KIT Le forme invisibili La cristallizzazione del lisozima
MATERIALE NEL KIT - 3 provette da 1,5 ml contenenti la proteina del lisozima purificata (da conservare in freezer) - 6 piastre multiwell - una scatola contenente vetrini copri oggetti - una scatola contenente vetrini porta oggetti - soluzioni per ottenere il cristallo (acqua distillata, NaCl 20%, tampone sodio acetato 1M ph4.6) - 3 micropipette da 20 microlitri - 3 micropipette da 200 microlitri - 3 micropipette da 1000 microlitri - 3 scatole di puntali per micropipette (per micropipette da 20-200 microlitri) - 3 scatole di puntali per micropipette da 20 microlitri e per micropipette da 1000 microlitri
MATERIALE NECESSARIO A SCUOLA - laboratorio o aula con tavoli/banconi - aula informatica - microscopi ottici con obiettivi 4x e10x - videoproiettore - contenitori per rifiuti - pennarelli TEMPO RICHIESTO circa 1,5-2 ore
Allestimento del materiale Disporre sul banco da lavoro il materiale in modo che gli studenti lavorino in tre gruppi. Ogni postazione deve essere così costituita: 2 piaster multiwell 1 vetrino coprioggetti per studente 1 micropipetta da 20 microlitri 1 micropipetta da 200 microlitri 1 micropipetta da 1000 microlitri 1 provette contenente il lisozima 1 falcon per ogni soluzione microscopi ottici o stereomicroscopi inoltre sul banco di lavoro dovranno essere presenti un contenitore dei rifiuti, una scatola di puntali per tipo e pennarelli
Procedimento Uso micropipetta Illustrare la portata massima di e minima delle micropipetta; oltre questi valori la micropipetta si rompe Mostrare ai ragazzi come si imposta il volume girando la rotella in alto, se si ruota verso sinistra il volume aumenta, al contrario se si ruota a destra il volume diminuisce. Impostare lo strumento su i microlitri necessari, stando molto attenti al decimale dopo la virgola Mostrare ai ragazzi come si inserisce il puntale sulla punta della micropipetta semplicemente appoggiando lo strumento sul puntale e facendo una leggera pressione Spiegare come si preleva un volume. Fare una leggera pressione sulla rotella usata per l impostazione del volume fino a quando non si percepisce una resistenza, mantenendo abbassata la rotella inserire la punta del puntale dentro il volume da prelevare ( per esempio si può usare la provetta contenente acqua) e a questo punto lasciare andare il dito accompagnando la rotella verso l alto. Espellere il puntale nel contenitore dei rifiuti usando l apposito pulsante situato in alto sullo strumento
LE FASI DELLA ATTIVITA Ogni studente pipetterà all interno del singolo pozzetto una soluzione di cristallizzazione così composta: 250 microlitri di acqua; 225 microlitri di NaCl 20%; 25 microlitri di tampone sodio acetato 1M ph4.6 Risospendere la soluzione con il puntale Prendere un vetrino coprioggetti e disegnare un cerchio al centro con il pennarello Prelevare 2 microlitri di soluzione di cristallizzazione dal pozzetto e metterli al centro del cerchio colorato Prelevare 2 microlitri di lisozima (precedentemente estratto dal freezer e risospeso accuratamente picchiettando sul fondo della provetta) e metterlo al centro del vetrino coprioggetto all interno della goccia appena depositata Capovolgere il vetrino mantenendo la goccia pendente al centro Coprire la piastra di cristallizzazione con il coperchio trasparente per prevenire l evaporazione della goccia e per garantire il corretto raggiungimento dell equilibrio di vapore necessario per la cristallizzazione della proteina Attendere circa 30 minuti; aprire la piastra e prelevare il coprioggetti girandolo; posizionare il coprioggetti sul portaoggetti mantenendo la goccia rivolta verso l alto senza schiacciarla tra i due vetrini Osservare al microscopio al 4x e 10x
Ingrandimento 10x
Biocristallografia La cristallografia a raggi X è una tecnica che consente di determinare la posizione degli atomi delle molecole che compongono un cristallo sulla base del modo con cui i raggi X vengono diffratti dal cristallo stesso. In particolare, la cristallografia a raggi X misura la densità elettronica cioè come gli elettroni (e, conseguentemente, gli atomi) sono distribuiti nello spazio del cristallo Scopo: determinazione della struttura 3D di macromolecole biologiche a risoluzione atomica Oggetto: sistema reale DNA, RNA, proteine, e loro complessi (virus, ribosoma, ) Le proteine più piccole hanno anche più di 1000 atomi mentre le più grandi possono avere fra 10000 e 100000 atomi
Applicazioni della Biocristallografia le strutture 3D delle macromolecole biologiche permettono di capire come avvengono i processi biologici e le interazioni a livello atomico (cioè come una particolare macromolecola esegue la sua funzione) interazioni macromolecola- macromolecola interazioni macromolecola - piccola molecola (substrato, cofattore, inibitore, ione ) progettazione razionale di farmaci relazione struttura- funzione negli enzimi applicazioni biotecnologiche
Perché i cristalli? molecola unità di cella unità asimmetrica simmetria cristallografica cristallo
Perché i raggi X? la lunghezza d onda dei raggi X è di circa 1 Å, che è dell ordine di grandezza delle distanze interatomiche e permette quindi di identificare la posizione dei singoli atomi.
La cristallografia a raggi X richiede un cristallo per amplificare il segnale di diffrazione (1015-1016 molecole identiche)
Costruzione del modello molecolare