acidi grassi C 16 e C 18 mediante un integratore. Si calcola il contenuto di ogni singolo alchil estere, in mg/kg di sostanza grassa, come segue: dove: Estere, mg/kg = Α x m s 1000 A s m A x = area del picco del singolo estere C 16 e C 18, in unità di calcolo dell integratore A s = area del picco dello standard interno del metileptadecanoato, in unità di calcolo dell integratore m s = massa di standard interno del metileptadecanoato aggiunto, in milligrammi m = massa di campione prelevato per la determinazione, in grammi 6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI Riportare la somma dei contenuti delle singole cere da C 40 a C 46 (Nota 7) in milligrammi per chilogrammo di sostanza grassa. Riportare la somma dei singoli contenuti dei metil ed etil esteri da C 16 a C 18 e la loro somma. I risultati vengono espressi arrotondando al più vicino mg/kg. Nota 7: I componenti da quantificare si riferiscono ai picchi a numero di carbonio pari compresi tra gli esteri C 40 e C 46, secondo l esempio di cromatogramma delle cere dell olio di oliva riportato nella figura allegata. Qualora l estere C 46 risulti sdoppiato, si consiglia, ai fini della sua corretta identificazione, di analizzare la frazione cerosa di un olio di sansa dove il picco C 46 risulta individuabile in quanto nettamente maggioritario. Riportare il rapporto tra etil esteri e metil esteri 7
Figura 1 Esempio di cromatogramma della frazione cere di un olio di oliva (*) Picchi con un tempo di ritenzione da 5 a 8 minuti dei metil ed etil esteri degli acidi grassi Legenda: Standard interno = lauril arachidato 1 = Esteri diterpenici 2+2 = Esteri C 40 3+3 = Esteri C 42 4+4 = Esteri C 44 5 = Esteri C 46 6 = Esteri steroli e alcoli triterpenici (*) Dopo l eluizione degli esteri degli steroli il cromatogramma non deve presentare picchi significativi (trigliceridi) 8
Figura 2 Metile ed etil esteri e cere di un olio vergine di oliva Legenda: 1. Metile C 16 2. Etile C 16 3. Standard interno metileptadecanoato 4. Metile C 18 5. Etile C 18 6. Squalene 7. Standard interno lauril arachidato A Esteri diterpenici B Cere C Esteri steroli e alcoli triterpenici 9
Figura 3 Metile ed etil esteri e cere di un olio extra vergine di oliva Legenda: 1. Standard interno metileptadecanoato 2. Metile C 18 3. Etile C 18 4. Squalene 5. Standard interno lauril arachidato A Esteri diterpenici B Cere C Esteri steroli e alcoli triterpenici 10
Figura 4 Parte di cromatogramma relativa a un olio extra vergine di oliva e allo stesso olio addizionato di olio deodorato Legenda: 1. Standard interno metil miristato 2. Metil palmitato 3. Etil palmitato 4. Standard interno metileptadecanoato 5. Metil linoleato 6. Metil oleato 7. Metil stearato 8. Etil linoleato 9. Etil oleato 10. Etil stearato 11
APPENDICE A Determinazione della velocità lineare dei gas Nel cromatografo, regolato alle normali condizioni operative, si iniettano 1:3 μl di metano (o propano) e si cronometra il tempo che il gas impiega a percorrere la colonna, dal momento dell iniezione al momento dell uscita del picco (tm). La velocità lineare in cm/s è data da L/tM in cui L è la lunghezza della colonna in centimetri e tm è il tempo cronometrato in secondi. 12
CARATTERISTICHE DEGLI OLI DI OLIVA - ALLEGATO I DEL REGOLAMENTO N. 2568/91/CEE MODIFICATO DA ULTIMO DAL REG. N. 61/2011/UE CATEGORIA 1. Olio extra vergine di oliva 2. Olio di oliva vergine 3. Olio di oliva lampante 4. Olio di oliva raffinato 5. Olio di oliva composto di oli di oliva raffinati e di oli di oliva vergini 6. Olio di sansa di oliva greggio 7. Olio di sansa di oliva raffinato 8. Olio di sansa di oliva Metil esteri degliacidi grassi (MEAG) ed etil esteri degli acidi grassi (EEAG) MEAG+EEAG 75m g/kg o MEAG + EEAG 150mg/Kg e (EEAG/MEAG) 1.5 Acidità (*) Numero dei perossidi meqo 2 /Kg (*) Cere mg/kg (**) 0.8 20 250 2.0 20 250 2.0 -- 300 ( 3 ) 0.3 5 350 1.0 15 350 -- -- > 350 ( 4 ) 2-gliceril monopalmitato 0.9 se % acido palmitico totale 14 % 1.0 se % acido palmitico totale > 14 % 0.9 se % acido palmitico totale 14 % 1.0 se % acido palmitico totale > 14 % 0.9 se % acido palmitico totale 14 % 1.1 se % acido palmitico totale > 14 % 0.9 se % acido palmitico totale 14 % 1.1 se % acido palmitico totale > 14 % 0.9 se % acido palmitico Totale 14 % 1.0 se % acido palmitico totale > 14 % Stigmasta dieni mg/kg ( 1 ) Differenza ECN42 HPLC e ECN 42 calcolo teorico K 232 (*) K 270 (*) Delta-K (*) Valutazione organolettica Mediana del difetto (Md) (*) Valutazione organolettica Mediana del fruttato (Mf) (*) 0.10 0.2 2.50 0.22 0.01 Md = 0 Mf > 0 0.10 0.2 2.60 0.25 0.01 Md 3.5 Mf > 0 0.50 0.3 -- -- -- Md >3.5 ( 2 ) -- -- 0.3 -- 1.10 0.16 -- -- -- 0.3 -- 0.90 0.15 -- -- 1.4 -- 0.6 -- -- -- -- -- 0.3 5 >350 1.4 -- 0.5 -- 2.00 0.20 -- -- 1.0 15 350 1.4 -- 0.5 -- 1.70 0.18 -- -- (1) Somma degli isomeri che potrebbero (o meno) essere separati mediante colonna capillare. (2) O quando la mediana del difetto è inferiore o uguale a 3.5 e la mediana del fruttato è uguale a 0. (3) Gli oli con un tenore in cere compreso tra 300 mg/kg e 350 mg/kg sono considerati olio di oliva lampante se gli alcoli alifatici totali sono pari o inferiori a 350 mg/kg o se la percentuale di eritrodiolo ed uvaolo è pari o inferiore a 3.5%. (4) Gli oli con un tenore in cere compreso tra 300 mg/kg e 350 mg/kg sono considerati olio di sansa di oliva greggio se gli alcoli alifatici totali sono superiori a 350 mg/kg e se la percentuale di eritrodiolo e uvaolo è superiore a 3.5%.
CARATTERISTICHE DEGLI OLI DI OLIVA - ALLEGATO I DEL REGOLAMENTO N. 2568/91/CEE MODIFICATO DA ULTIMO DAL REG. N. 61/2011/UE CATEGORIA 1. Olio extra vergine di oliva Miristico Linolenico Composizione acidica ( 1 ) Arachico Eicosenoico Beenico Lignocerico Somma degli isomeri transoleici Somma degli isomeri translino leici + translino lenici Colesterolo Brassicasterolo Composizione in steroli Campesterolo Stigmasterolo Betasitosterolo ( 2 ) Delta-7- Stigmastenolo Steroli totali mg/kg 0.05 1.0 0.6 0.4 0.2 0.2 0.05 0.05 0.5 0.1 4.0 Camp 93.0 0.5 1000 4.5 2. Olio di oliva vergine 0.05 1.0 0.6 0.4 0.2 0.2 0.05 0.05 0.5 0.1 4.0 Camp 93.0 0.5 1000 4.5 3. Olio di oliva lampante Eritrodiolo e Uvaolo (**) 0.05 1.0 0.6 0.4 0.2 0.2 0.10 0.10 0.5 0.1 4.0 -- 93.0 0.5 1000 4.5 ( 3 ) 4. Olio di oliva raffinato 0.05 1.0 0.6 0.4 0.2 0.2 0.20 0.30 0.5 0.1 4.0 Camp 93.0 0.5 1000 4.5 5. Olio di oliva composto di oli di oliva raffinati e di oli di oliva vergini 6. Olio di sansa di oliva greggio 7. Olio di sansa di oliva raffinato 0.05 1.0 0.6 0.4 0.2 0.2 0.20 0.30 0.5 0.1 4.0 Camp 93.0 0.5 1000 4.5 0.05 1.0 0.6 0.4 0.3 0.2 0.20 0.10 0.5 0.2 4.0 -- 93.0 0.5 2500 4.5 ( 4 ) 0.05 1.0 0.6 0.4 0.3 0.2 0.40 0.35 0.5 0.2 4.0 Camp 93.0 0.5 1800 4.5 8. Olio di sansa di oliva 0.05 1.0 0.6 0.4 0.3 0.2 0.40 0.35 0.5 0.2 4.0 Camp 93.0 0.5 1600 4.5 (1) Tenore di altri acidi grassi : palmitico: 7,5-20,0; palmitoleico: 0,3-3,5; eptadecanoico: 0,3; eptadecenoico: 0,3; stearico: 0,5-5,0; oleico: 55,0-83,0; linoleico: 3,5-21,0. (2) Somma di: delta-5,23-stigmastadienolo + clerosterolo + beta-sitosterolo + sitostanolo + delta-5-avenasterolo + delta-5,24-stigmastadienolo. (3) Gli oli con un tenore in cere compreso tra 300 mg/kg e 350 mg/kg sono considerati olio di oliva lampante se gli alcoli alifatici totali sono pari o inferiori a 350 mg/kg o se la percentuale di eritrodiolo ed uvaolo Ä pari o inferiore a 3.5. (4) Gli oli con un tenore in cere compreso tra 300 mg/kg e 350 mg/kg sono considerati olio di sansa di oliva greggio se gli alcoli alifatici totali sono superiori a 350 mg/kg e se la percentuale di eritrodiolo e uvaolo Ä superiore a 3.5. Note: a) I risultati delle analisi devono essere espressi con un numero di decimali uguale a quello previsto per ogni caratteristica. L ultima cifra deve essere aumentata di una unitç se la cifra successiva Ä superiore a 4. b) E sufficiente che una sola caratteristica non sia conforme ai valori indicati perché l olio venga cambiato di categoria o dichiarato non conforme riguardo la sua purezza. c) Le caratteristiche contrassegnate con (*) e riguardanti la qualitç dell olio implicano che: - per l olio di oliva lampante, i corrispondenti valori limite possono non essere rispettati simultaneamente, - per gli oli di oliva vergini, l inosservanza di almeno uno di questi valori limite comporta il cambiamento di categoria, pur rimanendo classificati in una delle categorie degli oli di oliva vergini. d) Le caratteristiche contrassegnate con (**) implicano che per tutti gli oli di sansa di oliva i corrispondenti valori limite possono non essere rispettati simultaneamente